劉小元,孟春顏,姬生躍,劉 勇

(1.修武縣農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊(duì),河南 修武 454351;2.中基高科(北京)生物技術(shù)有限公司 ;3.西北農(nóng)林科技大學(xué) )

當(dāng)前,細(xì)菌對抗生素耐藥性問題日益嚴(yán)重,尋找新型替代抗菌劑是解決耐藥性問題的重要途徑,抗菌肽以其特有的優(yōu)勢被看作一種新型抗菌劑而備受關(guān)注。抗菌肽與抗生素比較具有耐環(huán)境因素影響,不易誘發(fā)耐藥性的優(yōu)點(diǎn),當(dāng)前在畜牧業(yè)生產(chǎn)中通過添加抗菌肽作為抑菌、促生長制劑顯示出良好前景。

研究表明,通過在飼料中添加抗菌肽,可以明顯提高動(dòng)物的生長性能,并具有改善免疫力,減少動(dòng)物發(fā)病,提高生長速度和效益的優(yōu)勢。但與抗生素相比,抗菌肽存在細(xì)胞毒性強(qiáng)、抑殺活性不穩(wěn)定、生物學(xué)活性穩(wěn)定性差的問題,需要通過對現(xiàn)有抗菌肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造或設(shè)計(jì)新型抗菌肽,以滿足新型抗菌劑研發(fā)的需要。

為了提高天然抗菌肽的抗菌活性、生物學(xué)穩(wěn)定性并降低細(xì)胞毒性,我們應(yīng)用抗菌肽分子設(shè)計(jì)技術(shù)方案,將蜂毒素和死亡素兩種抗菌肽進(jìn)行了重組,并用3個(gè)色氨酸殘基對特定位點(diǎn)的氨基酸殘基進(jìn)行了替代,獲得了蜂毒素—死亡素重組抗菌肽(MT-W)。初步研究發(fā)現(xiàn)MT-W相較于蜂毒素和死亡素對蛋白酶的穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)、抗菌活性也明顯提高而細(xì)胞毒性顯著下降。

本試驗(yàn)?zāi)康脑谟趯T-W飼喂實(shí)驗(yàn)小鼠,通過檢測實(shí)驗(yàn)鼠的生理生化指標(biāo),血液中MT-W的含量等,綜合評估其對動(dòng)物的潛在毒性,為進(jìn)一步在養(yǎng)殖動(dòng)物中實(shí)驗(yàn)提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蜂毒素-死亡素毒素重組抗菌肽

抗菌肽MT-W通過構(gòu)建的重組芽孢桿菌表達(dá)、提取純化獲得,并經(jīng)冷凍干燥。用生理鹽水配制成100 g/L的母液備用,4°C保存。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物小鼠

昆明系成年小鼠200只,公母各半,平均體重18.5±1.5 g(北京斯貝福生物科技有限公司)。實(shí)驗(yàn)環(huán)境達(dá)到SPF水平,恒溫恒濕(23±1°C、相對濕度60±5%),每日照明12 h,自由采食。

1.3 給小鼠口服急性毒性試驗(yàn)

將50只小鼠隨機(jī)分為5個(gè)組,每組10只,公母各5只。試驗(yàn)組編號為I、II、III和IV,第V組為對照組。試驗(yàn)組小鼠按照600、1 200、2 500和5 000 mg/kg體重,分別口服MT-W稀釋液,每日1次,連續(xù)使用15 d。對照組灌服0.5 mL滅菌生理鹽水。第一次給藥后15 d,禁食1 d后對所有小鼠進(jìn)行稱重,采集血液并分離血清;然后人道處死全部試驗(yàn)鼠,分別對其臟器進(jìn)行采集后稱重,主要包括心、肝、肺、胃、脾和淋巴結(jié);觀察所采臟器的變化;計(jì)算器官與體重的比值;檢測堿性磷酸酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、白蛋白、球蛋白、總蛋白、肌酸酐、血尿素氮、甘油三酯和總膽固醇等生化指標(biāo)。

1.4 小鼠口服生物利用度

將MT-W溶液,按照50 mg/kg體重的劑量給60只小鼠(公母各半)進(jìn)行試驗(yàn)處理,同時(shí)將生理鹽水灌服60只對照組小鼠(公母各半)。從小鼠接受口服灌注開始計(jì)時(shí),在第0.5 h,1 h,2 h,3 h,4 h,6 h,8 h,12 h,16 h和20 h,每組隨機(jī)取出公母各半的6只小鼠用乙醚麻醉,從眼眶靜脈叢采集血樣,并將其放置在肝素管中,2000 r/min離心10 min,將分離的血于-20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

按照Hematyar等的方法進(jìn)行血樣中MT-W的檢測?；静襟E如下:將采集的血樣經(jīng)0.22 μm孔徑濾器(Nucleopore,Costar)過濾。用反相高效液相色譜系統(tǒng)(Agilent Technologies),反相高效液相色譜分析柱Zorbax300SB-C8(250 mm×4.6 mm,5 μm,300 A)(Agilent Technologies)對血樣進(jìn)行處理。用0.1%(v/v)三氟乙酸和10%乙腈平衡色譜柱,然后以0%～60%的乙腈梯度線性展開,流速為1.0 mL/min。監(jiān)測214 nm和280 nm處的吸光度。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

通過t-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05為差異顯著。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 小鼠口服急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組和對照組小鼠灌服不同濃度的MT-W后未出現(xiàn)異常和死亡。且各試驗(yàn)組與對照組相比體重?zé)o差異;小鼠的器官/體重比率也無顯著差異,表明MT-W溶液對小鼠沒有明顯毒副作用。結(jié)果見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)鼠急性毒性試驗(yàn)檢測指標(biāo)匯總表

生化指標(biāo)的檢測結(jié)果表明,灌服MT-W的各組小鼠的主要生化指標(biāo)與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。另外,在內(nèi)臟器官中肉眼未觀察到可見變化。

表2 實(shí)驗(yàn)鼠生化指標(biāo)統(tǒng)計(jì)表

2.2 小鼠口服生物利用度試驗(yàn)結(jié)果

在按照50 mg/kg體重給實(shí)驗(yàn)小鼠灌服MT-W溶液后,10個(gè)檢測時(shí)間點(diǎn)上在血漿中均未檢測到MT-W,提示MT-W未在小鼠血液中殘留。表明MT-W在口服后未被有效吸收,未在血液中累積到可檢測的水平。

3 蜂毒素—死亡素重組抗菌肽(MT-W)試驗(yàn)討論

利用動(dòng)物模型來進(jìn)行毒性分析研究,以評估某種物質(zhì)對人類或生物體健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)。為了評估MT-W的急性毒性,本研究用了小鼠作為動(dòng)物模型,并在15 d的試驗(yàn)中對試驗(yàn)小鼠分別灌注了不同劑量的MT-W。結(jié)果顯示,MT-W在500、1 000、2 000和5 000 mg/kg體重的劑量下,對小鼠無毒性作用,盡管5 000 mg/kg體重劑量的MT-W灌注的雄性小鼠的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和血尿素氮水平有所升高,雌性小鼠的血尿素氮水平有所升高,但這些變化都在正常的生理指標(biāo)波動(dòng)范圍內(nèi)。這表明,MT-W口服后,代謝終產(chǎn)物在小鼠體內(nèi)有所增加,但不會(huì)對其腎臟造成實(shí)質(zhì)性損害。因此,口服MT-W的半致死劑量(LD50)大于5 000 mg/kg/d?？偟膩碚f,在不超過5 000 mg/kg體重劑量的情況下,MT-W對昆明小鼠的急性毒性是可控的,不會(huì)對其造成傷害。

在經(jīng)MT-W單劑量灌注的昆明小鼠進(jìn)行15 d試驗(yàn)后,通過血液樣品分析發(fā)現(xiàn)無法檢測到MT-W,這表明MT-W的生物利用度非常低。口服急性毒性試驗(yàn)和口服生物利用度試驗(yàn)的結(jié)果都表明,MT-W難以以完整的形式進(jìn)入小鼠的血液循環(huán)系統(tǒng)。本研究結(jié)果表明,MT-W的生物利用度較低,其完整形式?jīng)]有在血液循環(huán)系統(tǒng)中檢出。