粆香 王鐵山 秦瑜 李賀 任嘉慧 石穎慧 宗玉涵 高鵬翼 王浩 謝心悅 劉含之 王安琪 潘彥舒

變應(yīng)性鼻炎又稱(chēng)過(guò)敏性鼻炎(allergic rhinitis,AR),是一種人體接觸變應(yīng)原后由特異性免疫球蛋白E(Immunoglobulin E,IgE)介導(dǎo)的輔助型T細(xì)胞2(T helper 2 cell,Th2)類(lèi)型鼻黏膜慢性非感染性炎癥反應(yīng)[1-4]。AR在中醫(yī)學(xué)屬“鼻鼽”范疇,在古代文獻(xiàn)中還有“鼽嚏”“鼽鼻”“鼽水”“鼻流清涕”等述描與本病癥狀類(lèi)似。本病最早以“鼽嚏”一詞記載于《禮記·月令》∶“季秋行夏令,則其國(guó)大水,冬藏殃敗,民多孰嚏?！盵5-6]

AR患者主要表現(xiàn)為鼻癢、鼻塞、流清涕、打噴嚏,可伴眼癢、流淚、眼部紅腫等,癥狀具有季節(jié)性、反復(fù)性的特點(diǎn)[4]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),AR已成為全球性健康問(wèn)題,20%～30%的成年人和高達(dá)40%的兒童受其影響[2-4]?，F(xiàn)有研究表明,AR發(fā)病涉及多種炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子及信號(hào)傳導(dǎo)通路,以Th1作用減弱Th2應(yīng)答增強(qiáng)最為經(jīng)典[7-9]?！吨袊?guó)變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南(2022年修訂版)》[10-11]指出,目前治療AR的常用藥物包括糖皮質(zhì)激素、抗組胺藥、抗白三烯藥、肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定劑、減充血?jiǎng)?、抗膽堿藥、中藥、鼻腔鹽水沖洗藥、抗IgE治療等,其中一線用藥為口服抗組胺藥與鼻噴糖皮質(zhì)激素[12-14]。以上治療雖然可以有效緩解過(guò)敏癥狀,但不能預(yù)防AR復(fù)發(fā),患者反復(fù)發(fā)病影響生活質(zhì)量。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究多側(cè)重于AR治療,鮮有對(duì)AR復(fù)發(fā)相關(guān)研究的報(bào)道。AR作為一種季節(jié)性、反復(fù)性疾病,對(duì)其復(fù)發(fā)機(jī)制及治療的探索也不容忽視[14-15]。

動(dòng)物類(lèi)中藥活性成分安全性高、療效確切,在AR治療中顯示出獨(dú)特的研發(fā)潛力和優(yōu)勢(shì)。脾氨肽口服溶液是以動(dòng)物類(lèi)中藥牛脾為原料制成的含多肽氨基酸和多核苷酸的混合溶液,臨床治療AR療效確切,但作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。同時(shí),脾氨肽口服溶液具有雙向免疫調(diào)節(jié)功能,調(diào)節(jié)免疫失衡作用突出,因而其防治AR復(fù)發(fā)的療效和作用機(jī)制也極具探索價(jià)值[16-17]。

本研究創(chuàng)新性地建立AR復(fù)發(fā)大鼠模型,并探究脾氨肽口服溶液防治AR復(fù)發(fā)的療效和免疫機(jī)制,以期揭示動(dòng)物類(lèi)中藥牛脾提取物防治AR復(fù)發(fā)的現(xiàn)代生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

SPF級(jí)雌性SD大鼠32只,8周齡,體質(zhì)量(200±20)g,購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SCXK(京)2019-0010,均在北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行飼養(yǎng)。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn),飼養(yǎng)環(huán)境:溫度(23±2)℃、相對(duì)濕度50%±10%,大鼠自由進(jìn)食飲水[2]。

1.2 倫理審查

本研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程均按照北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)的規(guī)定操作,已通過(guò)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批,批準(zhǔn)號(hào):BUCM-4-20211022020-4025。

1.3 主要藥物與試劑

脾氨肽口服溶液(規(guī)格10 mL:10 mg,批號(hào):210115,購(gòu)自北京第一生物化學(xué)藥業(yè)有限公司);氯雷他定片(10 mg,批號(hào):20023030,購(gòu)自揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)上海海尼藥業(yè)有限公司)。

卵清蛋白(ovalbumin from egg white,OVA)(10 g,批號(hào):SLCH2414,北京百諾威生物科技有限公司);氫氧化鋁凝膠(Imject Alum Adjuvant)(50 mL,批號(hào):VI311256,北京百諾威生物科技有限公司);gibco1640培養(yǎng)基(500 mL,批號(hào):8121249);4%多聚甲醛(500 mL,批號(hào):4500111011,北京蘭博利德商貿(mào)有限公司);EDTA脫鈣液(500 mL,批號(hào):567250222,北京百諾威生物科技有限公司);細(xì)胞凍存液(100 mL,批號(hào):2145345,北京百諾威生物科技有限公司);PBS緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)(500 mL,批號(hào):AC13074266,北京蘭博利德商貿(mào)有限公司),LEGENDplexTM大鼠Th細(xì)胞因子面板檢測(cè)抗體試劑盒(批號(hào):B314751,BIOLEGEND(北京)生物科技有限公司);大鼠IgG、OVA特異性IgG、OVA特異性IgE ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)分別為220105、221103K4、R1216H029,均購(gòu)自BIOLEGEND(北京)生物科技有限公司);大鼠IgE ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào):R220311-117a,欣博盛生物科技有限公司);CD8抗體(100 μg,批號(hào):B334055),干擾素γ(interferon gamma,IFN-γ)抗體,CD3抗體(100 μg,批號(hào):B279666),CD25抗體(100 μg,批號(hào):B302343),白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-4抗體(100 μg,批號(hào):B332499),CD4抗體(100 μg,批號(hào):B344817),ZUBNIER抗體(100 μg,批號(hào):B335395),FOXP3抗體(100 μg,批號(hào):2410199),以上均購(gòu)自BIOLEGEND(北京)生物科技有限公司。

1.4 主要儀器

流式細(xì)胞分析儀(型號(hào):LSRFortessa SORP,美國(guó)BD公司);多功能酶標(biāo)儀(型號(hào):I3x,美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);臺(tái)式自動(dòng)化成像儀(型號(hào):EVOS FL Auto 2,美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);恒溫水浴鍋(型號(hào):SY-1-2,天津歐諾儀器股份有限公司);離心機(jī)(型號(hào):Velocity 14, 生命動(dòng)力亞洲有限公司);組合式全溫震蕩搖床(型號(hào):ZQTF-8F8,上海知楚儀器有限公司);熒光細(xì)胞分析儀(型號(hào):Rigel S2, 北京科譽(yù)興業(yè)科技發(fā)展有限公司)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 動(dòng)物分組 適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后,將32只健康SPF級(jí)SD雌性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為空白組、模型組、脾氨肽組、氯雷他定組4組,每組8只。

1.5.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)周期劃分 實(shí)驗(yàn)第0～7天:預(yù)防給藥期;第8～21天:全身基礎(chǔ)致敏期;第22～28天:局部激發(fā)強(qiáng)化致敏期;第29～35天:鞏固給藥期;第36～42天:恢復(fù)期;第43～49天:二次激發(fā)期。

1.5.2 造模方法 本研究造模方法分兩階段完成。

全身基礎(chǔ)致敏(14天):以3 mg卵清蛋白為抗原,30 mg氫氧化鋁凝膠為佐劑,抽取1 mL生理鹽水配制成濃度為0.3%的OVA懸液后予腹腔注射,隔日1次,共7次;空白組用相同劑量的生理鹽水代替[6]。

局部激發(fā)強(qiáng)化致敏(7天):(1)滴鼻。腹腔注射免疫階段結(jié)束后,雙側(cè)鼻腔都以濃度為5%的卵清蛋白-生理鹽水溶液(0.5 g OVA加10 mL生理鹽水制成混懸液)50 μL滴鼻局部激發(fā)強(qiáng)化致敏刺激,每日1次,共7次。空白組用等量生理鹽水代替[6,12],方法同上;(2)霧化。腹腔注射階段結(jié)束后,每間隔3日使用濃度為5%的卵清蛋白-生理鹽水溶液進(jìn)行一次霧化。將各組大鼠分別放置于透明容器中,在保障大鼠不會(huì)缺氧的條件下連接超聲霧化器,調(diào)至1 mL/min,每組霧化4分鐘,霧化激發(fā)10分鐘后觀察大鼠鼻部行為學(xué)表現(xiàn)10分鐘,對(duì)每只大鼠進(jìn)行鼻部癥狀行為學(xué)評(píng)分,判斷否造模是否成功?？瞻捉M在相同條件下用生理鹽水替代進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)[6]。

1.5.3 給藥方法 本實(shí)驗(yàn)中SD雌性大鼠脾氨肽口服溶液、氯雷他定片藥物干預(yù)劑量按成人脾氨肽每日口服劑量60 mg,氯雷他定每日口服劑量10 mg,經(jīng)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)公式(假設(shè)人的劑量為X mg/kg,大鼠的劑量=6.3X mg/kg)計(jì)算而得(大鼠每周稱(chēng)重1次)。脾氨肽口服溶液每日給藥劑量為7.56 mg/kg,氯雷他定片每日給藥劑量為1.26 mg/kg。

空白組:等量超純水腹腔注射,等量生理鹽水滴鼻、霧化。

模型組:適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后采用OVA全身基礎(chǔ)致敏及鼻黏膜局部激發(fā)強(qiáng)化刺激致敏的方法建立AR復(fù)發(fā)大鼠模型,造模成功后進(jìn)入鞏固給藥期,本組不做任何其它處理,恢復(fù)期為期1周,之后進(jìn)行為期1周的二次激發(fā)實(shí)驗(yàn),每隔3日做1次行為學(xué)測(cè)試并評(píng)分,本階段第3次行為學(xué)評(píng)價(jià)完成后取材進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)[6]。

脾氨肽組:適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后采用OVA全身基礎(chǔ)致敏及鼻黏膜局部激發(fā)強(qiáng)化刺激致敏的方法建立AR復(fù)發(fā)大鼠模型,造模成功后進(jìn)入鞏固給藥期,本組用脾氨肽口服溶液干預(yù)(7.56 mg/kg),給藥周期為適應(yīng)性喂養(yǎng)期至恢復(fù)期,恢復(fù)期為期1周,之后進(jìn)行為期1周的二次激發(fā)實(shí)驗(yàn),每隔3日做1次行為學(xué)測(cè)試并評(píng)分,本階段第3次行為學(xué)評(píng)價(jià)完成后取材進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

氯雷他定組:適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后采用OVA全身基礎(chǔ)致敏及鼻黏膜局部激發(fā)強(qiáng)化刺激致敏的方法建立AR復(fù)發(fā)大鼠模型,造模成功后進(jìn)入鞏固給藥期,本組用氯雷他定干預(yù)(1.26 mg/kg),給藥周期為適應(yīng)性喂養(yǎng)階段至恢復(fù)期結(jié)束,恢復(fù)期為期1周,之后進(jìn)行為期1周的二次激發(fā)實(shí)驗(yàn),二次激發(fā)期間不給藥,每隔3日做1次行為學(xué)測(cè)試并評(píng)分,本階段第3次行為學(xué)評(píng)價(jià)完成后取材進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 鼻部癥狀行為學(xué)評(píng)分 局部激發(fā)強(qiáng)化階段每隔3日對(duì)空白組、模型組、脾氨肽組、氯雷他定組大鼠進(jìn)行一次以鼻部癥狀(即嚏噴、流清涕、鼻癢等表現(xiàn))為主的行為學(xué)觀察和記錄,并對(duì)鼻部諸癥進(jìn)行疊加量化記分,觀察治療前后各組大鼠鼻部癥狀改善情況。觀察記錄時(shí)間為激發(fā)或給藥干預(yù)后30分鐘內(nèi)[7,18-22]。評(píng)價(jià)量表見(jiàn)表1。

表1 大鼠鼻部癥狀行為學(xué)評(píng)價(jià)量表

1.6.2 外周血嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞計(jì)數(shù) 實(shí)驗(yàn)取材階段,各組大鼠腹主動(dòng)脈取血后行血常規(guī)檢測(cè),檢測(cè)指標(biāo)包括:白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量、白細(xì)胞五分類(lèi)(嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞)計(jì)數(shù)和比例共8項(xiàng)。

1.6.3 蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察鼻甲組織病理形態(tài) 實(shí)驗(yàn)取材時(shí),每組隨機(jī)選擇6只大鼠,取部分鼻甲組織,生理鹽水沖洗后,固定于4%多聚甲醛溶液中,脫鈣處理,常規(guī)石蠟包埋,切片并HE染色,觀察鼻甲組織病理形態(tài)[23-25]。根據(jù)病變的分布、嚴(yán)重程度和形態(tài)學(xué)特點(diǎn)使用合適的診斷術(shù)語(yǔ)并將病變分為4個(gè)等級(jí):輕微、輕度、中度、重度,分別用1、2、3、4表示,-表示正常。本次拍照均為200倍視野。

1.6.4 Elisa檢測(cè)IgE、IgG、OVA特異性IgE、OVA特異性IgG表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)取材時(shí),收集各組大鼠血清樣本,每組隨機(jī)選擇5只大鼠樣本,按照相應(yīng)Elisa檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)分別檢測(cè)各樣本IgE、IgG、OVA特異性IgE、OVA特異性IgG的OD值。

1.6.5 流式細(xì)胞檢測(cè)Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞比例 驗(yàn)取材時(shí),收集各組大鼠血清樣本,每組隨機(jī)選擇5只大鼠樣本,提外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),用抗體CD3、CD4、CD8、CD25、ZUBNIER胞外染色,抗體FOXP3、IL-17A、IL-4、IFN-γ胞內(nèi)染色,使用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞的比例,并分析其功能變化。

1.6.6 檢測(cè)炎癥因子IFN-γ、IL-5、IL-2、TNF-α、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor,GMCSF)、IL-4、IL-17F、IL-17A、IL-13、IL-22、IL-6表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)取材時(shí),收集各組大鼠血清樣本,每組隨機(jī)選擇5只大鼠樣本,采用LEGENDplexTM細(xì)胞因子面板及IFN-γ、IL-5、IL-2、TNF-α、GMCSF、IL-4、IL-17F、IL-17A、IL-13、IL-22、IL-6對(duì)應(yīng)的捕獲珠子,使用流式細(xì)胞分析儀同時(shí)定量檢測(cè)多種細(xì)胞因子[26-30]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 脾氨肽口服溶液對(duì)AR復(fù)發(fā)大鼠鼻部癥狀行為學(xué)評(píng)分的影響

各組大鼠分別于局部激發(fā)強(qiáng)化期、鞏固給藥期和二次激發(fā)期隔日進(jìn)行一次鼻部癥狀行為學(xué)評(píng)分,即實(shí)驗(yàn)第22、25、29、31、34、38、43、47、49天,依據(jù)《鼻部癥狀行為學(xué)評(píng)價(jià)量表》進(jìn)行鼻部癥狀行為學(xué)評(píng)分。記錄各組大鼠鼻部癥狀行為學(xué)評(píng)價(jià)得分,并計(jì)算出每組大鼠每次鼻部癥狀行為學(xué)評(píng)價(jià)得分的平均值,得到各組大鼠鼻部癥狀行為學(xué)評(píng)分得分情況及其變化趨勢(shì)。見(jiàn)表2,圖1。

圖1 各組AR模型大鼠鼻部癥狀行為學(xué)評(píng)分變化折線圖

表2 各組AR模型大鼠鼻部癥狀行為學(xué)評(píng)分表鼠只=8,分)

鼻部癥狀行為學(xué)評(píng)分顯示,與空白組相比,模型組評(píng)分持續(xù)處于最高水平,二次激發(fā)期略降低。與模型組相比,脾氨肽組首次局部激發(fā)強(qiáng)化期鼻部癥狀行為學(xué)評(píng)分較高,恢復(fù)期明顯下降,二次激發(fā)期期略有回升,但總體低于模型組,氯雷他定組與之相反。實(shí)驗(yàn)第43天時(shí),脾氨肽組和氯雷他定組鼻部癥狀行為學(xué)評(píng)分基本一致。表明脾氨肽口服溶液具有降低AR復(fù)發(fā)的作用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中未繼續(xù)給藥,故行為學(xué)評(píng)分呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。

2.2 外周血嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞水平

各組大鼠于實(shí)驗(yàn)第49天,腹主動(dòng)脈取外周血計(jì)數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞,得到各組大鼠嗜酸性粒細(xì)胞變化情況。模型組大鼠嗜酸性粒細(xì)胞均值處于最高水平,且與空白組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。氯雷他定組與模型組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表3。

各組大鼠于實(shí)驗(yàn)第49天,腹主動(dòng)脈取外周血計(jì)數(shù)嗜堿性粒細(xì)胞,得到各組大鼠嗜堿性粒細(xì)胞變化情況。模型組大鼠嗜堿性粒細(xì)胞均值處于最高水平,且與空白組存在顯著差異(P<0.001)。脾氨肽組和氯雷他定組嗜堿性粒細(xì)胞水平均顯著低于模型組(P<0.05),表明脾氨肽口服溶能顯著降低外周血嗜堿性粒細(xì)胞水平。見(jiàn)表3。

2.3 脾氨肽口服溶液對(duì)AR復(fù)發(fā)大鼠鼻甲組織病理形態(tài)的影響

空白組大鼠鼻腔結(jié)構(gòu)完整,鼻中隔軟骨結(jié)構(gòu)完整,左右鼻腔內(nèi)鼻甲結(jié)構(gòu)完整,尚未見(jiàn)頜鼻甲結(jié)構(gòu),可能與取材部位有關(guān),不影響診斷結(jié)構(gòu);鼻黏膜結(jié)構(gòu)完整,清晰可見(jiàn)黏膜層纖毛、支持細(xì)胞、嗅細(xì)胞、基底細(xì)胞以及杯狀細(xì)胞,結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常。

模型組大鼠鼻腔結(jié)構(gòu)完整,鼻中隔軟骨結(jié)構(gòu)完整, 左右鼻腔內(nèi)鼻甲結(jié)構(gòu)完整未見(jiàn)明顯異常; 病變集中于鼻黏膜部位,可見(jiàn)部分大鼠鼻黏膜淋巴細(xì)胞浸潤(rùn), 程度均為輕微, 組間發(fā)病率為2/5;可見(jiàn)個(gè)別大鼠steno腺輕度空泡變性;可見(jiàn)個(gè)別大鼠黏膜內(nèi)杯狀細(xì)胞輕度增生。

脾氨肽組大鼠鼻腔結(jié)構(gòu)完整,鼻中隔軟骨結(jié)構(gòu)完整,左右鼻腔內(nèi)鼻甲結(jié)構(gòu)完整未見(jiàn)明顯異常;鼻黏膜部位病變程度較輕,可見(jiàn)個(gè)別大鼠輕微淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比,脾氨肽組大鼠鼻腔病變改善明顯,表現(xiàn)為杯狀細(xì)胞增生被明顯抑制。

氯雷他定組大鼠鼻腔結(jié)構(gòu)完整,鼻中隔軟骨結(jié)構(gòu)完整,左右鼻腔內(nèi)鼻甲結(jié)構(gòu)完整未見(jiàn)明顯異常;鼻黏膜部位病變程度較輕,可見(jiàn)個(gè)別大鼠杯狀細(xì)胞輕度增生;可見(jiàn)個(gè)別大鼠輕度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比,氯雷他定組大鼠鼻腔未見(jiàn)明顯差異。見(jiàn)圖2。

圖2 各組AR模型大鼠鼻組織病理形態(tài)(HE染色)

2.4 脾氨肽口服溶液對(duì)AR復(fù)發(fā)大鼠總IgE、總IgG、OVA特異性IgE、OVA特異性IgG OD值的影響

各組大鼠于實(shí)驗(yàn)第49天,腹主動(dòng)脈取外周血,分離得到血清,用Elisa試劑盒檢測(cè)各組大鼠IgG、IgE、OVA特異性IgG和OVA特異性IgE水平,得到各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)OD值,并比較IgG/IgE、OVA特異性IgG/OVA特異性比值差異。見(jiàn)表4。

表4 各組AR模型大鼠血清免疫蛋白表達(dá)情況鼠只=5)

Elisa檢測(cè)結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組大鼠IgG OD值、IgG/IgE均降低,IgE OD值升高,且差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比,脾氨肽組和氯雷他定組IgG OD值、IgG/IgE均升高,表明AR發(fā)生會(huì)導(dǎo)致IgE升高,脾氨肽口服溶液和氯雷他定片均可提升AR復(fù)發(fā)大鼠IgG水平,激活免疫系統(tǒng),調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥狀態(tài)。與空白組相比,模型組大鼠OVA特異性IgG OD值、OVA特異性IgG/OVA特異性IgE均降低,OVA特異性IgE OD值升高,脾氨肽組和氯雷他定組OVA特異性IgG OD值、OVA特異性IgG/OVA特異性IgE均高于模型組,且脾氨肽組OVA特異性IgG/OVA特異性IgE顯著高于模型組(P<0.01),提示脾氨肽口服溶液也能通過(guò)調(diào)節(jié)OVA特異性IgG和OVA特異性IgE水平減輕機(jī)體炎癥反應(yīng),防治AR。

2.5 脾氨肽口服溶液對(duì)AR復(fù)發(fā)大鼠Th1、Th2、Treg、Th17的影響

各組大鼠于實(shí)驗(yàn)第49天,腹主動(dòng)脈取外周血,分離得到血清,規(guī)范制備檢測(cè)樣品,運(yùn)用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)Th1、Th2、Treg、Th17等的數(shù)量及比例。見(jiàn)表5,圖3～5。

空白組 模型組 脾氨肽組 氯雷他定組

空白組 模型組 脾氨肽組 氯雷他定組

空白組 模型組 脾氨肽組 氯雷他定組

表5 各組AR模型大鼠免疫細(xì)胞、炎癥因子等流式檢測(cè)結(jié)果鼠只=5)

從細(xì)胞比例來(lái)看,與空白組相比,模型組Th1、Treg均降低,Th2、Th17均升高,且Th2升高更明顯(P<0.05);與模型組相比,脾氨肽組、氯雷他定組Th1、Treg均升高,Th2、Th17均降低,且氯雷他定組下降更明顯(P<0.05)。從mean值來(lái)看,與空白組相比,模型組IL-4、IL-17均升高,IFN-γ降低,且IFN-γ降低更明顯(P<0.05);與模型組相比,脾氨肽組、氯雷他定組IL-4、IL-17均升高,IFN-γ均降低。提示脾氨肽口服溶液可能是通過(guò)影響IL-4、IL-17、IFN-γ等炎癥因子的分泌,調(diào)控Th1/Th2、Treg/Th17的免疫平衡發(fā)揮防治AR的作用。

2.6 脾氨肽口服溶液對(duì)AR復(fù)發(fā)大鼠IFN-γ、IL-5、IL-2、TNF-α、GM-CSF、IL-4、IL-17F、IL-17A、IL-13、IL-22、IL-6的影響

各組大鼠于實(shí)驗(yàn)第49天,腹主動(dòng)脈取外周血,分離得到血清,通過(guò)流式細(xì)胞分析儀用因子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組大鼠IFN-γ、IL-5、IL-2、TNF-α、GM-CSF、IL-4、IL-17F、IL-17A、IL-13、IL-22、IL-6共11種因子,得到各組大鼠以上11種因子的表達(dá)情況。見(jiàn)表6。

表6 各組AR模型大鼠血清多種炎癥因子檢測(cè)結(jié)果鼠只=5)

多種因子檢測(cè)結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組IFN-γ、IL-5、IL-2、TNF-α、GM-CSF、L-4、IL-17A、IL-13、IL-6水平均高于空白組,且模型組與空白組IL-4水平存在極大差異(P<0.001),提示IL-4升高可引發(fā)大鼠AR的發(fā)生。脾氨肽組IFN-γ、IL-5、IL-2、TNF-α、GM-CSF、IL-17F、IL-17A、IL-13、IL-22、IL-6水平均高于模型組,IL-4水平低于模型組,提示脾氨肽口服溶液能刺激多種炎癥因子分泌,激活免疫系統(tǒng),并抑制IL-4分泌,減少B細(xì)胞種型轉(zhuǎn)換,從而減少I(mǎi)gE產(chǎn)生,預(yù)防AR的發(fā)生或復(fù)發(fā)。

3 討論

3.1 AR復(fù)發(fā)模型評(píng)價(jià)

臨床研究顯示,AR復(fù)發(fā)發(fā)作時(shí)患者多出現(xiàn)流涕、噴嚏、鼻癢、鼻塞的癥狀,鼻黏膜水腫,鼻腔分泌物增多。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行大鼠鼻部癥狀行為學(xué)評(píng)分時(shí)發(fā)現(xiàn)其癥狀主要為鼻癢、噴嚏,其次為流涕,與臨床表現(xiàn)基本一致,且模型組鼻部癥狀行為學(xué)評(píng)分顯著高于空白組,模型組嗜酸、嗜堿性粒細(xì)胞水平均顯著高于復(fù)發(fā)空白組(P<0.01),鼻組織病理切片提示模型組大鼠鼻黏膜出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),組間發(fā)病率為2/5,伴有steno腺輕度空泡變性和黏膜內(nèi)杯狀細(xì)胞增生,空白組鼻黏膜結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常。以上結(jié)果表明,大鼠AR復(fù)發(fā)模型造模成功。

3.2 脾氨肽口服溶液在AR復(fù)發(fā)中的療效及其作用機(jī)制小結(jié)

3.2.1 脾氨肽口服溶液對(duì)改善AR復(fù)發(fā)癥狀療效確切 脾氨肽口服溶液對(duì)防治AR復(fù)發(fā)療效確切,主要體現(xiàn)在以下3個(gè)方面:

(1)脾氨肽口服溶液不僅能有效減輕AR復(fù)發(fā)大鼠鼻部噴嚏、流涕、鼻癢等癥狀,而且能預(yù)防AR復(fù)發(fā),經(jīng)過(guò)預(yù)防治療的AR大鼠鼻部癥狀行為學(xué)表現(xiàn)較平穩(wěn),鼻黏膜組織損傷小,免疫細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定;

(2)脾氨肽口服溶液能降低AR復(fù)發(fā)大鼠嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞水平,使之趨近正常水平,緩解過(guò)敏反應(yīng);

(3)脾氨肽口服溶液能有效減輕AR復(fù)發(fā)鼻黏膜組織損傷,緩解淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),防止steno腺變性。

3.2.2 脾氨肽口服溶液主要通過(guò)調(diào)節(jié)Th1和Th2的免疫平衡起到防治AR復(fù)發(fā)的作用 從流式多因子檢測(cè)結(jié)果和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1、Th2、Treg、Th-17等的結(jié)果來(lái)看,脾氨肽口服溶液能降低AR復(fù)發(fā)大鼠Th2細(xì)胞水平,顯著下調(diào)IL-4,提高Th1細(xì)胞比例,刺激INF-γ分泌,增強(qiáng)單核巨噬系統(tǒng)活性,提高機(jī)體細(xì)胞免疫水平,抑制容易誘發(fā)過(guò)敏的體液免疫,促進(jìn)免疫平衡。

3.2.3 脾氨肽口服溶液與氯雷他定片治療AR復(fù)發(fā)的機(jī)制不同 鼻部癥狀行為學(xué)評(píng)分顯示,脾氨肽口服溶液能明顯減輕AR復(fù)發(fā)大鼠噴嚏和鼻癢癥狀,療效持久且穩(wěn)定。氯雷他定片在初次鼻炎時(shí)能較好地緩解癥狀,但在復(fù)發(fā)階段治療作用減弱。而脾氨肽口服溶液治療組(脾氨肽組)行為學(xué)評(píng)分在復(fù)發(fā)初期已接近空白組。通過(guò)檢測(cè)各組大鼠嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、總IgE、OVA特異性IgE、炎癥因子水平等,發(fā)現(xiàn)脾氨肽口服溶液和氯雷他定治療AR復(fù)發(fā)的機(jī)制不同,具體如下:

(1)從病理涂片結(jié)果來(lái)看,脾氨肽口服溶液在緩解噴嚏、流涕、鼻癢等AR復(fù)發(fā)癥狀的同時(shí)能較好地減少杯狀細(xì)胞增生和黏膜基底細(xì)胞增多,氯雷他定雖也能有效緩解鼻部過(guò)敏癥狀,但不能減輕鼻部組織炎癥表現(xiàn);

(2)脾氨肽口服溶液能顯著降低AR復(fù)發(fā)大鼠Th2細(xì)胞水平,尤其能抑制IL-4的表達(dá),氯雷他定片對(duì)AR復(fù)發(fā)大鼠Th2水平的影響較小。脾氨肽口服溶液在抑制Th2反應(yīng)的同時(shí)可以促進(jìn)Th1和IFN-γ的釋放,能夠恢復(fù)被過(guò)敏反應(yīng)破壞的免疫平衡,而氯雷他定片對(duì)Th1和Th2都是抑制的。

3.3 進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)研究的展望

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)鼻部癥狀行為學(xué)評(píng)分、外周血嗜酸、嗜堿性粒細(xì)胞檢測(cè)和鼻組織病理檢測(cè)明確了脾氨肽口服溶液在AR復(fù)發(fā)中的防治作用,通過(guò)Elisa檢測(cè)IgG、IgE、OVA特異性IgG、OVA特異性IgE、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1、Th2、Treg、Th-17和對(duì)IL-4、IFN-γ等炎癥因子的檢測(cè)揭示了脾氨肽口服溶液主要是通過(guò)調(diào)節(jié)免疫球蛋白水平,促進(jìn)體液免疫和細(xì)胞免疫的平衡發(fā)揮防治AR復(fù)發(fā)的作用,但脾氨肽口服溶液防治AR復(fù)發(fā)的有效成分和作用靶點(diǎn)尚不明晰。在今后的實(shí)驗(yàn)中,擬運(yùn)用表面等離子體共振技術(shù)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等進(jìn)一步探究脾氨肽口服溶液防治AR復(fù)發(fā)的有效藥物成分,運(yùn)用定量化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)、代謝組學(xué)技術(shù)等從更深層次揭示脾氨肽口服溶液有效防治AR復(fù)發(fā)的作用靶點(diǎn),以期為脾氨肽口服溶液廣泛用于AR臨床治療提供更確切的理論支撐[29-32]。