李 娟,黃玉婷,段 彥,馬 源,楊紫怡,嚴(yán)建業(yè),李順祥*

1湖南中醫(yī)藥大學(xué);2湖南省中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心;3湖南省中美老年性退行性疾病治療藥物國際聯(lián)合研究中心,長(zhǎng)沙 410208

APG IV系統(tǒng)是由被子植物系統(tǒng)發(fā)育研究組(angiosperm phylogeny group,APG)建立的被子植物分類系統(tǒng)的第四版,該分類系統(tǒng)認(rèn)為菖蒲目(Acorales)屬于中生被子植物中的單子葉植物分支,是單子葉植物的最基部類群,Acorales下僅有一科(菖蒲科Acoraceae)一屬(菖蒲屬Acorus),常見植物有菖蒲(AcoruscalamusL.)和石菖蒲(AcorustatarinowiiSchott)[1]。2020版《中國藥典》收載的菖蒲屬藥材有石菖蒲(Acori Tatarinowii Rhizome)和藏菖蒲(Acori Calami Rhizome)[2],藏菖蒲是因藏藥習(xí)用而得名,其基原植物分別為石菖蒲(A.tatarinowiiSchott)和菖蒲(A.calamusL.)。現(xiàn)代藥學(xué)研究證明,菖蒲屬中藥具有較好的改善學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知能力的作用[3-6]。近年來,除揮發(fā)油、β-細(xì)辛醚、倍半萜等活性較明顯的成分外[7-9],還從菖蒲屬中藥中發(fā)現(xiàn)了活性較好的生物堿類成分,Lao等[10]從石菖蒲中分離得到菖蒲堿甲(tatarine A)、菖蒲堿乙和菖蒲堿丙,其中,含此3個(gè)成分的石菖蒲乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物能顯著改善東莨菪堿所致記憶障礙模型小鼠的記憶障礙;Li等[11]從菖蒲中分離得到菖蒲堿甲和菖蒲新堿(neo-tatarine),這兩個(gè)生物堿對(duì)受損神經(jīng)細(xì)胞具有良好的保護(hù)作用。

菖蒲新堿是一種結(jié)構(gòu)新穎的環(huán)庚三烯酮異喹啉生物堿(tropoloisoquinoline alkaloid,簡(jiǎn)稱TA),化學(xué)名6-羥基-5,8-二甲氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]異喹啉-7-酮(6-hydroxy-5,8-dimethoxy-7H-azuleno[1,2,3-i,j]isoquinolin-7-one),其基本母核為7H-薁[1,2,3-i,j]異喹啉-7-酮(7H-azuleno[1,2,3-i,j]isoquinolin-7-one,簡(jiǎn)稱7H-AI7O,骨架見圖1)[11],菖蒲新堿是目前從自然界中發(fā)現(xiàn)的唯一具有7H-AI7O結(jié)構(gòu)母核的化合物,但菖蒲新堿在植物中的量極少,從10 kg植物菖蒲的干燥根莖中僅分離得到5 mg。因此,鑒于7H-AI7O類成分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和生物活性,本文以菖蒲新堿為對(duì)照品,以7H-AI7O類成分為監(jiān)測(cè)對(duì)象,采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF/MS2)聯(lián)用技術(shù),快速監(jiān)測(cè)和鑒定菖蒲屬中藥7H-AI7O類成分的組成和分布,為進(jìn)一步豐富該類成分的植物來源和相關(guān)藥物的研發(fā),提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖1 7H-AI7O的結(jié)構(gòu)骨架Fig.1 Structural skeleton of 7H-AI7O

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2020年和2021年的11月份在西藏、安徽、湖南等地,共采集10批菖蒲屬植物(見表1),由湖南中醫(yī)藥大學(xué)王智副教授鑒定為菖蒲科植物石菖蒲AcorustatarinowiiSchott和菖蒲AcoruscalamusL.,取石菖蒲和菖蒲根莖,除去須根和泥沙,洗凈,陰干,得到石菖蒲和藏菖蒲藥材。標(biāo)本保存于湖南中醫(yī)藥大學(xué)湖南省中藥活性物質(zhì)篩選工程技術(shù)研究中心。

表1 菖蒲屬藥材的采集信息

試劑:薄層色譜用硅膠(青島海洋化工集團(tuán)公司),柱色譜硅膠(300～400目,青島海洋化工集團(tuán)公司),乙醇、甲醇、石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯、丙酮和硫酸等試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀(美國Waters公司);Xevo G2-XS Q-TOF/MS四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國Waters公司);BSA 124S-CW分析天平(深圳市華恒儀器有限公司);Heraeus Pico 17高速離心機(jī)(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 石菖蒲和藏菖蒲藥材中7H-AI7O類成分的富集

菖蒲屬藥材干品粉碎成粗粉,取100 g置2000 mL圓底燒瓶中,加乙醇回流提取2次,每次提取1.5 h,加10倍藥材量溶劑,過濾,合并提取液,50 ℃減壓濃縮至無醇味,提取物繼續(xù)加水50 mL使懸浮,轉(zhuǎn)移至分液漏斗,依次用石油醚(60～90 ℃)和乙酸乙酯萃取5次,每次100 mL,合并乙酸乙酯萃取液,50℃減壓濃縮至干,加適量乙醇溶解,上硅膠柱色譜(Φ 3.0 cm × 50.0 cm)分離,依次用不同梯度的石油醚-丙酮(6∶1,3∶1和1∶1)和甲醇洗脫,每個(gè)梯度的溶劑用量為2倍柱體積,流速3 mL/min,洗脫液接樣50 mL/瓶,以菖蒲新堿為對(duì)照品,采用薄層層析法(TLC),吸取各洗脫樣品20 μL,分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上,以石油醚-丙酮(5∶4)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(365 nm)下檢識(shí),與菖蒲新堿對(duì)照品斑點(diǎn)比較,確定各批次含7H-AI7O類成分的洗脫餾分并合并,50 ℃減壓濃縮至干,即得菖蒲屬中藥7H-AI7O類成分的富集部位。

1.3.2 菖蒲新堿對(duì)照品溶液的制備

精密稱取菖蒲新堿2.0 mg,置10mL容量瓶,加三氯甲烷-甲醇(1∶1)溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密移取1 mL置10 mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得,作為TLC用對(duì)照品溶液。取TLC用對(duì)照品溶液,加甲醇稀釋制成濃度為20 ng/mL,離心(5 000 r/min)5 min,取上清液,作為UPLC-Q-TOF/MS2檢測(cè)用對(duì)照品溶液。

1.3.3 UPLC-Q-TOF/MS2檢測(cè)用供試品溶液的制備

稱取“1.3.1”制備的不同產(chǎn)地菖蒲屬中藥7H-AI7O類成分的富集部位各5 mg,加甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中,搖勻,離心(5 000 r/min)5 min,取上清液,備用。

1.3.4 UPLC-Q-TOF/MS2的檢測(cè)方法

液相色譜條件:ACQUITY UPLC-BEH C18色譜柱(2.1 mm × 50 mm,1.7 μm),流動(dòng)相0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),洗脫程序0～3 min,10%→15% B;3～20 min,15%→30% B;20～40 min,30%→55% B;40～55 min,55%→80% B;55～60 min,80%→10% B,流速0.3 mL/min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜條件:應(yīng)用電噴霧正離子模式進(jìn)行檢測(cè),掃描方式為MRE掃描,使用ESI-L Low Concentration Tuning Mix(G1969-8500)對(duì)準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行矯正。一級(jí)全掃質(zhì)量掃描范圍為m/z100～1 200,分辨率為30 000,除溶劑氣體為氮?dú)?干燥氣流速為6.8 L/min;毛細(xì)管電壓為4.0 kV;Fragment電壓為110 V;鞘氣溫度為350 ℃;二級(jí)質(zhì)譜使用依賴性掃描,在一級(jí)掃描基礎(chǔ)之上選擇前三強(qiáng)進(jìn)行誘導(dǎo)碰撞解離獲取其二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

以菖蒲新堿的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜裂解途徑為參比,結(jié)合目標(biāo)生物堿保留時(shí)間、一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜裂解信息,比較分析不同產(chǎn)地石菖蒲和藏菖蒲藥材中存在的7H-AI7O類成分。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 菖蒲屬中藥7H-AI7O類成分富集部位的確定

菖蒲屬中藥中7H-AI7O類成分含量較低,分析前需富集7H-AI7O類成分獲得富集部位。不同批次石菖蒲和藏菖蒲藥材經(jīng)溶劑提取、溶劑萃取和硅膠柱色譜分離,以菖蒲新堿為對(duì)照,經(jīng)TLC定性分析,僅在藏菖蒲S2批、S4批和S5批,石菖蒲S6批的洗脫餾分中檢測(cè)到7H-AI7O類成分(TLC色譜圖中呈深紅色班點(diǎn)),分別將這4批藥材中具有紅色斑點(diǎn)的洗脫餾分合并,S2批合并1～45餾分、S4批合并11～38餾分、S5批合并9～19餾份、S6批合并13～18餾分,再進(jìn)行UPLC-Q-TOF/MS2檢測(cè)和分析。

2.2 UPLC-Q-TOF/MS2檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 菖蒲新堿對(duì)照品的質(zhì)譜裂解途徑分析

UPLC-Q-TOF/MS2監(jiān)測(cè)菖蒲屬中藥中7H-AI7O類成分,采用正離子模式,一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜可清晰觀察到7H-AI7O類成分的準(zhǔn)分子離子峰和相關(guān)碎片峰,而負(fù)離子模式下基本不能觀察到相關(guān)裂解的碎片峰。

正離子模式下,菖蒲新堿的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z308.092 6,根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜(見圖2B),推測(cè)其裂解途徑為m/z308.092 6先丟失1分子CO生成m/z280.097 1碎片離子,碎片m/z280.097 1的8位甲氧基和6位羥基依次丟失CH3和H自由基產(chǎn)生m/z265.072 5和264.065 9的碎片離子,碎片264.065 9繼續(xù)丟失1個(gè)CO分子得到m/z236.071 0碎片離子。根據(jù)裂解途徑分析,7H-AI7O母核C-7位易丟失一個(gè)中性CO分子,再在C-8位甲氧基丟失1個(gè)CH3自由基,C-6位羥基丟失1個(gè)H自由基,結(jié)構(gòu)發(fā)生電子重排,生成C-6和C-7位羰基取代的熒蒽生物堿(azafluoranthene alkaloid,AA)結(jié)構(gòu),繼續(xù)丟失一個(gè)CO分子,詳見質(zhì)譜裂解途徑(見圖2C)。

圖2 正離子模式下菖蒲新堿的一級(jí)質(zhì)譜圖(A)、二級(jí)質(zhì)譜圖(B)和可能的裂解途徑(C)Fig.2 Primary mass spectrometry (A),secondary mass spectrometry (B),and possible fragmentation pathways (C) of neo-tatarine in positive ion mode

2.2.2 不同產(chǎn)地菖蒲屬中藥7H-AI7O類成分的分析

根據(jù)菖蒲新堿對(duì)照品的一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜的裂解途徑比對(duì)和目標(biāo)化合物裂解規(guī)律分析,藏菖蒲S2批、S4批和S5批和石菖蒲S6批檢測(cè)的7H-AI7O類成分的富集部位中,產(chǎn)自湖南瀏陽市大圍山的S2批藏菖蒲中檢測(cè)到4種結(jié)構(gòu)取代基類型,分析出5個(gè)具有7H-AI7O結(jié)構(gòu)的化合物,產(chǎn)自安徽省六安市霍山縣的S4批藏菖蒲中檢測(cè)到2種結(jié)構(gòu)取代基類型,分析出2個(gè)具有7H-AI7O結(jié)構(gòu)的化合物,其余產(chǎn)自西藏林芝市察隅縣的S5批藏菖蒲和產(chǎn)自湖南瀏陽市大圍山的S6批石菖蒲,都只檢測(cè)到菖蒲新堿。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合化合物取代基種類和極性,以藏菖蒲S2批中除菖蒲新堿外的4個(gè)7H-AI7O類化合物為例,分析菖蒲屬中藥中7H-AI7O類成分的結(jié)構(gòu),詳見4批樣本的總離子流圖(total ion chromatogram,TIC)(見圖3)和母離子及主要碎片離子信息(見表2)。

表2 S2、S4、S5和S6批菖蒲屬中藥中7H-AI7O類成分的母離子及主要碎片離子

圖3 正離子模式下S2、S4、S5和S6批藥材7H-AI7O類成分富集部位的總離子流圖Fig.3 TIC of the enriched sites of 7H-AI7O components in batches S2,S4,S5,and S6 of medicinal materials in positive ion mode

依據(jù)菖蒲新堿裂解規(guī)律,并結(jié)合TA與AA天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析[10],7H-AI7O結(jié)構(gòu)母核上通常有OH、OCH3和COOH等取代基,并以O(shè)H、OCH3取代為主,基本未發(fā)現(xiàn)烷烴基直接取代的情況。

5,6,8-三甲氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]異喹啉-7-酮的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z322.107 8,根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜(見圖4B),推測(cè)母離子m/z322.107 8先丟失1個(gè)CO分子得到m/z294.112 2碎片離子,再依次丟失3個(gè)CH2O得到m/z204.079 7碎片離子;同時(shí),m/z294.112 2碎片離子也可依次丟失2個(gè)CH3自由基,經(jīng)電子重排,得到m/z264.065 2碎片離子,再繼續(xù)丟失1分子CO。從裂解途徑分析,該化合物的結(jié)構(gòu)中應(yīng)該有3個(gè)OCH3取代基,且在6和8位有OCH3取代,詳見質(zhì)譜裂解途徑(見圖4C)。

圖4 正離子模式下5,6,8-三甲氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]異喹啉-7-酮的一級(jí)質(zhì)譜圖(A)、二級(jí)質(zhì)譜圖(B)和可能的裂解途徑(C)Fig.4 Primary mass spectrometry (A),secondary mass spectrometry(B),and possible fragmentation pathways(C) of 5,6,8-trimethoxy-7H-azuleno[1,2,3-i,j]isoquinolin-7-one in positive ion mode

5,8-二甲氧基-6-乙氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]異喹啉-7-酮的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z336.123 7,根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜(見圖5B)分析,母離子m/z336.123 7丟失1個(gè)CO和1個(gè)C2H4得到m/z280.097 0碎片離子,m/z280.097 0離子同菖蒲新堿,依次丟失CH3和H自由基產(chǎn)生m/z264.065 9碎片離子,再繼續(xù)丟失1個(gè)CO生成m/z236.070 9碎片離子。根據(jù)裂解途徑分析,該化合物結(jié)構(gòu)中存在1個(gè)OCH2CH3和2個(gè)OCH3取代基,初步確定6位和8位為OCH2CH3和OCH3取代,另1個(gè)OCH3可能在除6、7和8位的其他位置取代,詳見質(zhì)譜裂解途徑(見圖5C)。

圖5 正離子模式下5,8-二甲氧基-6-乙氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]異喹啉-7-酮的一級(jí)質(zhì)譜圖(A)、二級(jí)質(zhì)譜圖(B)和可能的裂解途徑(C)Fig.5 Primary mass spectrometry (A),secondary mass spectrometry (B),and possible fragmentation pathways (C) of 5,8-dimethyl-6-ethoxy-7H-azuleno[1,2,3-i,j]isoquinolin-7-one in positive ion mode

5,8-二甲氧基-9-乙氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]異喹啉-7-酮的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z336.123 3,根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜(見圖6B),推測(cè)其裂解途徑為,母離子m/z336.123 3丟失1個(gè)CO和1個(gè)C2H4,得到m/z280.097 4碎片離子,m/z280.097 4離子再依次丟失1個(gè)CH3、1個(gè)H自由基和1個(gè)CO生成m/z236.070 9碎片離子。根據(jù)裂解途徑分析結(jié)構(gòu)中有2個(gè)OCH3和1個(gè)OCH2CH3取代基,取代基類型同5,8-二甲氧基-6-乙氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]異喹啉-7-酮,但從離子流圖分析,5,8-二甲氧基-6-乙氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]異喹啉-7-酮的tR值17.11 min,5,8-二甲氧基-9-乙氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]異喹啉-7-酮的tR值17.74 min,說明這兩個(gè)化合物的極性有差異,其極性差異與取代基位置直接相關(guān),初步推測(cè)這兩個(gè)化合物的極性差異與6位是否有OCH2CH3取代有關(guān),當(dāng)6位有OCH2CH3取代時(shí),與7位羰基產(chǎn)生空間位阻,一定程度上,影響7H-AI7O的剛性平面,使化合物極性增大;當(dāng)6位無OCH2CH3取代時(shí),不與7位羰基產(chǎn)生空間位阻,化合物極性相對(duì)前者較小,而OCH2CH3取代基位置可能在4、5、9、10或11位,詳見質(zhì)譜裂解途徑(見圖6C)。

圖6 正離子模式下5,8-二甲氧基-9-乙氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]異喹啉-7-酮的一級(jí)質(zhì)譜圖(A)、二級(jí)質(zhì)譜圖(B)和可能的裂解途徑(C)Fig.6 Primary mass spectrometry (A),secondary mass spectrometry (B),and possible fragmentation pathways (C) of 5,8-dimethyl-9-ethoxy-7H-azuleno[1,2,3-i,j]isoquinolin-7-one in positive ion mode

以5-乙氧基-6-羥基-8-甲氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]異喹啉-7-酮為例說明,該化合物的準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z322.107 7,根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜(見圖7B),推測(cè)裂解途徑為母離子m/z322.107 7分別丟失1個(gè)CO分子、1個(gè)C2H4生成m/z266.081 3碎片離子,再失去1個(gè)CH3自由基和1個(gè)CO,生成m/z223.062 1碎片離子,分析結(jié)構(gòu)中存在1個(gè)OCH2CH3、1個(gè)OCH3和1個(gè)OH取代基;當(dāng)6位有OCH3或OCH2CH3取代時(shí),與7位羰基產(chǎn)生空間位阻,化合物極性增大,但與5,6,8-三甲氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]異喹啉-7-酮和菖蒲新堿的結(jié)構(gòu)和極性比較分析,該化合物的極性較小,推測(cè)6位無OCH3或OCH2CH3取代,可能有OH取代,當(dāng)6位是OH取代時(shí),與7位羰基形成分子內(nèi)氫鍵締合,極性較其他位羥基取代時(shí)小,且OCH3和OCH2CH3的取代基可能在4、5、8、9、10或11位中的任意2個(gè)位置取代,詳見質(zhì)譜裂解途徑(見圖7C)。

圖7 正離子模式下5-乙氧基-6-羥基-8-甲氧基-7H-薁[1,2,3-i,j]異喹啉-7-酮的一級(jí)質(zhì)譜圖(A)、二級(jí)質(zhì)譜圖(B)和可能的裂解途徑(C)Fig.7 Primary mass spectrometry (A),secondary mass spectrometry (B),and proposed fragmentation pathways(C) of 5-ethoxy-6-hydroxy-8-methoxy-7H-azuleno[1,2,3-i,j]isoquinolin-7-one in positive ion mode

二級(jí)質(zhì)譜裂解中7H-AI7O類成分除丟失CO生成[M+H-28]+碎片離子外,結(jié)構(gòu)中8位甲氧基可丟失1個(gè)CH3自由基,6位羥基丟失1個(gè)H自由基,發(fā)生電子重排后,再丟失1個(gè)CO分子,當(dāng)結(jié)構(gòu)中有OCH2CH3取代時(shí),易丟失乙炔分子,生成羥基。因此,可根據(jù)碎片離子峰判斷7H-AI7O的取代基種類和數(shù)目,但不能完全確定7H-AI7O中取代基的具體位置。

3 討論與結(jié)論

目前,本實(shí)驗(yàn)僅采集了5批藏菖蒲和5批石菖蒲,樣本數(shù)量有限、產(chǎn)地較局限,但就目前采集的樣本,仍能獲得一些信息,藏菖蒲和石菖蒲藥材中都存在7H-AI7O類成分;含7H-AI7O類成分的藏菖蒲較石菖蒲的產(chǎn)地分布廣;藏菖蒲中所含7H-AI7O化合物的結(jié)構(gòu)種類較石菖蒲的豐富,但研究?jī)?nèi)容還不夠完善,后續(xù)將繼續(xù)擴(kuò)大標(biāo)本的采集范圍,積累樣本數(shù),全面系統(tǒng)地分析不同產(chǎn)地菖蒲屬藥材中7H-AI7O類成分的分布情況及含量變化規(guī)律;對(duì)監(jiān)測(cè)到含有豐富的7H-AI7O類成分的菖蒲屬藥材進(jìn)行系統(tǒng)分離,獲得具體化合物,進(jìn)一步完善不同取代基7H-AI7O類成分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫,為快速準(zhǔn)確地檢測(cè)和確定7H-AI7O類成分的結(jié)構(gòu)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

植物來源的7H-AI7O量極少,前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[11],在菖蒲中可同時(shí)分離得到菖蒲新堿(7H-AI7O結(jié)構(gòu))和菖蒲堿甲(AA結(jié)構(gòu)),這兩個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)差異主要在于前者在7位多一個(gè)羰基,結(jié)合7H-AI7O類成分易丟失CO生成[M+H-28]+的裂解特點(diǎn)推測(cè),植物體內(nèi)7H-AI7O與AA類成分之間可能存在生物轉(zhuǎn)化關(guān)系,因此,后續(xù)研究中也會(huì)開展菖蒲屬中藥7H-AI7O與AA類成分的生物轉(zhuǎn)化關(guān)系,及土壤、氣候等因素對(duì)植物體內(nèi)7H-AI7O類成分生物合成的影響,為進(jìn)一步挖掘菖蒲屬中藥開竅豁痰,醒神益智的物質(zhì)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。