王璐瑤，張培彤，羅 鉞，黃 蓉，林月潔，王 菁，李 蒙

1 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029； 2 中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053；3 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700

肺癌是最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率均居首位［1］。治療肺癌的手段除了手術(shù)、化學(xué)治療、放射治療、靶向治療及免疫治療外，中醫(yī)藥在預(yù)防腫瘤發(fā)生、減毒增效、減少腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等方面也具有獨(dú)特優(yōu)勢［2］。目前主流觀點(diǎn)認(rèn)為腫瘤患者普遍存在血瘀證，活血化瘀法可抑制腫瘤生長、改善血液高凝狀態(tài)、抑制侵襲和轉(zhuǎn)移、延長患者生存時間并提高生活質(zhì)量［3］。川芎和丹參均屬于臨床上常用的活血藥，作為丹參川芎嗪注射液、丹芎通脈顆粒等活血化瘀藥的重要組成，川芎偏于活血行氣，丹參長于養(yǎng)血活血，兩者相須為用共奏活血化瘀之功。目前研究已證明川芎和丹參兩味中藥均具有抗腫瘤作用［4-6］，但中藥成分復(fù)雜，兩藥配伍存在協(xié)同或拮抗作用，現(xiàn)代研究缺乏對“川芎-丹參”藥對的作用機(jī)制及藥理研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)分析藥物與疾病的關(guān)系［7］。本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對“川芎-丹參”藥對治療肺癌的作用機(jī)制進(jìn)行探討，為臨床應(yīng)用活血化瘀藥物治療肺癌提供理論基礎(chǔ)，為后續(xù)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 “川芎-丹參”藥對活性成分篩選及作用靶點(diǎn)通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫［8］（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索川芎、丹參的活性成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和藥物相似性（drug likeness，DL）≥0.18 作為篩選條件，篩選出活性成分較高的化合物，檢索文獻(xiàn)進(jìn)行補(bǔ)充，獲得蛋白作用靶點(diǎn)，利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫［9］（https：//www.uniprot.org/）對藥物靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化命名。

1.2 肺癌疾病靶點(diǎn)獲取通過GeenCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）檢 索“Lung Cancer”，獲取肺癌疾病靶點(diǎn)。

1.3 藥物活性成分-共同靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用BioVenn 在線軟件［10］將“川芎-丹參”藥對藥物靶點(diǎn)與肺癌疾病靶點(diǎn)取交集得到共同靶點(diǎn)，以Venn 圖的形式展現(xiàn)，將共同靶點(diǎn)與藥物活性成分進(jìn)行匹配，使用Cytoscape 軟件構(gòu)建藥物活性成分-共同靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，篩選出藥物活性成分中與疾病靶點(diǎn)相關(guān)的主要成分作為“川芎-丹參”藥對治療肺癌的主要活性成分。

1.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將共同靶點(diǎn)上傳 至STRING 在 線 平 臺 數(shù) 據(jù) 庫［11］（https：//string-db.org/cgi/input.pl）構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。將蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件，使用CytoHubba 模塊分析獲取網(wǎng)絡(luò)中degreee值排名前10 位的靶點(diǎn)作為“川芎-丹參”治療肺癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)，生成關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.5 功能富集分析與信號通路分析將關(guān)鍵靶點(diǎn) 上 傳 至 Metascape 數(shù) 據(jù) 庫［12］（https：//metascape.org/），以人類為研究對象，進(jìn)行基因本體論功能分析（gene ontology，GO）以獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)的作用過程京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析以了解關(guān)鍵靶點(diǎn)在通路中的分布情況，利用微生信在線工具（http：//www.bioinformatics.com.cn/）對分析結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.6 分子對接通過PDB 數(shù)據(jù)庫［13］（http：//www.rcsb.org/）查找關(guān)鍵靶點(diǎn)中degree 值排名前5的靶點(diǎn)對應(yīng)的蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)，以此為受體；主要活性成分及臨床報(bào)道有效藥物作為配體，利用CB-Dock 網(wǎng) 站［14］（http：//cao.labshare.cn/cbdock/）進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 “川芎-丹參”藥對活性成分及作用靶點(diǎn)利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫分別檢索川芎、丹參，共獲得391個化學(xué)成分，其中川芎189 個、丹參202 個，以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為篩選條件，再結(jié)合文獻(xiàn)研究補(bǔ)充川芎嗪、川芎內(nèi)酯、阿魏酸以及齊墩果酸、丹參素、丹參酮I、原兒茶醛，最終篩選出川芎有效成分10個，丹參有效成分69 個。分別獲取有效成分對應(yīng)的靶點(diǎn)，利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化命名，篩選得到149個預(yù)測靶點(diǎn)。見表1。

表1 “川芎-丹參”藥對活性成分

2.2 肺癌疾病靶點(diǎn)獲取通過GeenCards 數(shù)據(jù)庫獲得肺癌疾病靶點(diǎn)23107 個，通過篩選設(shè)置relevance score≥25.18，最終獲得725個相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 藥物活性成分-交集靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用BioVenn 在線軟件將“川芎-丹參”藥對活性成分對應(yīng)的149 個潛在靶點(diǎn)與肺癌對應(yīng)的725 個疾病靶點(diǎn)取交集，以Venn 圖的形式得到74個共同靶點(diǎn)，見圖1。將74 個共同靶點(diǎn)與藥物活性成分相匹配，得到“川芎-丹參”藥對發(fā)揮抗肺癌作用的藥物活性成分，導(dǎo)入Cytoscape 軟件，得到藥物活性成分-共同靶點(diǎn)-疾病關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，見圖2，計(jì)算degree 值，篩選出排在前五名的成分作為主要活性成分，依次是木犀草素、丹參酮ⅡA、楊梅酮、二氫丹參內(nèi)酯和丹參新醌丁。

圖1 “川芎-丹參”藥對活性成分靶點(diǎn)與肺癌疾病靶點(diǎn)Venn圖

圖2 “藥物活性成分-共同靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

2.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將74 個共同靶點(diǎn)上傳至STRING 在線數(shù)據(jù)庫平臺，以TSV 格式保存蛋白質(zhì)相互關(guān)系，將其導(dǎo)入Cytoscape 軟件，利用CytoHubba 模塊進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，篩選出Degree值排名前10 位的基因靶點(diǎn)，依次是TP53、AKT1、MAPK1、VEGFA、EGFR、MYC、JUN、CASP3、STAT3、ESR1，以此作為“川芎-丹參”藥對治療肺癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)，構(gòu)建關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖3，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的顏色按Degree值從高到低，由紅色向黃色漸變。

圖3 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO 功能和KEGG 通路富集分析通過Metascape 數(shù)據(jù)庫對10 個關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，以P＜0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得GO生物過程條目385 條，GO 細(xì) 胞 組 分11 個，GO 分 子 功 能17 個，KEGG相關(guān)信號通路139條。分別篩選3種GO功能分析結(jié)果中排名前10 的條目，進(jìn)行可視化，見圖4。KEGG通路富集去除廣泛通路后取前20條信號通路進(jìn)行可視化，見圖5，主要涉及到MAPK信號通路、PI3K-Akt 信號通路、Thyroid hormone 信號通路等。

圖4 GO功能富集分析

圖5 KEGG通路富集分析

2.6 分子對接CB-Dock 網(wǎng)站可預(yù)測給定蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)，使用基于曲率的新型腔檢測方法計(jì)算中心和大小，執(zhí)行AutoDock Vina 分子對接［15］。Vina 得分值越低代表受體和配體親和力越高，空腔尺寸接近或大于配體表明對接準(zhǔn)確性更高。吉非替尼作為表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑，改善EGFR 突變陽性肺癌患者的無進(jìn)展生存期優(yōu)于一線和二線化療藥物［16］，故將吉非替尼與“川芎-丹參”藥對主要活性成分進(jìn)行比較。對接結(jié)果提示，親和力最高的前5 位分別是吉非替尼和雌激素受體1、吉非替尼和絲裂原活化蛋白激酶1、丹參酮ⅡA 和骨髓細(xì)胞增多癥病毒癌基因（myelocytomatosis viral oncogene，MYC）蛋白、丹參新醌丁和MYC蛋白以及楊梅酮和雌激素受體1。見表2、圖6。

圖6 Vina得分最低的前5種對接模式

表2 主要活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對接結(jié)果

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步篩選出“川芎-丹參”藥對與肺癌相關(guān)的主要活性成分是木犀草素、丹參酮IIA、楊梅酮、二氫丹參內(nèi)酯和丹參新醌丁。研究證明，木犀草素通過上調(diào)Caspase-3的表達(dá)同時抑制磷酸化蛋白激酶（Phospho-Akt，p-Akt）、基質(zhì)金屬蛋白酶2 的表達(dá)，抑制Src/FAK 及其下游Rac1、Cdc42 和RhoA 信號傳導(dǎo)途徑來抑制肺癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移［17-18］。丹參酮ⅡA通過上調(diào)P27的表達(dá)，誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞周期S期發(fā)生阻滯，聯(lián)合順鉑則通過下調(diào)PI3K/Akt 信號通路在體內(nèi)外協(xié)同抑制非小細(xì)胞肺癌，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗肺癌作用［19-20］。楊梅酮亦具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的能力，能顯著增加肺腺癌細(xì)胞早期凋亡率，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期［21-22］。但目前對二氫丹參內(nèi)酯和丹參新醌丁的抗肺癌作用研究報(bào)道相對較少，值得進(jìn)一步探究。根據(jù)藥物主要活性成分，楊梅酮來源于川芎，其余均來源于丹參，初步推斷藥對中丹參發(fā)揮的抗肺癌作用更大，而兩藥相須為用能增加其抗肺癌作用。

根據(jù)關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)可知，“川芎-丹參”藥對主要是作用于TP53 基因（tumor protein P53，TP53）、絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶1（serine/threonine kinase 1，AKT1）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）等關(guān)鍵靶點(diǎn)，從而發(fā)揮抗肺癌作用。通過分子對接驗(yàn)證了關(guān)鍵靶點(diǎn)與主要活性成分均有較好的對接活性，表明“川芎-丹參”藥對主要活性成分能對關(guān)鍵靶點(diǎn)發(fā)揮調(diào)控作用。抑癌基因TP53 是人類腫瘤中最常見的突變基因，其功能的喪失可加速肺癌中驅(qū)動癌基因的轉(zhuǎn)化潛能，并阻礙腫瘤對細(xì)胞毒性化學(xué)療法、放療及表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抑制劑的反應(yīng)［23-25］。AKT1 在包括肺癌在內(nèi)的許多癌癥中變得高度活化，在調(diào)節(jié)異常細(xì)胞增殖、抑制程序性細(xì)胞死亡、端粒酶活化及促進(jìn)血管生成和腫瘤細(xì)胞侵襲等方面發(fā)揮重要作用［26-27］。在肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤組織中均可檢測出MAPK1 的活化或高表達(dá)，研究證明miR-105-5p 通過下調(diào)MAPK1 抑制肺癌細(xì)胞［28］。

通過KEGG 通路富集分析，發(fā)現(xiàn)“川芎-丹參”藥對與肺癌相關(guān)度排名前三名的信號通路分別是MAPK、PI3K-Akt 和Thyroid hormone。經(jīng) 典 的MAPK 通路是由ERK1/2 信號傳導(dǎo)蛋白介導(dǎo)的，ERK被激活將通過轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，激活轉(zhuǎn)錄因子和激酶等，參與調(diào)控細(xì)胞周期、增殖、分化、凋亡等多種生理過程［29］。研究證明，川芎嗪能下調(diào)MAPK 通路中ERK 的表達(dá)并升高JNK 和P-38 的表達(dá)，促進(jìn)肺癌順鉑耐藥細(xì)胞株凋亡［30］。PI3K-Akt 通路與腫瘤細(xì)胞治療抗拒、增殖凋亡、周期調(diào)控、侵襲轉(zhuǎn)移及血管形成等過程密切相關(guān)，Akt 是PI3K 下游關(guān)鍵蛋白，Akt 被激活可使下游靶點(diǎn)mTOR 發(fā)生磷酸化，被活化的mTOR 可調(diào)控其上游癌基因及抑癌基因的表達(dá)水平，干預(yù)腫瘤生長［31-32］。甲狀腺激素通過與αvβ3 整聯(lián)蛋白上的TR 相互作用來調(diào)節(jié)腫瘤增殖，刺激MAPK/ERK1/2 信號的激活，加速肺癌轉(zhuǎn)移和進(jìn)展［33］。

本研究主要運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對“川芎-丹參”藥對治療肺癌的作用機(jī)制進(jìn)行探究，證明“川芎-丹參”藥對通過木犀草素、丹參酮IIA、楊梅酮等多種活性成分，主要作用于TP53、AKT1、MAPK1 等 關(guān) 鍵 靶 點(diǎn)，調(diào) 節(jié)MAPK、PI3K-Akt、Thyroid hormone 等多條信號通路，主要通過調(diào)控細(xì)胞增殖凋亡、抑制侵襲轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮抗肺癌作用?！按ㄜ?丹參”藥對治療肺癌的作用機(jī)制具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，為臨床運(yùn)用活血化瘀法治療肺癌提供理論依據(jù)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法存在局限性，它主要用于預(yù)測分析，而臨床藥效與藥物劑量、劑型及煎藥時間等多種因素有關(guān)，得到的研究結(jié)論需通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。