劉 寧，徐展望，王明喜，譚國(guó)慶△

1 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250035； 2 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250035

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)侵襲性炎癥為特征的全身免疫性疾病，可造成關(guān)節(jié)對(duì)稱(chēng)性骨組織破壞，甚至導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能障礙，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［1］，但是目前RA的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚［2］。強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）同樣屬于慢性炎癥性風(fēng)濕免疫疾病，常累及骶髂及中軸關(guān)節(jié)，后期出現(xiàn)“竹節(jié)樣”改變、活動(dòng)障礙、慢性疼痛等癥狀，同樣存在軟骨變形、骨破壞等表現(xiàn)，具有較高致殘率［3］。RA 與AS 是臨床最常見(jiàn)的慢性風(fēng)濕骨科疾病，給患者及社會(huì)帶來(lái)深重負(fù)擔(dān)，但免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素、生物制劑等臨床常用藥物均存在不同程度不良反應(yīng)［4］，因此尋找安全有效的治療方法迫在眉睫。而近年來(lái)隨著中醫(yī)藥的不斷發(fā)展，中藥組方在治療RA 及AS 方面取得良好療效，并且安全性得到廣泛認(rèn)可。

《素問(wèn)·痹論篇》指出：“風(fēng)、寒、濕三氣雜至，合而為痹。”風(fēng)寒濕等邪氣痹阻經(jīng)絡(luò)關(guān)節(jié)，影響氣血運(yùn)行，導(dǎo)致筋骨慢性疼痛，RA 及AS 均可歸為中醫(yī)“痹證”范疇。蠲痹湯出自《醫(yī)學(xué)心悟》，由羌活、獨(dú)活、肉桂、秦艽、當(dāng)歸、川芎、甘草、海風(fēng)藤、桑枝、乳香、木香等藥物組成。方中羌活、獨(dú)活、秦艽、海風(fēng)藤、桑枝祛風(fēng)除濕，肉桂溫通經(jīng)脈、散寒止痛，當(dāng)歸、乳香、川芎、木香養(yǎng)血活血、行氣止痛，甘草調(diào)和諸藥。全方祛風(fēng)除濕，蠲痹止痛。近年來(lái)，蠲痹湯隨證加減在臨床治療“痹證”過(guò)程中取得顯著療效［5］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整體、系統(tǒng)的特點(diǎn)符合中醫(yī)整體觀(guān)及辨證論治理論，為進(jìn)一步挖掘中藥藥理作用機(jī)制提供了科學(xué)方法［6］。RA 及AS 在發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有共同的病因病機(jī)。本研究基于中醫(yī)“異病同治”理論，依托網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)技術(shù)方法探討蠲痹湯干預(yù)RA及AS的可能作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 RA 與AS 靶基因預(yù)測(cè)以“rheumatoid arthritis”“ankylosing spondylitis”作為 關(guān)鍵詞，在疾病基因數(shù)據(jù)庫(kù)（DisGeNET），人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCards），人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM），綜合型藥物數(shù)據(jù)庫(kù)（DrugBank）以及治療靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)（TTD）等5 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)RA 及AS 已知靶基因進(jìn)行檢索與篩選，合并各數(shù)據(jù)庫(kù)的疾病靶基因，可獲得已明確的疾病靶點(diǎn)。

1.2 蠲痹湯有效成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database platform，TCMSP）上，以蠲痹湯11 味中藥檢索其化學(xué)成分、口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類(lèi)藥性（drug likeness，DL）≥0.18、藥物對(duì)小腸上皮細(xì)胞的穿透性（caco-2）≥-0.4、180≤分子量（MW）≤500、脫水分配系數(shù)（AlogP）＜5 作為活性化合物的篩選條件［7］，對(duì)具有較高活性的化合物進(jìn)行篩選提取，將得到的活性成分通過(guò)有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)（PubChem）獲得相對(duì)應(yīng)的SMILES 及2D 結(jié)構(gòu)，并將2D 結(jié)構(gòu)保存為sdf 格式。后將結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Swiss Target Prediction 及DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，相似性閾值取為0.85，并把人類(lèi)基因型作為條件篩查。導(dǎo)入蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（Unitprot）進(jìn)行基因的標(biāo)準(zhǔn)化處理。利用Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建其有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 蠲痹湯治療RA與AS的關(guān)鍵靶基因篩選將篩選出的蠲痹湯潛在靶基因與“1.1”項(xiàng)獲取的疾病靶基因交叉生成Venny 圖，得出蠲痹湯治療RA與AS 的映射靶基因，并借助Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)節(jié)點(diǎn)連接度（degree）值的大小進(jìn)行篩選，得到蠲痹湯治療RA與AS 的核心靶基因，所獲取的靶基因則是同時(shí)對(duì)RA與AS起到調(diào)控作用的核心靶點(diǎn)，揭示出蠲痹湯干預(yù)RA及AS的可能作用機(jī)制。

1.4 生物通路及富集分析將“1.3”項(xiàng)篩選出的核心靶基因?qū)牖蚬δ茏⑨寯?shù)據(jù)庫(kù)（DAVID），進(jìn)行基因和基因組的京都百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析及基因本體論（gene ontology，GO）生物過(guò)程的富集分析。以P≤0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，分別將篩選出的前20 個(gè)GO 條目與KEGG 條目借助OmicShare 云平臺(tái)繪制富集分析氣泡圖。

2 結(jié)果

經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出153個(gè)活性成分，其中大于平均自由度的活性成分76 個(gè)，見(jiàn)表1。具有137 個(gè)靶點(diǎn)，活性物質(zhì)-靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖1。經(jīng)相關(guān)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)搜索查重后，共選出RA與AS已知靶基因分別為729個(gè)、188個(gè)。映射出關(guān)鍵靶點(diǎn)23個(gè)，生成韋恩圖，見(jiàn)圖2。依托Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建相互作用PPI 網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3，平均節(jié)點(diǎn)連接度（degree）為10.3，以degree≥11 篩選到核心靶點(diǎn)10個(gè)。經(jīng)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)獲得119項(xiàng)GO富集結(jié)果及32 條KEGG 信號(hào)通路，通路下所含靶點(diǎn)見(jiàn)表2。以P值升序排列，分別篩選出符合條件的20個(gè)生物過(guò)程和信號(hào)通路，并將其以氣泡圖的形式展現(xiàn)出來(lái)，見(jiàn)圖4—5。

圖1 活性物質(zhì)-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 映射靶點(diǎn)韋恩圖

圖3 關(guān)鍵靶點(diǎn)相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 GO富集分析氣泡圖（前20條）

圖5 KEGG通路分析氣泡圖（前20條）

表1 活性成分表

表2 KEGG通路下所含靶基因（前20條）

3 討論

TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)能夠充分挖掘中藥潛在活性成分，通過(guò)相關(guān)參數(shù)篩選認(rèn)為槲皮素、山柰酚、芒柄花黃素等是蠲痹湯的主要活性成分，基于“異病同治”理論，以上活性物質(zhì)均可有效作用于RA 與AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。槲皮素（quercetin）是具有抗氧化、抗炎作用的天然黃酮類(lèi)物質(zhì)，在各種骨關(guān)節(jié)炎癥中具有顯著作用。研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型關(guān)節(jié)腔液及軟骨中IL-1β、MMP-13 等炎癥相關(guān)因子水平表達(dá)升高，誘導(dǎo)了軟骨細(xì)胞凋亡，而槲皮素抑制NF-κB 激活后會(huì)改善相關(guān)炎癥環(huán)境，減少細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)軟骨的作用［8］。此外滑膜成纖維細(xì)胞的異常增殖也會(huì)造成炎癥介質(zhì)釋放及浸潤(rùn)，降解細(xì)胞外基質(zhì)，造成軟骨和骨質(zhì)的損害。PAN等［9］研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過(guò)上調(diào)長(zhǎng)鏈非編碼RNA MALAT1 表達(dá)，誘導(dǎo)滑膜成纖維細(xì)胞的凋亡過(guò)程，達(dá)到改善RA 癥狀保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的目的。AS同樣是一種長(zhǎng)期慢性炎性疾病，各種免疫因子、炎癥細(xì)胞在A(yíng)S 發(fā)病過(guò)程中具有重要作用［10］。研究發(fā)現(xiàn)AS 患者骶髂關(guān)節(jié)腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）呈高度表達(dá)，長(zhǎng)期炎癥刺激引起椎板間小關(guān)節(jié)融合，同時(shí)韌帶炎癥復(fù)合物堆積引起腰背痛及晨僵［11］。研究顯示，槲皮素同樣能夠下調(diào)RAFLS 的活性，抑制其增殖及遷移，進(jìn)而降低T 細(xì)胞所介導(dǎo)的炎性因子釋放，有效改善關(guān)節(jié)炎癥狀［12］。山柰酚的抗炎作用同樣明顯，通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥基因轉(zhuǎn)錄及促炎酶活性，抑制轉(zhuǎn)錄因子、黏附分子表達(dá)調(diào)節(jié)炎癥水平［13］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，山柰酚可通過(guò)上調(diào)叉頭框蛋白P3（forkhead box protein P3，F(xiàn)OXP3）表達(dá)水平改善膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎癥狀，同時(shí)山柰酚減少FOXP3磷酸化，可能是山柰酚在預(yù)防和治療RA與AS等炎癥性疾病中的基礎(chǔ)［14］。

通過(guò)PP網(wǎng)絡(luò)可以看出靶點(diǎn)間具有復(fù)雜協(xié)同作用，干預(yù)RA與AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，TNF、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGF）、白細(xì)胞介素6（Interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素1B（Interleukin-1B，IL-1B）等核心靶點(diǎn)具有較高自由度，可能起到關(guān)鍵作用。IL-6 拮抗劑在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎臨床應(yīng)用中的良好療效說(shuō)明了IL-6 在RA 中的重要地位。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6 在RA關(guān)節(jié)液中檢測(cè)到極高活性，其一方面促進(jìn)RAFLS增殖，發(fā)生炎性浸潤(rùn)及軟骨損傷；另一方面能夠增強(qiáng)白細(xì)胞介素1（Interleukin-1，IL-1）在RA 中的相關(guān)生物活性［15］。IL-1 主要由滑膜細(xì)胞產(chǎn)生，能夠誘導(dǎo)滑膜、軟骨細(xì)胞合成前列腺素E2和膠原酶，引發(fā)軟骨破壞。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，IL-1是AS的易感基因，AS 患者體內(nèi)IL-1 水平明顯高于對(duì)照組，同時(shí)IL-1B 因?yàn)槟軌蚍置谟诩?xì)胞外部，遠(yuǎn)距離作用于靶細(xì)胞，所以在A(yíng)S 炎癥中具有重要作用［16］。而IL-6 是T 細(xì)胞亞群分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，能夠持續(xù)誘導(dǎo)Th17細(xì)胞產(chǎn)生，參與AS免疫調(diào)節(jié)及免疫病理過(guò)程［17］。TNF-α 在炎癥反應(yīng)中重要的促炎及免疫調(diào)節(jié)因子，TNF-α 的表達(dá)與IL-1、IL-6 呈正相關(guān)，當(dāng)TNF-α 表達(dá)受抑制時(shí)，IL-1、IL-6 的產(chǎn)生也會(huì)相對(duì)減少［18］。TNF-α也能發(fā)揮類(lèi)似IL-1生理作用，通過(guò)影響COX 對(duì)前列腺素的合成來(lái)抑制RA。TNF-α 也被認(rèn)為是AS 的關(guān)鍵因子，因?yàn)樵贏(yíng)S 患者骶髂關(guān)節(jié)部位存在明顯炎性浸潤(rùn)及TNF-α 水平升高［19］。除上述討論外，血管生成構(gòu)建也伴隨兩種疾病的發(fā)生發(fā)展。

AS 的早期病理變化是小關(guān)節(jié)滑膜炎，而此期間的滑膜翳生成、滑膜細(xì)胞增生均與血管通透性增加、血管過(guò)度增生有關(guān)［20］，VEGFA 的表達(dá)能夠調(diào)控血管生成與通透性。馬莉等［21］研究發(fā)現(xiàn)，VEGF主要參與滑膜翳生成，血管通透性增加在滑膜細(xì)胞增生方面其重要調(diào)控作用?；枭赏瑯悠毡榇嬖谟赗A 患者，并且其微環(huán)境主要特征是缺氧，血管構(gòu)建及通透性增加能夠從一定程度上改善缺氧狀態(tài)。綜上所述，蠲痹湯通過(guò)多靶點(diǎn)“異病同治”RA 與AS，并且眾多炎癥因子協(xié)同作用調(diào)控體內(nèi)炎癥氧化水平是治療的關(guān)鍵。

靶點(diǎn)間相互聯(lián)系進(jìn)而調(diào)控體內(nèi)多種生物過(guò)程，并且通過(guò)通路產(chǎn)生聯(lián)級(jí)反應(yīng)干預(yù)疾病過(guò)程。富集分析發(fā)現(xiàn)蠲痹湯“異病同治”RA 與AS 還涉及一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、降鈣素1-單加氧酶活性的正調(diào)控等多個(gè)生物過(guò)程。KEGG 通路分析也發(fā)現(xiàn)除非特異性通路外TNF 信號(hào)通路、NOD 樣受體通路、Toll 樣受體通路、HIF-1 信號(hào)通路等多條通路在RA 與AS 中具有重要作用。TNF 信號(hào)通路是典型的炎癥通路，IL-6、IL-1B、TNF 等多種炎性因子均是其通路下游靶點(diǎn)，并通過(guò)相互協(xié)同作用調(diào)控體內(nèi)氧化應(yīng)激水平及炎癥反應(yīng)，干預(yù)RA與AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程。先天性免疫應(yīng)答是機(jī)體抗炎癥免疫的首要防線(xiàn)，NOD 樣受體及TOLL 樣受體是其兩種非特異性的模式識(shí)別受體。NOD 樣受體主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)調(diào)控炎癥反應(yīng)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過(guò)NOD1/NOD2 能夠增強(qiáng)NOD 樣受體激動(dòng)劑所有誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素分泌，進(jìn)一步調(diào)節(jié)Th1、Th2 和Th17細(xì)胞的炎癥免疫［22］。此外NOD 樣受體通路還能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)NF-κB 通路、MAPK 通路誘導(dǎo)CCL2 的分泌，調(diào)節(jié)T細(xì)胞應(yīng)答［23］。Toll樣受體主要集中于細(xì)胞膜表面，同樣能夠激活NF-κB 通路、MAPK 通路分泌IL-1、IL-6、TNF-α等多種炎性因子，同時(shí)激活T細(xì)胞參與滑膜炎性反應(yīng)及骨破壞［24］。因此下調(diào)NOD樣受體通路、Toll樣受體通路可能成為治療RA與AS的關(guān)鍵。缺氧是RA典型的微環(huán)境，而低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）能夠調(diào)節(jié)低氧環(huán)境適應(yīng)性，進(jìn)而調(diào)控RA 患者滑膜炎癥以及軟骨破壞等生物過(guò)程［25］。HIF-1α 不僅能夠通過(guò)調(diào)控一系列趨化因子促進(jìn)纖維滑膜細(xì)胞遷移增殖，同時(shí)還能夠增強(qiáng)Toll 樣受體先天免疫功能發(fā)揮作用，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)［26］。在強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)展過(guò)程中，炎性反應(yīng)浸潤(rùn)導(dǎo)致局部缺氧，從而導(dǎo)致血管新生，改善缺氧又促進(jìn)炎性因子遷移浸潤(rùn)。HIF-1在A(yíng)S病程中主要調(diào)控以下方面：關(guān)節(jié)滑膜新生、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、參與局部病變等。綜上所述，蠲痹湯通過(guò)多條炎癥相關(guān)通路能夠同時(shí)治療RA 與AS 兩種疾病，起到“異病同治”的治療作用。

從中醫(yī)角度來(lái)看，不同疾病在發(fā)展的不同階段會(huì)產(chǎn)生相同或相近的病理變化，根據(jù)辨證論治的原則，治法也就相同，稱(chēng)為“異病同治”。炎癥反應(yīng)及體內(nèi)氧化應(yīng)激普遍存在于RA 與AS 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，而本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)較為科學(xué)的發(fā)現(xiàn)蠲痹湯眾多活性物質(zhì)均是通過(guò)誘導(dǎo)相關(guān)炎癥靶點(diǎn)作用于多條特異性通路來(lái)調(diào)節(jié)體內(nèi)炎癥水平，達(dá)到改善RA與AS臨床癥狀的治療目的。