王建華,王首萌,屈淑帆,喬雪陽(yáng),王曉,李廣領(lǐng)

（河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003）

即食性蔬菜是指采摘后通過(guò)簡(jiǎn)單清洗可直接食用或采用調(diào)味（或不調(diào)味）工藝加工而成的蔬菜產(chǎn)品[1],例如瓜菜類的黃瓜、苦瓜、佛手瓜等,果菜類的茄子、西紅柿、甜椒等,葉菜類的生菜、卷心菜、苦苣等.這類蔬菜的突出特點(diǎn)是食用方便.此外,由于不經(jīng)過(guò)烹飪加工過(guò)程,即食性蔬菜能保持蔬菜原本口感,且營(yíng)養(yǎng)成分不會(huì)被破壞.但因即食性蔬菜作物生長(zhǎng)周期相對(duì)較短,其生長(zhǎng)過(guò)程中為防控病蟲(chóng)侵襲而施用的農(nóng)藥就特別容易使蔬菜產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo),且其產(chǎn)生的農(nóng)藥殘留安全風(fēng)險(xiǎn)要遠(yuǎn)高于生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)的常規(guī)蔬菜產(chǎn)品.隨著人們食品安全意識(shí)不斷增強(qiáng),農(nóng)藥殘留風(fēng)險(xiǎn)更高的即食性蔬菜產(chǎn)品質(zhì)量安全倍受關(guān)注.

氯蟲(chóng)苯甲酰胺（Chorantraniliprole）是美國(guó)杜邦公司于2000 年研發(fā)的鄰甲酰氨基苯甲酰胺類殺蟲(chóng)劑,作為昆蟲(chóng)魚(yú)尼丁受體高效激活劑,對(duì)危害多種作物的重要鱗翅目和雙翅目害蟲(chóng)防效優(yōu)異[2]；甲基硫菌靈（Thiophanate-methyl）是1969 年由日本曹達(dá)公司研發(fā)的苯并咪唑類廣普性殺菌劑,其植物代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)物多菌靈（Carbendazim）同樣具有廣普殺菌活性[3].氯蟲(chóng)苯甲酰胺熔點(diǎn)為208 ℃~210 ℃、330 ℃（分解）,log Kow（pH 7.0,20 ℃）為2.86,pKa（20 ℃）為10.88,大鼠急性經(jīng)口LD50大于5 000 mg/kg；甲基硫菌靈熔點(diǎn)為172 ℃（分解）,log Kow（pH 7.0,20 ℃）為1.40,pKa（20 ℃）為7.2,堿性條件下易分解,大鼠急性經(jīng)口LD50為6 640~7 500 mg/kg；多菌靈熔點(diǎn)為307 ℃~312 ℃（分解）,log Kow（pH 7.0,20 ℃）為1.51（pH 7.0）,pKa（25 ℃）為4.48,堿性環(huán)境下不穩(wěn)定[4].其中多菌靈為甲基硫菌靈在植物體內(nèi)的毒理學(xué)意義代謝物,大鼠急性經(jīng)口LD50大于15 000 mg/kg,2017 年JMPR 將用于植物產(chǎn)品中膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的甲基硫菌靈殘留物定義為甲基硫菌靈及多菌靈之和,結(jié)果以多菌靈表達(dá)[5].我國(guó)現(xiàn)行食品安全標(biāo)準(zhǔn)[6]規(guī)定生菜、黃瓜和西紅柿中甲基硫菌靈最大允許殘留限量（MRLs）分別為5 mg/kg、2 mg/kg 和3 mg/kg；生菜、黃瓜和西紅柿中氯蟲(chóng)苯甲酰胺的MRLs 分別為5 mg/kg、0.3 mg/kg 和0.6 mg/kg.目前報(bào)道的蔬菜中氯蟲(chóng)苯甲酰胺、多菌靈和甲基硫菌靈殘留分析方法有分光光度法[7-9]、液相色譜法[10-14]、液質(zhì)聯(lián)用法[15-18]和酶免疫測(cè)定法[19-22]等.分光光度法雖然儀器成本低、操作簡(jiǎn)單,但易受樣品基質(zhì)干擾且檢測(cè)靈敏度較低；氣相色譜法需經(jīng)過(guò)復(fù)雜的化學(xué)衍生化過(guò)程[23-24]；而酶免疫測(cè)定法存在著因樣品基質(zhì)干擾造成假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果概率較高的問(wèn)題.液相色譜法適宜于樣品中分子量大、極性范圍寬、高沸點(diǎn)及易熱分解的農(nóng)藥殘留分析.另外,在儀器成本和對(duì)操作人員技術(shù)要求方面又較色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有優(yōu)勢(shì),是農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留分析的常用儀器平臺(tái).

當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中,菜農(nóng)在病蟲(chóng)害防控藥劑品種選擇、用藥次數(shù)和施藥劑量等方面的不規(guī)范和不合理現(xiàn)象仍較普遍.另外,因菜農(nóng)對(duì)安全間隔期的重視不夠,對(duì)一些生長(zhǎng)周期內(nèi)多次采摘的蔬菜,違反安全間隔期采摘、銷(xiāo)售的現(xiàn)象也很普遍.因此,因農(nóng)藥的不科學(xué)和不合理使用帶來(lái)的農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留安全風(fēng)險(xiǎn)不容忽視.本研究在已報(bào)道的相關(guān)分析方法基礎(chǔ)上,擬建立當(dāng)前蔬菜生產(chǎn)廣泛使用的殺蟲(chóng)劑（氯蟲(chóng)苯甲酰胺）和殺菌劑（甲基硫菌靈、多菌靈）在有廣泛代表性的瓜菜（黃瓜）、果菜（西紅柿）和葉菜（生菜）三種典型即食性蔬菜樣品中殘留的QuEChERS 簡(jiǎn)易樣品前處理程序和符合農(nóng)藥殘留分析要求的UPLC-PDA 分析方法,以期為農(nóng)藥殘留檢測(cè)和監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1 000 mg/L氯蟲(chóng)苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,天津阿爾塔科技有限公司；1 000 mg/L多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液和1 000 mg/L甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；HPLC 級(jí)乙腈,美國(guó)Mreda 公司；分析級(jí)氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂和乙腈等,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PSA、C18、GCB 和NANO,天津博納艾杰爾科技有限公司.

UPLC-PDA 系統(tǒng)（配置真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、二元泵、柱溫箱和PDA 檢測(cè)器、Empower 3 數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)）,美國(guó)Waters 公司；VORTEX3 渦旋混合儀,德國(guó)IKA 公司；TDL-5000B 型大容量冷凍離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠；GTR16-2 型高速冷凍離心機(jī),北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；HGBTWTS3型均質(zhì)儀,美國(guó)Waring 公司；YP5002 電子天平,上海佑科儀器儀表有限公司.

試驗(yàn)樣品源自實(shí)驗(yàn)田培育生菜、黃瓜和西紅柿,兩年內(nèi)以上三種農(nóng)藥歷史,樣品經(jīng)均質(zhì)化后用塑封袋密封裝.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜分析條件優(yōu)化以ACQUITY UPLCRBEH C18色譜柱（2.1×100 mm,1.7 μm）為分離分析柱,設(shè)置30 ℃柱溫,以乙腈和水為色譜分析流動(dòng)相,柱流速0.3 mL/min.在此基礎(chǔ)上,通過(guò)使用不同體積比的色譜流動(dòng)相考察樣品基質(zhì)中三種目標(biāo)分析物的出峰情況,同時(shí)兼顧樣品分析時(shí)長(zhǎng),確定目標(biāo)分析物與樣品基質(zhì)獲得良好分離的色譜流動(dòng)相；通過(guò)對(duì)三種目標(biāo)分析物紫外全掃描（210 nm~400 nm）,兼顧檢測(cè)靈敏度和樣品基質(zhì)干擾情況,確定最佳的PDA 檢測(cè)波長(zhǎng),以不同體積的三種目標(biāo)分析物進(jìn)樣分析,考察目標(biāo)分析物峰形,結(jié)合儀器檢測(cè)靈敏度和最低定量校準(zhǔn)水平,確定最佳進(jìn)樣體積.最終獲得目標(biāo)分析物出峰時(shí)間適中、峰形良好、無(wú)樣品基質(zhì)干擾和靈敏度高的色譜分析條件.

1.2.2 分析樣品制備稱取10±0.1 g 均質(zhì)化的黃瓜、西紅柿和生菜空白樣品放入50 mL 離心管,在樣品管中加入10 mL 樣品提取液（含0.1%乙酸的乙腈溶液）和2 g 氯化鈉,渦旋提取3 min,再在30 ℃水浴中超聲提取5 min；4 500 r/min 離心5 min,轉(zhuǎn)移1 mL 上清液至2 mL 凈化管（預(yù)裝100 mg 無(wú)水硫酸鎂、25 mg PSA、25 mg C18 和25 mg NANO）,渦旋1 min；10 000 r/min 離心5min.上清液通過(guò)0.22 μm 針頭過(guò)濾器轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶,待色譜分析.

1.2.3 分析方法性能驗(yàn)證用三種蔬菜的乙腈提取液稀釋氯蟲(chóng)苯甲酰胺、甲基硫菌靈和多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,在優(yōu)化色譜條件下進(jìn)樣分析,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的色譜響應(yīng)值為縱坐標(biāo)建立基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)；再分別以10 倍信噪比測(cè)定并計(jì)算定量檢測(cè)限（LOQ）.

將1 mL 適宜質(zhì)量濃度的三種目標(biāo)分析物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別添加至盛裝10±0.5 g 均質(zhì)化的黃瓜、西紅柿和生菜空白樣品的50 mL 離心管,渦旋混勻3 min 后靜置30 min,得添加水平分別為1 mg/kg、0.5 mg/kg 和0.1 mg/kg 的標(biāo)樣添加樣品,空白對(duì)照樣品不加混合標(biāo)樣而添加1 mL 乙腈；然后按1.2.2 所述的分析樣品制備程序進(jìn)行樣品制備,采用1.2.1 確定的色譜分析條件進(jìn)行樣品分析.根據(jù)建立的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行外標(biāo)法定量較準(zhǔn),根據(jù)分析結(jié)果計(jì)算回收率及各添加水平5 個(gè)平行樣品間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）.

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分析條件

用UPLC-PDA 對(duì)三種目標(biāo)分析物進(jìn)行紫外全掃描得到相應(yīng)的紫外吸收光譜（見(jiàn)圖1）.在色譜流動(dòng)相優(yōu)化過(guò)程中發(fā)現(xiàn),以乙腈（B）和水（A）為梯度洗脫流動(dòng)相,設(shè)置梯度洗脫程序（0~3 min,30%B；7.0 min,65%B；8.0 min,95%B；10.0 min,95%B；10.1 min,30%B；15.0 min,30%B）,在35 ℃柱溫、0.3 mL/min 流動(dòng)相流速、3 μL 進(jìn)樣體積和254 nm 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)下可獲得三種蔬菜中三種目標(biāo)分析物穩(wěn)定良好的分離效果.

圖1 三種目標(biāo)分析物的紫外吸收光譜Fig.1 Ultraviolet absorption spectras of the three target analytes

圖2 為三種目標(biāo)分析物的典型色譜圖,圖3~5 分別為生菜、西紅柿和黃瓜空白樣品及標(biāo)樣添加樣品色譜圖.

圖2 三種目標(biāo)分析物的典型色譜圖Fig.2 Typical chromatograms of three target analytes

圖3 生菜空白樣品和標(biāo)樣添加樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of lettuce blank samples and spiked samples

圖4 西紅柿空白樣品色譜圖和標(biāo)樣添加樣品色譜圖Fig.4 Chromatogram of tomato blank samples and spiked samples

圖5 黃瓜空白樣品色譜圖和標(biāo)樣添加樣品色譜圖Fig.5 Chromatogram of cucumber blank samples and spiked samples

2.2 分析方法的線性檢測(cè)范圍

在優(yōu)化的UPLC-PDA 色譜條件下,對(duì)0.01 mg/L~5 mg/L 系列質(zhì)量濃度的氯蟲(chóng)苯甲酰胺、甲基硫菌靈和多菌靈的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)三種目標(biāo)分析物的不同質(zhì)量濃度與對(duì)應(yīng)的色譜響應(yīng)值均有良好線性響應(yīng).多菌靈、甲基硫菌靈和氯蟲(chóng)苯甲酰胺的定量校準(zhǔn)曲線方程分別為y=22 125x-608.4（R2=0.999 5）、y=25 994x-575.36（R2=1）和y=17 254x-55.564（R2=1）.

2.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度

用回收率和不同添加水平多次平行樣品間的標(biāo)準(zhǔn)偏差衡量分析方法的準(zhǔn)確度和精密度.表1 至表3 為黃瓜、西紅柿和生菜空白樣品中多菌靈、甲基硫菌靈和氯蟲(chóng)苯甲酰胺的回收率試驗(yàn)結(jié)果.表1~3 顯示,三種蔬菜樣品中的多菌靈、甲基硫菌靈和氯蟲(chóng)苯甲酰胺平均回收率為76%~115%,RSD 為1%~9%.通過(guò)在黃瓜、西紅柿和生菜空白樣品提取液中添加適當(dāng)質(zhì)量濃度的多菌靈、甲基硫菌靈和氯蟲(chóng)苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,測(cè)得黃瓜樣品中多菌靈、甲基硫菌靈和氯蟲(chóng)苯甲酰胺中的LOQ 分別為0.017 mg/kg、0.034 mg/kg和0.032 mg/kg；西紅柿中LOQ 分別為0.026 mg/kg、0.041 mg/kg 和0.012 mg/kg；生菜中LOQ 分別為0.038 mg/kg、0.043 mg/kg 和0.035 mg/kg.

表1 多菌靈、甲基硫菌靈和氯蟲(chóng)苯甲酰胺在黃瓜中不同添加水平的回收率Tab.1 Recoveries of chorantraniliprole,thiophanate-methyl and carbendazim at the different spiked levels in cucumber（n=5）

表2 多菌靈、甲基硫菌靈和氯蟲(chóng)苯甲酰胺在西紅柿中不同添加水平的回收率Tab.2 Recoveries of chorantraniliprole,thiophanate-methyl and carbendazim at the different spiked levels in tomato（n=5）

表3 多菌靈、甲基硫菌靈和氯蟲(chóng)苯甲酰胺在生菜中不同添加水平的回收率Tab.3 Recoveries of chorantraniliprole,thiophanate-methyl and carbendazim at the different spiked levels in lettuce（n=5）

從表1~3 中的回收率數(shù)據(jù)看,所開(kāi)發(fā)的分析方法的準(zhǔn)確度和精密度符合農(nóng)藥多殘留分析要求,方法檢測(cè)限能滿足GB 2763-2021 中三種蔬菜中三種農(nóng)藥殘留MRLs 標(biāo)準(zhǔn)[6].

3 結(jié)論與討論

本研究在色譜分析方法建立環(huán)節(jié)分別嘗試用不同體積比的乙腈和水為流動(dòng)相,考察目標(biāo)分析物和樣品基質(zhì)的分離情況,發(fā)現(xiàn)以乙腈和水作流動(dòng)相按設(shè)定程序梯度洗脫能保證多菌靈、甲基硫菌靈和氯蟲(chóng)苯甲酰胺合適的色譜保留時(shí)間,且峰形端正、對(duì)稱性好、無(wú)樣品基質(zhì)干擾.此外,為避免實(shí)驗(yàn)室溫度變化對(duì)目標(biāo)分析物色譜保留時(shí)間及分離效果的影響,設(shè)定35 ℃的色譜柱溫.另外,分別測(cè)試了2 μL、3 μL 和5 μL三種進(jìn)樣體積下的色譜出峰效果,發(fā)現(xiàn)進(jìn)樣量為5 μL 時(shí)多菌靈和甲基硫菌靈峰型較寬且有明顯拖尾現(xiàn)象,考慮到2 μL 的進(jìn)樣量可能影響樣品中目標(biāo)分析物的檢測(cè)靈敏度,因此,以3 μL 的進(jìn)樣體積為優(yōu)化進(jìn)樣量.在紫外檢測(cè)波長(zhǎng)選擇方面,兼顧流動(dòng)相紫外吸收截止波長(zhǎng)和檢測(cè)靈敏度,選擇254 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng).

在農(nóng)藥殘留分析樣品制備程序中,C18 主要用于去除脂類疏水性雜質(zhì),GCB 主要用于去除色素類物質(zhì),PSA 主要用于去除脂肪酸等物質(zhì)[25].NANO 作為一種新型碳納米凈化材料,其表面的去活處理,有效降低了對(duì)藥物分子的吸附性,而其作為傳統(tǒng)碳納米管的官能團(tuán)修飾產(chǎn)物,又大大增加了對(duì)色素、脂肪酸等干擾物的吸附活性,相較于常規(guī)SPE 材料,NANO 去除樣品色素能力更強(qiáng),目標(biāo)分析物的回收率更理想,可廣泛用于農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥多殘留檢測(cè)[26].在分析樣品制備環(huán)節(jié)時(shí),考慮到有機(jī)酸、葉綠素、脂質(zhì)和糖類等多種樣品共提物可能對(duì)目標(biāo)分析物定量分析造成干擾以及增加分析儀器維護(hù)頻率,從三種目標(biāo)分析物在三種蔬菜空白樣品中2 mg/kg 的添加水平,考察了QuEChERS 常用C18、NANO、GCB 和PSA 等分散凈化材料的不同質(zhì)量組合對(duì)樣品共提基質(zhì)的凈化效果,發(fā)現(xiàn)適量的C18、PSA 和NANO 對(duì)三種目標(biāo)分析物均無(wú)明顯吸附,且能達(dá)到理想凈化效果,而傳統(tǒng)的GCB 對(duì)目標(biāo)分析物回收率均有一定影響,故在選用凈化劑時(shí),在綜合考慮樣品凈化效果和目標(biāo)分析物提取效率情況下,以50 mg PSA、25 mg C18 和25 mg NANO 作為基質(zhì)分散凈化材料處理樣品提取液.

本研究所建立的即食性蔬菜中氯蟲(chóng)苯甲酰胺、甲基硫菌靈和多菌靈殘留的QuEChER 前處理程序與常規(guī)樣品前處理方法相比大幅度降低了有機(jī)溶劑消耗,與傳統(tǒng)震蕩提取法相比顯著提高了分析樣品制備效率.同時(shí),在UPLC-PDA 分析過(guò)程中,采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量校準(zhǔn),有效降低了樣品基質(zhì)對(duì)殘留檢測(cè)結(jié)果的影響.本研究所開(kāi)發(fā)的殘留分析方法不僅可為三種即食性蔬菜中三種目標(biāo)農(nóng)藥的殘留檢測(cè)和監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支持,還有廣泛的應(yīng)用空間.