蔣宗鎣,趙云輝,張?jiān)仆?鄭 一,王建光,劉羽茜,王艷杰

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,沈陽(yáng) 110847

肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤,威脅著人類的健康,是公共衛(wèi)生面臨的一項(xiàng)重大難題。據(jù)GLOBOCAN 2020年數(shù)據(jù)和世界衛(wèi)生組織《世界人口前景》分析,2022年肺癌仍是我國(guó)發(fā)生率和死亡率最高的腫瘤[1]。在腫瘤微環(huán)境中,發(fā)揮免疫效用的巨噬細(xì)胞多表達(dá)為M2型,多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示M2型巨噬細(xì)胞促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與遷移,并與腫瘤耐藥呈正相關(guān)性[2,3]。肺癌早期M1型巨噬細(xì)胞高表達(dá),而中晚期巨噬細(xì)胞更傾向于表達(dá)M2型[4]。巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的可塑性,并且M1型巨噬細(xì)胞比率與生存率增加呈正相關(guān),這讓阻斷M2型極化或促進(jìn)M2型復(fù)極為M1型策略具有吸引力,為腫瘤免疫治療提供了重要研究方向[5]。“培土生金法”在治療肺癌中取得良好成效,本課題組前期發(fā)現(xiàn)四君子湯、參苓白術(shù)散等培土生金中藥復(fù)方可以有效抑制肺癌增殖[6,7]。白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ(atractylenolide Ⅱ,AT-Ⅱ)是培土生金中藥復(fù)方中白術(shù)里提取的倍半萜單體,在多種腫瘤中具有抗腫瘤活性[8-10]。AT-Ⅱ可以通過(guò)誘導(dǎo)凋亡來(lái)阻礙腫瘤進(jìn)展,但其是否可以通過(guò)調(diào)控免疫,對(duì)腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞間的相互作用產(chǎn)生影響尚不明確,故本文針對(duì)AT-Ⅱ?qū)才囵B(yǎng)體系下肺癌細(xì)胞的免疫調(diào)控進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

THP-1細(xì)胞、A549細(xì)胞,購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司(CL-0233、CL-0016)。

1.1.2 試劑

胎牛血清(四季青,批號(hào)19110502);RPMI-1640培養(yǎng)基(普諾賽,貨號(hào)PM150110B);MTT試劑(碧云天,貨號(hào)C0009);PMA(Solarbio,貨號(hào)P6741);RNase inhibitor(BioTeke,貨號(hào)RP5602);RIPA裂解液(Solarbio,貨號(hào)R0010)。

1.2 方法

1.2.1 M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)

參照課題組前期的實(shí)驗(yàn)方法[11],用PMA、IL-4與IL-13將THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)分化為M2巨噬細(xì)胞。待其密度達(dá)到90%按1∶2進(jìn)行傳代。

1.2.2 共培養(yǎng)模型建立

利用Transwell小室,模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境[12],將種有M2型巨噬細(xì)胞的小室嵌入含A549細(xì)胞的96孔板中共同培養(yǎng)。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定A549細(xì)胞活力

根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)摸索發(fā)現(xiàn)2.5、5 μmol/L AT-Ⅱ單獨(dú)作用巨噬細(xì)胞與A549細(xì)胞48 h對(duì)其細(xì)胞活力無(wú)影響。構(gòu)建共培養(yǎng)體系,檢測(cè)2.5、5 μmol/L AT-Ⅱ?qū)才囵B(yǎng)條件下肺癌細(xì)胞活力的影響。A549細(xì)胞消化離心后,重懸計(jì)數(shù),按4×103個(gè)/孔接種于96孔板,設(shè)置五個(gè)復(fù)孔,待其貼壁。將接種不同濃度AT-Ⅱ孵育的M2型巨噬細(xì)胞的小室嵌入96孔板中,共培養(yǎng)48 h。然后更換為含MTT的培養(yǎng)基,在37 ℃下孵育4 h。去上清,加入DMSO,放入酶標(biāo)儀,讀取570 nm處OD值,根據(jù)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組(control,Con)的OD比值計(jì)算細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率=[(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)]×100%。

1.2.4 Real-time PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Arg-1的mRNA表達(dá)水平

每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔,0、2.5、5 μmol/LAT-Ⅱ作用后提取M2型巨噬細(xì)胞,與裂解液混勻靜置后,加入氯仿,震蕩15 s后放置于室溫下3 min。4 ℃ 10 000 g離心10 min,將得到的透明水相與無(wú)水乙醇按2∶1混勻,轉(zhuǎn)入吸附柱離心后,棄廢液。加入去蛋白液離心30 s后,用漂洗液清洗。最后向裝有吸附柱的離心管中加入不含RNA酶ddH2O,4 ℃ 離心得到總RNA。對(duì)所得樣本進(jìn)行濃度測(cè)定后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,即將含有模板RNA、引物、Reaction Buffer、RNase Inhibitor、dNTP Mix、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)體系放入PCR儀中。將得到的cDNA模板、上下游引物(Arg-1上游:CATAGGGATTATTGGAGC,Arg-1下游:TCATTAGGGATGTCAGCA;GAPDH上游:GACCTGACCTGCCGTCTAG,GAPDH下游:AGGAGTGGGTGTCGCTGT)、SYBR GREEN與MasterMix放入熒光定量?jī)x進(jìn)行擴(kuò)增處理。最后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,根據(jù)溶解曲線判定擴(kuò)增數(shù)據(jù)是否可用,若可用則根據(jù)2-△△Ct值來(lái)判斷表達(dá)量。

1.2.5 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TNF-α和IL-1β含量

取共培養(yǎng)體系中的上清,離心去除沉淀物。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品與抗體。在加樣前,用洗液洗板以使包被抗體保持最佳活性,按照每孔100 μL進(jìn)行加樣,加入抗體后封膜。室溫振蕩孵育1.5 h后,棄液,漂洗。再向孔中加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素,封膜孵育30 min后再洗滌6次。最后再加入TMB避光靜置20 min后終止反應(yīng),放入酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。將校準(zhǔn)的OD值(450 nm的測(cè)定值減去570 nm的測(cè)定值)帶入繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各組上清中TNF-α、IL-1β炎性因子含量。

1.2.6 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TLR4、p-p65、NF-κB(p65)、PDL1的蛋白表達(dá)水平

提取A549細(xì)胞,按照試劑盒指示提取總蛋白,采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。將稀釋的樣品進(jìn)行煮沸變性,制成上樣液。將上樣液按每孔20 μL注入膠槽中,進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后按照“三明治”法轉(zhuǎn)膜封閉。完成后再將PVDF膜用一抗4 ℃孵育。清洗4次后再將其放入二抗中孵育1 h,清洗后轉(zhuǎn)入暗盒,灑勻發(fā)光液進(jìn)行曝光。記錄條帶的光密度值,計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參的比值,用于后續(xù)分析。

1.2.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞遷移能力

鋪板前在六孔板底背面畫(huà)三條平行線,將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的A549細(xì)胞接種于6孔板,置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁且融合度達(dá)到80%時(shí),用200 μL槍頭劃出與標(biāo)記線垂直的細(xì)胞劃痕,清洗細(xì)胞碎片,倒置顯微鏡下觀察記錄0 h狀態(tài)。隨后將成功種有M2型巨噬細(xì)胞的小室轉(zhuǎn)入6孔板中與A549細(xì)胞共培養(yǎng)48 h,48 h后拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 AT-Ⅱ?qū)549細(xì)胞活力的影響

共培養(yǎng)條件下,與Con組(1.000 ± 0.089)相比,2.5 μmol/L組(0.944 ± 0.094)A549細(xì)胞活力未見(jiàn)顯著變化(P>0.05),5 μmol/L組(0.744 ± 0.111)細(xì)胞活力明顯下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)(見(jiàn)圖1)。該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明5 μmol/L AT-Ⅱ?qū)奘杉?xì)胞共培養(yǎng)條件下的肺癌細(xì)胞活力具有抑制作用。

圖1 AT-Ⅱ?qū)才囵B(yǎng)條件下A549細(xì)胞活力的影響 Fig.1 Effect of AT-Ⅱ on cell viability of A549 in co-culture注:*P<0.05,**P<0.01,下同。Note:*P<0.05,**P<0.01,the same below.

2.2 AT-Ⅱ?qū)2型巨噬細(xì)胞Arg-1的mRNA表達(dá)水平的影響

通過(guò)溶解曲線判定擴(kuò)增基因?yàn)閱我荒康幕駻rg-1,具有特異性,數(shù)據(jù)具有可信性(見(jiàn)圖2)。與Con組相比,2.5、5 μmol/L組Arg-1表達(dá)明顯降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)(見(jiàn)圖3)。Arg-1為M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)的特異性分子,其含量降低說(shuō)明AT-Ⅱ可以逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞M2型極化。

圖2 Arg-1、GAPDH溶解曲線Fig.2 Arg-1 and GAPDH melting curve

圖3 AT-Ⅱ?qū)2型巨噬細(xì)胞Arg-1的mRNA表達(dá)水平的影響 Fig.3 Effect of AT-Ⅱ on mRNA expression of Arg-1 in M2 macrophages

2.3 AT-Ⅱ?qū)ι锨逯蠺NF-α、IL-1β含量的影響

2.5 μmol/L組與Con組相比,上清中TNF-α與IL-1β含量無(wú)明顯差異(P>0.05)。5 μmol/L組與Con組相比有增多趨勢(shì)但未構(gòu)成顯著差異(P>0.05)(見(jiàn)圖4)。

圖4 AT-Ⅱ?qū)ι锨逯蠺NF-α、IL-1β含量的影響Fig.4 Effect of AT-Ⅱ on TNF-α,IL-1β content in supernatant

2.4 AT-Ⅱ?qū)549細(xì)胞TLR4、p-p65、NF-κB(p65)、PDL1的蛋白表達(dá)水平的影響

通過(guò)條帶寬度及目的蛋白與內(nèi)參的灰度比值可以看出AT-Ⅱ明顯抑制A549細(xì)胞表面TLR4蛋白的表達(dá),顯著降低p-p65、NF-κB與PDL1蛋白的表達(dá)(P<0.01)(見(jiàn)圖5與表1)。

表1 AT-Ⅱ?qū)549細(xì)胞TLR4、p-p65、NF-κB(p65)、PDL1蛋白灰度比值的影響

圖5 AT-Ⅱ?qū)549細(xì)胞TLR4、p-p65、NF-κB p65、PDL1蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of AT-Ⅱ on the expression of TLR4,p-p65,NF-κB p65 and PDL1 in A549 cells

2.5 AT-Ⅱ?qū)549細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕0 h Con、2.5、5 μmol/L三組原始邊緣距離無(wú)差異(P>0.05),48 h后與Con組相比,2.5 μmol/L與5 μmol/L組細(xì)胞的邊緣距離明顯增大(P<0.01)(見(jiàn)圖6)。

圖6 AT-Ⅱ?qū)549細(xì)胞遷移能力的影響Fig.6 Effect of AT-Ⅱ on migration ability of A549 cells

3 討論與結(jié)論

肺癌是癌癥致死的頭號(hào)原因,發(fā)病初期病情隱匿,容易錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)[13]。邪之所湊其氣必虛,中醫(yī)認(rèn)為癌瘤為標(biāo),正虛為本,正虛乃成巖?！芭嗤辽鸱ā笔俏逍邢嗌碚摰膶?shí)踐化,是“虛則補(bǔ)其母”的具體化。肺癌雖病位在肺,但課題組前期證明“培土生金法”可以通過(guò)調(diào)理脾臟達(dá)到抑制肺癌進(jìn)展的效果。同時(shí)大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明參苓白術(shù)散[14,15]、四君子湯[16,17]、健脾益肺方[18]均可以調(diào)補(bǔ)脾胃,從而抑制肺癌生長(zhǎng)。白術(shù)是上述復(fù)方中的共有藥物,是補(bǔ)脾益氣藥的代表,其主要藥效成分為白術(shù)內(nèi)酯、蒼術(shù)酮。蒼術(shù)酮在加熱、炮制后含量會(huì)明顯下降,因此白術(shù)內(nèi)酯成為白術(shù)中藥煎劑的主要作用成分。以往藥理研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)具有抗腫瘤作用,并且無(wú)明顯機(jī)體毒性。AT-Ⅱ是白術(shù)中提取的一種倍半萜單體,已證實(shí)對(duì)多種腫瘤起到抑制作用。

中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)指出中醫(yī)藥學(xué)與免疫學(xué)相結(jié)合有益于闡明中醫(yī)藥調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的機(jī)理,為中醫(yī)藥臨床有效性提供依據(jù)。2018年諾貝爾得者詹姆斯·艾利森與庶佑提出通過(guò)調(diào)動(dòng)自身免疫能力來(lái)攻擊癌癥的全新觀念,印證了“扶正治癌”理論。在腫瘤微環(huán)境中,巨噬細(xì)胞被招募至微環(huán)境中活化成腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages,TAMs),多表達(dá)為促瘤M2型[19],高表達(dá)Arg-1,產(chǎn)生CCL17、CCL18、CCL22等抗炎因子。本研究通過(guò)模擬腫瘤微環(huán)境的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AT-Ⅱ降低了巨噬細(xì)胞Arg-1的表達(dá)與肺癌細(xì)胞活力,說(shuō)明AT-Ⅱ可通過(guò)減少M(fèi)2型極化抑制肺癌細(xì)胞的增殖能力。M2型巨噬細(xì)胞促進(jìn)腫瘤進(jìn)展,而M1型巨噬細(xì)胞高浸潤(rùn)被證實(shí)可以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移,與生存率增加呈正相關(guān)[20,21]。巨噬細(xì)胞較強(qiáng)的可塑性使重編程或再極化成為調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能的有效途徑。巨噬細(xì)胞極化與臨床上多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān),尤其是惡性腫瘤。研究表明TAMs根據(jù)局部環(huán)境呈現(xiàn)一種或幾種表型的暫時(shí)性表達(dá)[22]。本研究通過(guò)ELISA測(cè)定上清液中M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子TNF-α、IL-1β的含量來(lái)推斷AT-Ⅱ是否將M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)換為M1型巨噬細(xì)胞來(lái)達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果。結(jié)果顯示M1型相關(guān)因子TNF-α、IL-1β含量有增多趨勢(shì)但未構(gòu)成顯著性差異,可能與仍處于M2型向M1型轉(zhuǎn)換過(guò)渡期,尚未完全逆轉(zhuǎn)為M1型巨噬細(xì)胞有關(guān);巨噬細(xì)胞極化不受其所在部位本身影響,而是受到其所在特定微環(huán)境的信號(hào)作用影響。影響極化的因素包括腫瘤細(xì)胞來(lái)源的因子、腫瘤微環(huán)境、巨噬細(xì)胞自分泌因子及穩(wěn)態(tài)失衡因素。臨床研究表明炎癥是癌癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,SII、NLR、PLR等炎性標(biāo)志物可用于評(píng)估癌癥患者預(yù)后[23]。炎癥是腫瘤進(jìn)展的驅(qū)動(dòng)因素,NF-κB 信號(hào)通路是目前最被認(rèn)可的炎癥通路,參與腫瘤進(jìn)展[24]。同時(shí)研究表明激活的NF-κB通路促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞炎癥介質(zhì)的合成釋放[25],本研究WB結(jié)果顯示AT-Ⅱ抑制A549細(xì)胞TLR4/NF-κB通路,故可能導(dǎo)致TNF-α、IL-1β含量無(wú)顯著增加。同時(shí)TLR4/NF-κB通路被證實(shí)與免疫抑制分子PDL1也有著密切聯(lián)系,Larsen課題組的富集結(jié)果顯示PD-L1通過(guò)NF-κB富集到其他標(biāo)志基因集[26]。IL-1α與IFN-γ聯(lián)合時(shí)具有協(xié)同作用,Chen等[27]運(yùn)用siRNA敲低p65,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子聯(lián)合驅(qū)動(dòng)的PD-L1水平降低。實(shí)驗(yàn)表明,在腫瘤微環(huán)境中PDL1高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的遷移能力呈正相關(guān)[28],與本研究PDL1蛋白水平表達(dá)降低與劃痕實(shí)驗(yàn)愈合速率變慢的結(jié)果相吻合,即AT-Ⅱ通過(guò)抑制TLR4/NF-κB通路減少PDL1表達(dá)從而降低了A549細(xì)胞的遷移能力。

在腫瘤微環(huán)境中,TAMs被馴服,多表達(dá)為促腫瘤型。靶向TAMs治療已成為腫瘤治療的新興途徑。本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明AT-Ⅱ可以逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞促瘤型轉(zhuǎn)換,減少PDL1的表達(dá)來(lái)抑制肺癌細(xì)胞遷移,為臨床治療肺癌提供了新思路。