胡靖瑤,袁瑞瑛*,王廣明,蔡詩琪,周明琦,王富乾,蔡由生

1西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院,拉薩 850012;2武漢大學(xué)藥學(xué)院,武漢 430071;3武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部,武漢 430022

海洋是地球上最大的表面資源,其中存在著巨大的生物多樣性,是天然產(chǎn)物的重要來源之一。尤其是其中多種多樣的海洋微生物,在很大程度上還未被開發(fā)。海洋真菌在極端的生存環(huán)境下,有著獨(dú)特的代謝方式與途徑,生存繁殖方式、適應(yīng)機(jī)制,從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、具有多種生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物,引起國內(nèi)外科學(xué)家的密切關(guān)注[1,2],成為當(dāng)前最具開發(fā)前景的海洋天然產(chǎn)物新藥源,也是研發(fā)新型先導(dǎo)化合物的熱點(diǎn)之一[3]。

曲霉屬廣泛分布于陸地和海洋環(huán)境中,海洋曲霉已證實(shí)具有產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)多樣次級(jí)代謝物的能力。1992年Numata等[4]報(bào)道了首個(gè)海洋曲霉來源的天然產(chǎn)物,揭開了海洋曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物研究的篇章。截至2018年,研究報(bào)道的海洋曲霉來源的新天然產(chǎn)物數(shù)量已經(jīng)超過了979個(gè),包括聚酮類、生物堿類、萜類、大環(huán)內(nèi)酯、酰胺類、甾體類、鹵代物類、肽類等多種類型,這一系列海洋真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物具有抗腫瘤、抗病毒、清除自由基、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、抗炎、抗心腦血管等疾病、抑菌和抗蟲等多種生物活性[5,6]。例如,從海洋真菌Aspergillusniger發(fā)酵產(chǎn)物中提取得到了化合物aurasperone H,對(duì)人急性早幼粒白血病細(xì)胞HL-60具有顯著的細(xì)胞毒性[7]。海洋真菌AspergillusjenseniiLW128發(fā)酵粗提取物中獲得的二苯醚類化合物diorcinol D具有良好的抗菌活性[8]。有必要進(jìn)一步對(duì)罕見的海洋曲霉屬真菌進(jìn)行深入研究,充分發(fā)掘其生物合成潛力,以獲得更多可以開發(fā)為前體藥物的天然產(chǎn)物。因此本實(shí)驗(yàn)以一種從中國南海海洋沉積物中分離獲得海洋真菌AspergillusjenseniiSS5為研究對(duì)象,對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)成分鑒定,以期獲得具有顯著細(xì)胞毒活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物,為小分子癌癥治療藥物設(shè)計(jì)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker AVANCE400和600超導(dǎo)核磁共振儀;LC3000高效液相色譜儀(瑞億斯公司);SB-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器(上海艾朗儀器有限公司)。提取分離所用分析純?cè)噭┍⒋姿嵋阴?、甲醇、石油醚?湖北申試化工科技有限公司);色譜級(jí)甲醇(湖北弗頓科學(xué)技術(shù)有限公司)。人肺癌A549和人肝癌Bel-7402均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC);5-氟尿嘧啶(5-FU)(純度≥99%,批號(hào)F6627,Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司)。

1.2 菌種來源

本實(shí)驗(yàn)所使用的真菌菌株是從中國南海海洋沉積物中分離獲得,編號(hào)SS5,菌株由武漢大學(xué)藥學(xué)院洪葵教授課題組鑒定。根據(jù)測(cè)序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,菌株SS5與AspergillusjenseniiNRRL 58600親緣關(guān)系最近,比對(duì)結(jié)果中其序列相似度為99.28%,結(jié)合形態(tài)學(xué)分析,初步判斷菌株SS5為曲霉屬真菌A.jensenii。

1.3 菌種的發(fā)酵與分離提取

將26℃下靜置培養(yǎng)30 d后的液體發(fā)酵的菌絲體破碎,丙酮超聲提取3次,每次20 min,濃縮提取液,和培養(yǎng)液混合,濃縮后用醋酸乙酯萃取3次,濃縮得到浸膏(32.0 g)。浸膏經(jīng)正相硅膠柱色譜分離,石油醚-醋酸乙酯(20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶2)梯度洗脫,得到9個(gè)部分A～I(xiàn)。組分B(1.5 g)用正相硅膠柱色譜分離,石油醚-醋酸乙酯(5∶1、2∶1、1∶2)梯度洗脫后,得到4組分B1～B4。B3(298 mg)組分進(jìn)一步采用Sephadex LH-20柱色譜(二氯甲烷-甲醇1∶1)分離,得到7個(gè)組分B3a～B3g。B3d(34 mg)通過半制備HPLC分離純化(60%甲醇,體積流量3 mL/min,254 nm),得到化合物1(6 mg,tR= 15.6 min)、2(8 mg,tR= 26.1 min)。組分E(3.1 g)經(jīng)正相硅膠柱色譜分離,用二氯甲烷-甲醇(50∶1→1∶1)梯度洗脫后,得到6個(gè)組分,即E1～E6。E2(184 mg)經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜(甲醇)分離得到E2a(31 mg)、E2b(22 mg)、E2c(39 mg)、E2d(19 mg)、E2e(61 mg)。E2b經(jīng)半制備HPLC分離(40%～80%甲醇,體積流量3 mL/min,254 nm)得到化合物3(6 mg,tR= 15.3 min)。G部分(8.3 g)經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜(二氯甲烷-甲醇1∶1)分離,得到7個(gè)組分G1～G7。G1(135 mg)經(jīng)正相硅膠柱色譜分離,用石油醚-醋酸乙酯(10∶1、5∶1、2∶1、1∶1)梯度洗脫后,得到6個(gè)組分G1a～G1f。G1c(15 mg)經(jīng)半制備型HPLC分離(55%甲醇,體積流量3 mL/min,254 nm)得到化合物4(2 mg,tR=25.6 min)。

1.4 化合物活性測(cè)試

采用SRB法[9],測(cè)試了化合物1～4化合物對(duì)人肺癌A549和人肝癌Bel-7402兩種細(xì)胞的生長抑制作用,5-氟尿嘧啶(5-FU)為陽性對(duì)照,選用對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,胰酶消化后用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至2×104個(gè)細(xì)胞/mL,按照每孔190 μL細(xì)胞懸液接種在96孔培養(yǎng)板中,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。藥物處理孔加入10 μL樣品溶液(終質(zhì)量濃度化合物為5 μg/mL,混合物為50 μg/mL),陽性藥物孔加入終質(zhì)量濃度為5 μg/mL的5-FU進(jìn)行處理;對(duì)照孔加入含等體積溶媒的培養(yǎng)基,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)3 d。棄去培養(yǎng)基,加入100 μL 4 ℃預(yù)冷的50% 三氯乙酸(TCA)固定細(xì)胞。先靜置5 min,然后再移至4 ℃放置1 h。倒掉固定液,蒸餾水洗滌5次去除TCA,空氣干燥1 h。每孔加入0.4% SRB溶液80 μL,室溫染色30 min。棄染液,1% 醋酸洗滌5次充分去除未結(jié)合的SRB,空氣干燥。加入150 μL 10 mmol/L Tris-base(pH 10.5)溶解,微型振蕩器上振蕩5 min。M5酶標(biāo)儀測(cè)定OD510 nm值。根據(jù)公式:腫瘤細(xì)胞生長抑制率=(OD對(duì)照-OD藥物)/(OD對(duì)照-OD空白)×100%計(jì)算各化合物的細(xì)胞抑制率。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 化合物1的X射線晶體結(jié)構(gòu)Fig.1 X-ray crystal structure of compound 1

化合物1～4的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖2。

圖2 化合物1～4的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structures of compounds 1-4

2.2 腫瘤細(xì)胞毒活性

活性測(cè)試結(jié)果表明(見表1),海洋真菌A.jenseniiSS5中的化合物4對(duì)A549人肺癌細(xì)胞株和Bel-7402人肝癌細(xì)胞株均有較好的抑制作用,在5 μg/mL濃度下,初篩抑制率分別為41.23%、42.23%(陽性對(duì)照5-氟尿嘧啶對(duì)兩株腫瘤細(xì)胞抑制率分別為47.45%、72.99%);化合物2對(duì)A549人肺癌細(xì)胞株的初篩抑制率為47.34%?；衔?和3在初篩濃度下對(duì)這兩種細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒活性。

表1 化合物1～4的癌細(xì)胞生長抑制活性

3 討論與結(jié)論

從海洋真菌A.jenseniiSS5的粗提取物中分離得到四個(gè)化合物:epigriseofulvin(1)、sterigmatocystin(2)、brevianamide M(3)、meleagrin(4),其中化合物1～3是首次從海洋A.jensenii中分離得到,極大地豐富了曲霉屬真菌A.jensenii次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的多樣性。大量的研究結(jié)果已經(jīng)證明,海洋曲霉屬真菌是多種具有豐富生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物的重要來源,許多海洋曲霉來源的新天然產(chǎn)物具有較好的抗腫瘤、抗病毒等多種生物活性,因此本文對(duì)4種化合物的細(xì)胞毒性進(jìn)行了測(cè)試,結(jié)果表明化合物4可以有效抑制人肺癌A549細(xì)胞和人肝癌Bel-7402細(xì)胞,化合物2對(duì)A549人肺癌細(xì)胞株有較好抑制作用,這兩種化合物有望作為抗癌前體藥物進(jìn)行深入研究,本研究也為天然活性化合物的開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。