陳家鑫 肖冰穎 鄭 濤 林小惠 陳子春 林敏華

1 寧德師范學(xué)院附屬寧德市醫(yī)院藥學(xué)部,福建省寧德市 352100; 2 寧德師范學(xué)院閩東畬藥有效成分研究協(xié)同創(chuàng)新中心; 3 福建醫(yī)科大學(xué)研究生院; 4 寧德師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(Coronary heart disease,CHD)是指由于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化使管腔狹窄或閉塞導(dǎo)致心肌缺血、缺氧或壞死而引發(fā)的心臟病[1],簡(jiǎn)稱(chēng)冠心病,且其死亡率依然居高不下[2]。

畬藥是畬族人民通過(guò)長(zhǎng)期與疾病斗爭(zhēng)中總結(jié)出的醫(yī)藥瑰寶[3]。鹽膚木(Rhus chinensis Mill.)系畬族常用藥材,畬藥名為鹽芋根,臨床用于治療冠心病[4]。目前鮮見(jiàn)關(guān)于鹽膚木治療冠心病作用機(jī)制的研究報(bào)道,大多聚焦于對(duì)鹽膚木化學(xué)成分的分離鑒定以及粗提液的藥理活性研究,其治療冠心病的有效成分和作用機(jī)制尚不明確。

本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法,探究鹽膚木治療冠心病的關(guān)鍵活性成分、核心作用靶點(diǎn)及相關(guān)信號(hào)通路,為畬藥科學(xué)內(nèi)涵提供參考,以期促進(jìn)鹽膚木的二次開(kāi)發(fā)與推廣應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 鹽膚木主要活性成分獲取及篩選 基于文獻(xiàn)資料[5]獲取鹽膚木治療冠心病的主要活性成分,利用SwissADME數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swissadme.ch/index.php/)檢索活性化合物藥物代謝信息,并以類(lèi)藥性中至少有兩個(gè)yes且GI absorption為high作為主要評(píng)價(jià)指標(biāo),篩選鹽膚木治療冠心病的潛在藥效成分。

1.2 鹽膚木主要活性成分作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下載鹽膚木主要活性成分的SMILES結(jié)構(gòu)文件,并上傳至Swiss Target Prediction(http://swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫(kù),以Probability>0為主要篩選參數(shù),收集鹽膚木主要活性成分的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 冠心病相關(guān)靶點(diǎn)獲取 以“coronary heart disease”為關(guān)鍵詞檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org/)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://go.drugbank.com/)、Pharm GKB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pharmgkb.org/),以及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://ncbi.nlm.nih.gov/)獲取冠心病的相關(guān)靶點(diǎn),將以上數(shù)據(jù)庫(kù)得到的所有靶點(diǎn)合并后去除重復(fù)靶點(diǎn),得到冠心病相關(guān)的疾病靶點(diǎn)基因。

1.4 “成分—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用“VennDiagram”R 4.1.3語(yǔ)言包將鹽膚木主要活性成分的潛在作用靶點(diǎn)與冠心病相關(guān)疾病靶點(diǎn)取交集,獲得鹽膚木治療冠心病的潛在作用靶點(diǎn)并繪制韋恩圖。將活性化合物及交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.2中,構(gòu)建鹽膚木活性成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。使用CytoHubba插件進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析,以度值(Degree值)為評(píng)價(jià)參數(shù),篩選鹽膚木治療冠心病的關(guān)鍵活性化合物。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將交集靶點(diǎn)輸入至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cn.string-db.org/),設(shè)置篩選參數(shù)為:(1)生物種類(lèi)為“Homo sapiens”;(2)置信度>0.96;其余參數(shù)保持默認(rèn)值不變,隱藏網(wǎng)絡(luò)中無(wú)關(guān)聯(lián)節(jié)點(diǎn),構(gòu)建蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系(Protein-Protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)圖。所得結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件,通過(guò)Cytoscape-CytoNCA進(jìn)行拓?fù)浞治?篩選鹽膚木治療冠心病的關(guān)鍵靶點(diǎn),按Degree值對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行排序。

1.6 KEGG通路富集分析與GO功能富集分析 基于DAVID(https://david.ncifcrf.gov/,DAVID 6.8)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鹽膚木治療冠心病的潛在作用靶點(diǎn)的京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析和基因本體(Gene ontology,GO)功能富集分析,限定物種為“Homo sapiens”,以篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)的重要分子功能或信號(hào)通路。并使用R 4.1.3根據(jù)所得結(jié)果繪制柱形圖、氣泡圖等。

1.7 分子對(duì)接 利用藥物分子靶點(diǎn)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得鹽膚木活性成分的三維結(jié)構(gòu),利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)獲得核心靶點(diǎn)蛋白的三維結(jié)構(gòu)。根據(jù)以下條件進(jìn)行篩選:(1)生物種類(lèi)為“Homo sapiens”;(2)通過(guò)X射線(xiàn)衍射得到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu);(3)蛋白質(zhì)的晶體分辨率<3 ?(1?=10-10m)。AutoDock 1.5.6分子對(duì)接軟件實(shí)現(xiàn)靶點(diǎn)蛋白加氫、加電荷等處理,通過(guò)Autogrid 4插件設(shè)置網(wǎng)格框坐標(biāo),蛋白設(shè)置為剛性、配體設(shè)置為柔性進(jìn)行對(duì)接,計(jì)算結(jié)合能。采用PyMol 2.3.2軟件可視化展示分子對(duì)接結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 鹽膚木主要活性成分篩選及其作用靶點(diǎn) 本研究通過(guò)文獻(xiàn)得到鹽膚木成分化合物46個(gè),設(shè)置“類(lèi)藥性5項(xiàng)指標(biāo)符合2項(xiàng)yes及以上且GI absorption為high”作為篩選條件,最終獲得主要活性化合物16個(gè),見(jiàn)表1。而后利用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)鹽膚木主要活性化合物的調(diào)控靶點(diǎn)信息,匯總?cè)〔⒓蠊埠Y選出對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)397個(gè)。

表1 鹽膚木主要活性化合物

2.2 鹽膚木治療冠心病的潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 在GeneCards、NCBI、OMIM、DrugBank和PharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)中分別檢索到7 426、427、339、68和64個(gè)冠心病的潛在靶點(diǎn),去掉808個(gè)重復(fù)靶點(diǎn)后,獲得7 516個(gè)冠心病相關(guān)靶點(diǎn)。將鹽膚木主要活性成分調(diào)控的靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集,獲得276個(gè)潛在治療靶點(diǎn),見(jiàn)圖1。

圖1 鹽膚木與冠心病交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 鹽膚木活性成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運(yùn)用Cytoscape 3.9.2軟件構(gòu)建“成分—靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖2),網(wǎng)絡(luò)共166個(gè)節(jié)點(diǎn),602條邊。圖中圓形節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn),菱形節(jié)點(diǎn)代表候選化合物,而邊表示靶點(diǎn)與化合物的相互作用關(guān)系,度值表示該節(jié)點(diǎn)所連接邊的數(shù)量,度值越大提示節(jié)點(diǎn)樞紐性越強(qiáng)。因此,以度值為評(píng)價(jià)參數(shù),篩選鹽膚木治療冠心病的核心成分,結(jié)果顯示Caffeic acid(咖啡酸)、Butin(紫鉚素)、Phloretin(根皮素)、Ellagic acid(鞣花酸)、Quercetin(槲皮素)等化合物在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用,可能是鹽膚木治療冠心病的關(guān)鍵活性成分。

圖2 鹽膚木治療冠心病的“成分—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 鹽膚木與冠心病交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在STRING平臺(tái)將276個(gè)交集基因進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析,將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.2實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)可視化處理,見(jiàn)圖3。網(wǎng)絡(luò)共有207個(gè)節(jié)點(diǎn),712條邊,黃色節(jié)點(diǎn)為Degree值較高的關(guān)鍵靶點(diǎn),結(jié)果顯示潛在作用靶點(diǎn)之間具有良好的關(guān)聯(lián)性。通過(guò)Cytoscape-CytoNCA拓?fù)浞治龊Y選核心靶點(diǎn),拓?fù)鋮?shù)分析見(jiàn)表2,可視化結(jié)果見(jiàn)圖4。節(jié)點(diǎn)大小、顏色深淺與Degree值呈正相關(guān)。節(jié)點(diǎn)越大,顏色越深,則Degree值越高,表明在PPI網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要的聯(lián)系作用。結(jié)果顯示,Degree值排名前10位的核心靶點(diǎn)依次為SRC、HSP90AA1、STAT3、MAPK1、PIK3R1、AKT1、PIK3CA、EGFR、EP300、ESR1,提示以上蛋白可能是鹽膚木治療冠心病的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

圖4 拓?fù)浞治龊诵陌悬c(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表2 PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)拓?fù)鋮?shù)分析

2.5 GO和KEGG富集分析 基于R 4.1.3使用Bioconductor生物信息軟件包運(yùn)行GO功能與KEGG通路富集分析。GO功能富集分析結(jié)果顯示,交集基因集合共富集2 600條生物過(guò)程,涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)、對(duì)氧含量的反應(yīng)、MAPK級(jí)聯(lián)的正調(diào)控等;共富集110條細(xì)胞組分,涉及膜筏、膜微區(qū)、細(xì)胞頂端等;共富集282條分子功能,涉及跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性等。將P<0.05作為篩選條件,各選取排名前10的條目繪制柱狀圖(見(jiàn)圖5左)。同時(shí),KEGG信號(hào)通路富集分析共獲得171條富集結(jié)果,根據(jù)基因命中數(shù)和P值從中選取排名前20的通路,結(jié)果顯示鹽膚木治療冠心病主要涉及PI3K/Akt信號(hào)通路(PI3K/Akt signaling pathway)、神經(jīng)活性配體—受體相互作用(Neuroactive ligand-receptorinteraction)、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化(Lipid and atherosclerosis)以及鈣信號(hào)通路(Calcium signaling pathway)等(見(jiàn)圖5右)。

圖5 GO功能富集分析(左)及KEGG通路富集分析(右)

2.6 分子對(duì)接 分子配體與受體結(jié)合能越低,構(gòu)象越穩(wěn)定,發(fā)生相互作用的可能性也越大。一般認(rèn)為結(jié)合能≤-5kJ/mol,分子對(duì)接結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,有較好的結(jié)合活性,若<-7kJ/mol則有強(qiáng)烈的結(jié)合活性。根據(jù)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果對(duì)篩選出的核心成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接,結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示鹽膚木中的核心化合物與PPI核心靶蛋白結(jié)合能均<-5kJ/mol。除Caffeic acid-AKT1對(duì)接模型中不存在氫鍵,其余模型均存在分子間氫鍵,配體與受體形成氫鍵數(shù)目越多,其構(gòu)象越穩(wěn)定。其中Quercetin-AKT1、Ellagic acid-AKT1、Quercetin-SRC、Ellagic acid-SRC,Phloretin-STAT3、Butin-STAT3結(jié)合活性較好,具體對(duì)接模式見(jiàn)圖6。

圖6 6個(gè)最優(yōu)的核心成分—靶點(diǎn)結(jié)合模式圖

表3 核心成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

鹽膚木是閩產(chǎn)特色畬族藥材,最早記載于《山海經(jīng)》,其根、葉、花及果均可入藥,單味即可成方。現(xiàn)代藥理研究表明,鹽膚木根提取物能顯著改善冠心病。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)鹽膚木治療冠心病的核心成分、作用靶點(diǎn)與相關(guān)通路進(jìn)行挖掘,探究其可能的分子機(jī)制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ),并采用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行初步驗(yàn)證。最終篩選鹽膚木治療冠心病的核心成分5個(gè)與核心靶點(diǎn)3個(gè),涉及GO功能條目3 000余條與KEGG通路條目171條,表明鹽膚木治療冠心病可能是多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的結(jié)果。

基于“成分—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?提示咖啡酸、紫鉚素、根皮素、鞣花酸和槲皮素等可能是鹽膚木治療冠心病的主要活性成分。其中,咖啡酸與鞣花酸屬于酚酸類(lèi)成分,紫鉚素、根皮素、槲皮素屬于黃酮類(lèi)成分,由此推測(cè)鹽膚木抗心肌缺血的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)可能為酚酸類(lèi)和黃酮類(lèi),這與既往藥理研究結(jié)果基本吻合?？Х人崾侵参矬w內(nèi)廣泛分布的次級(jí)代謝產(chǎn)物,可提高心肌缺血大鼠模型的心臟射血分?jǐn)?shù),顯著提高短軸縮短率,抑制心肌纖維化,其機(jī)制可能與抑制巨噬細(xì)胞炎癥有關(guān)。鞣花酸為一類(lèi)天然多酚類(lèi)化合物,是沒(méi)食子酸的二聚衍生物,通過(guò)抑制炎癥、減輕氧化應(yīng)激、減少血小板聚集、改善脂代謝來(lái)發(fā)揮抗心肌梗死作用,研究表明其可激活p-AMPK,調(diào)節(jié)下游蛋白p-mTORC1及p-p70S6K的表達(dá),從而保護(hù)心肌免受脂毒性損傷[6-7]。紫鉚素又名漆黃素,為黃酮多酚化合物,在多種疾病中表現(xiàn)出抗炎、抗氧化應(yīng)激和抗血管生成的特性,可通過(guò)激活Nrf2/ARE信號(hào)通路,顯著減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌損傷,對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的線(xiàn)粒體功能障礙具有顯著保護(hù)作用[8]。根皮素屬于黃酮類(lèi)家族中的二氫查耳酮,可抑制Akt/NF-κB信號(hào)通路,降低TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子水平,并通過(guò)直接與Keap1蛋白結(jié)合,促使Nrf2從Nrf2-Keap1復(fù)合物上解離活化,上調(diào)機(jī)體抗氧化酶SOD、GSH活性,發(fā)揮預(yù)防心肌炎癥、氧化應(yīng)激和纖維化反應(yīng)的保護(hù)作用[9]。槲皮素作為分布和研究最廣泛的多羥基黃酮類(lèi)化合物之一,具有多個(gè)氧化還原中心,是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑,在預(yù)防和治療冠心病方面具有巨大潛力,其中涉及減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)、影響脂代謝途徑等多種機(jī)制的交互作用[10-12]。由此可見(jiàn),本研究所預(yù)測(cè)的鹽膚木治療冠心病的核心成分均具有心血管保護(hù)活性潛能,與其廣泛參與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及脂代謝等機(jī)制調(diào)控息息相關(guān),且部分已得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,進(jìn)一步佐證鹽膚木治療冠心病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

基于PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?發(fā)現(xiàn)AKT1、SRC、STAT3處于中心樞紐位置,可能是其關(guān)鍵性作用靶標(biāo)。AKT1是目前所發(fā)現(xiàn)的3種AKT蛋白亞型之一,是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,在多種組織中廣泛表達(dá),與心血管功能調(diào)節(jié)關(guān)系密切,活化后可調(diào)控其下游靶基因,如內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、Bcl-2相關(guān)細(xì)胞死亡促進(jìn)因子(BAD)等,進(jìn)而促進(jìn)一氧化氮的合成與釋放[13]、抑制細(xì)胞自噬進(jìn)程[14],參與調(diào)節(jié)心肌梗死后的心律失常、心肌重塑及血管新生。SRC是一類(lèi)非受體酪氨酸激酶,可通過(guò)非經(jīng)典途徑誘導(dǎo)關(guān)鍵酪氨酸殘基磷酸化,調(diào)節(jié)下游AKT、STAT3、MAPK等靶標(biāo)的活性,從而廣泛參與氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、心肌纖維化等冠心病相關(guān)的重要病理環(huán)節(jié)[15-16]。STAT3作為STAT家族最早發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄激活因子,是一種在多組織器官中表達(dá)的急性反應(yīng)性因子,也是體內(nèi)多類(lèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)通路的交匯點(diǎn)[17-18]。STAT3通過(guò)介導(dǎo)生存活化因子增強(qiáng)途徑(FOXO1、BAD、Caspase-3等)及再灌注損傷修復(fù)激酶途徑(PI3K、PKB、GSK-3β等),拮抗心肌細(xì)胞壞死、缺血再灌注損傷、心肌肥厚等,繼而發(fā)揮心血管保護(hù)作用[19]。此外,酪氨酸激酶型受體EGFR與雌激素受體ESR1被普遍視為PI3K、SRC、MAPK通路的上游信號(hào);分子伴侶HSP90AA1可協(xié)助維持SRC激酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、與肌動(dòng)蛋白相互作用增強(qiáng)AKT活性等。綜上,所預(yù)測(cè)核心靶點(diǎn)均具有作為心血管疾病特異性靶點(diǎn)的潛能,且圍繞AKT1、SRC、STAT3發(fā)生樣式豐富的交叉對(duì)話(huà),說(shuō)明鹽膚木可能通過(guò)以AKT1、SRC、STAT3為關(guān)鍵核心、多種信號(hào)分子為輔助的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮防治冠心病的作用。為驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果,基于分子對(duì)接技術(shù),從分子空間結(jié)構(gòu)與能量匹配角度,證實(shí)活性成分咖啡酸、紫鉚素、根皮素、鞣花酸、槲皮素與核心靶蛋白AKT1、SRC、STAT3具有很強(qiáng)的親和力且結(jié)合較為穩(wěn)定,為核心成分與核心靶蛋白的潛在相互作用提供進(jìn)一步證據(jù),提示鹽膚木可能通過(guò)咖啡酸、紫鉚素、根皮素、鞣花酸、槲皮素作用于AKT1、SRC、STAT3等靶點(diǎn)發(fā)揮抗心肌缺血療效。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法,初步闡明鹽膚木防治冠心病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及潛在作用機(jī)制。研究結(jié)果顯示,鹽膚木治療冠心病的潛在活性成分有咖啡酸、紫鉚素、根皮素、鞣花酸、槲皮素等,核心靶點(diǎn)有AKT1、SRC、STAT3等,潛在作用機(jī)制為通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt通路等干預(yù)疾病發(fā)生發(fā)展,并證明潛在活性成分與核心靶點(diǎn)間具備交互潛能。上述研究基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)及計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)論證了鹽膚木是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮治療冠心病的作用。預(yù)測(cè)的結(jié)果尚未進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證是本研究的主要局限性,今后需在此理論基礎(chǔ)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)論證,明確其精細(xì)的藥理調(diào)控機(jī)理。