黃云霞 黃雪霞 文靜

精神分裂癥是一種嚴(yán)重而復(fù)雜的精神障礙，全球發(fā)病率約為1%［1］，主要表現(xiàn)為陰性癥狀、陽(yáng)性癥狀及認(rèn)知缺陷等［2-5］。精神分裂癥多發(fā)于青春期且發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚未完全闡明其發(fā)病機(jī)制。地佐西平（dizocilpine，MK-801）是一種N-甲基-D-天門冬氨酸受體（NMDAR）非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，國(guó)內(nèi)外廣泛用于誘導(dǎo)精神分裂癥的動(dòng)物模型的工具藥［6-8］。然而，其誘導(dǎo)精神分裂癥癥狀的機(jī)制也尚不完全清楚。代謝組學(xué)是研究?jī)?nèi)源性代謝物的方法，通過(guò)識(shí)別正?；虿±泶x變化及相關(guān)的生化途徑，挖掘分子機(jī)制和發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物，為探索疾病機(jī)制提供新的研究思路［9-10］。因此，本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）的非靶向代謝組學(xué)方法，探討MK-801誘導(dǎo)精神分裂癥的大鼠血漿顯著代謝物影響及相關(guān)代謝途徑，為進(jìn)一步探明精神分裂癥的發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠20只，選購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；許可證編號(hào)：SCXK（京）2020-0005。飼養(yǎng)環(huán)境為：室溫20 ～24 ℃，相對(duì)濕度15% ～ 55%，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由飲食，自然光照，通風(fēng)良好。

1.1.2 藥物與試劑 MK-801（德國(guó)Sigma公司，77086-22-7），L-2-氯苯丙氨酸（98%）（北京百靈威科技有限公司），硬脂酸甲酯（99.5%）（美國(guó) Sigma-Aldrich 公司），甲氧胺鹽酸鹽（99%）（北京百靈威科技有限公司），BSTFA+1%TMCS （98%）（北京Solarbio科技有限公司），乙腈（色譜純）（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器設(shè)備 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀7890A-5975C（美國(guó)Agilent公司）；冷凍研磨儀 JXFSTPRP-CL（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；高速冷凍離心機(jī)STR16R（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；十萬(wàn)分之一電子天平 BSA124S-CW（德國(guó)Startorius公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組、造模及行為學(xué)測(cè)試 20只雄性SD大鼠分為對(duì)照組（腹腔注射生理鹽水，n=10）和試驗(yàn)組（腹腔注射MK-801制備精神分裂癥大鼠模型，0.5 mg∕kg，n=10）［11］，每天上午9點(diǎn)給藥1次，連續(xù)給藥2周。最后一次給藥后24 h依次參照文獻(xiàn)方法［12-13］進(jìn)行曠場(chǎng)（open field test，OFT）、高架十字迷宮（elevated plusmaze test，EPM）和新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)（novel object recognition test，NOR）對(duì)精神分裂樣癥狀進(jìn)行評(píng)價(jià)。OFT觀察指標(biāo)為總路程反映大鼠自主運(yùn)動(dòng)量（即中樞神經(jīng)系統(tǒng)的狀態(tài)興奮或抑制）。EPM觀察指標(biāo)為大鼠進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)和在開(kāi)臂停留時(shí)間（在開(kāi)放臂的活動(dòng)多少），用于評(píng)價(jià)大鼠的焦慮狀態(tài)。NOR測(cè)試包括兩個(gè)試驗(yàn)熟悉期（T1，探索兩個(gè)相同物體）和測(cè)試期（T2，更換一個(gè)物體為新物體），通過(guò)識(shí)別新舊物體的時(shí)間評(píng)價(jià)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

1.2.2 溶液配制 準(zhǔn)確稱取 L-2-氯苯丙氨酸適量，配制成濃度約為 250 μg∕mL的 L-2-氯苯丙氨酸甲醇溶液作為內(nèi)標(biāo)1。準(zhǔn)確稱取甲氧胺鹽酸鹽適量，配制成濃度約20 mg∕mL甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液作為肟化試劑。準(zhǔn)確稱取硬脂酸甲酯適量配制成濃度約為 50 μg∕mL硬脂酸甲酯正庚烷工作液作為內(nèi)標(biāo)2。配制好的溶液均保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.3 血漿樣品的制備 SD大鼠麻醉后，采集大鼠心血（約 0.5 mL）置于有肝素鈉（12 500單位）離心管并離心，取澄清血漿于凍存管中保存。取樣后迅速將樣本置于液氮中，待全部取樣完成后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保持。

1.2.4 血漿樣本的預(yù)處理 分別從兩組7個(gè)解凍血漿樣本中移取血漿約100 μL置于1.5 mL離心管中，加250 μg∕mL L-2-氯苯丙氨酸溶液20 μL混勻，加冰乙腈300 μL渦旋混勻，離心取上清液100 μL氮?dú)鈸]干。于殘?jiān)屑?30 μL濃度為 20 mg∕mL 的甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液，渦旋15 s后于 80 ℃烘箱中肟化 15 min，放冷后加 50 μL濃度為 50 μg∕mL 的硬脂酸甲酯庚烷溶液，渦旋，高速離心取上清 90 μL置于進(jìn)樣小瓶。

質(zhì)控樣本：取所有血漿樣本各30 μL于5 mL EP管中混勻，制得質(zhì)控（quality control，QC）樣本。根據(jù)樣本數(shù)量計(jì)算所需要質(zhì)控樣本數(shù)量，需要5個(gè)質(zhì)控樣本。取血漿質(zhì)控樣本100 μL于1.5 mL EP管中，加250 μg∕mL L-2-氯苯丙氨酸溶液20 μL混勻。加冰乙腈300 μL，其余操作同血漿樣本。對(duì)照樣本：取 100 μL冰乙腈于 1.5 mL EP管中，加入 250 μg∕mL的 L-2-氯苯丙氨酸甲醇溶液 20 μL，其余操作同血漿樣本。

1.2.5 CG-MS 儀器條件

1.2.5.1 色譜條件 DB-5MS型號(hào)毛細(xì)色譜柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；載氣：高純He氣流速：1.0 mL∕min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；輔助加熱器溫度：230 ℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；程序升溫：起始溫度60 ℃，保持1 min，8 ℃∕min升至300 ℃，最后保持7 min，進(jìn)樣程序需38 min。質(zhì)譜條件四極桿溫度150 ℃，離子源溫度230 ℃，電子轟擊電離（electron impact， EI）方式，電離能量70 eV，溶劑延遲4.5 min，全掃描模式（SCAN），掃描范圍M∕Z 50～600 amu。

1.2.5.2 進(jìn)樣條件 自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣體積 2 μL，檢測(cè)樣本前先進(jìn)行內(nèi)標(biāo)、空白以及 QC 樣本進(jìn)樣（連續(xù)3個(gè)）。在整個(gè)分析檢測(cè)過(guò)程中，每進(jìn)7個(gè)樣本安插進(jìn)1個(gè) QC樣本。內(nèi)標(biāo)用于確定色譜峰的位置，空白用于排除外源性物質(zhì)干擾，QC 用于考察 GC-MS 分析檢測(cè)過(guò)程中的穩(wěn)定性。

1.2.6 血漿代謝物篩選 血漿樣本經(jīng)過(guò)前處理及GC-MS分析后，色譜圖經(jīng)過(guò) AMDIS 6.51 軟件及NIST14 數(shù)據(jù)庫(kù)（安捷倫科技，美國(guó)）進(jìn)行去卷積及色譜峰識(shí)別，匹配度＞80%的色譜峰為可定性代謝物，導(dǎo)出數(shù)據(jù)至 EXCEL，色譜信息包含化合物名稱、保留時(shí)間及峰面積。

將用于定性的所有代謝物的峰面積均除以 L-2-氯苯丙氨酸（內(nèi)標(biāo) 1）的峰面積得到代謝物的相對(duì)濃度，同時(shí)刪除 QC 樣本中相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）大于 30%的物質(zhì)，將剩余部分的數(shù)據(jù)處理成矩陣的形式。

1.2.7 血漿差異代謝物篩選 數(shù)據(jù)導(dǎo)入Metaboanalyst 4.0 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。首先采用主成分分析法（principal components analysis，PCA）分析，觀察包括 QC 在內(nèi)的各組間區(qū)分度及組內(nèi)聚集情況，初步評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的組內(nèi)和組間差異是否明顯，并通過(guò) QC 樣本的聚集情況判斷樣本分析的總體質(zhì)量。然后通過(guò)偏最小二乘法-判別式分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）分析MK-801組與對(duì)照組之間的效果，根據(jù)變量投影重要度（variable importance in the projection，VIP），VIP 值大于 1，t檢驗(yàn)P值小于0.05 篩選差異代謝物。

1.2.8 血漿差異代謝物通路分析 將上述統(tǒng)計(jì)學(xué)分析篩選出的差異代謝物導(dǎo)入Metaboanalyst 4.0數(shù)據(jù)庫(kù)的“通路分析”模塊進(jìn)行通路分析。通路分析參數(shù)：通路數(shù)據(jù)庫(kù)為Rattus Norvegicus（rat）；通路富集分析算法為超幾何檢驗(yàn)（hypergeometric test）；拓?fù)浞治鏊惴橄鄬?duì)中介中心性（relative-betweeness centrality）。通路分析結(jié)果中，P值小于0.05的通路認(rèn)定為顯著改變的代謝通路。

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)檢測(cè) OFT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組大鼠運(yùn)動(dòng)距離顯著降低（圖1A）。EPM實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組大鼠在進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù)和在開(kāi)臂持續(xù)的時(shí)間較對(duì)照組顯著降低（圖1B、1C）。NOR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在熟悉期（T1）對(duì)照組和試驗(yàn)組大鼠對(duì)兩個(gè)相同物體探索時(shí)間均無(wú)顯著差異；在測(cè)試期（T2）對(duì)照組大鼠對(duì)新物體探索時(shí)間較熟悉物體顯著增加（P＜0.05），而試驗(yàn)組大鼠對(duì)新物體探索時(shí)間較熟悉物體沒(méi)有顯著差異。見(jiàn)表1。以上結(jié)果提示，試驗(yàn)組大鼠精神分裂癥模型制備成功。

表1 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)頭部探索時(shí)間統(tǒng)計(jì)（）

表1 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)頭部探索時(shí)間統(tǒng)計(jì)（）

注：與大鼠識(shí)別熟悉物體時(shí)間相比，對(duì)照組和試驗(yàn)組大鼠識(shí)別新物體的時(shí)間，①P＜0.05。物體1和2為兩個(gè)相同物體。

測(cè)試物體1物體2 F值P值熟悉期（T1）（s）對(duì)照組10.65±3.63 9.89±4.83 1.457 0.7719試驗(yàn)組5.82±6.35 3.79±4.57 1.931 0.575試驗(yàn)組5.99±4.18 8.17±4.16 1.009 0.4288測(cè)試熟悉物體新物體F值P值測(cè)試期 （T2） （s）對(duì)照組7.01±10.15 33.53±16.97①2.796 0.0134

圖1 OFT和EPM實(shí)驗(yàn)

3.2 血漿代謝物篩選結(jié)果 與NIST14譜庫(kù)比對(duì)，匹配度＞80%為定性標(biāo)準(zhǔn)，分別在QC樣本中定性出80種代謝物。見(jiàn)圖2。

圖2 血漿樣本GC-MS總離子色譜圖

3.3 血漿差異代謝物篩選結(jié)果 PCA分析結(jié)果如圖3A所示，對(duì)照組與試驗(yàn)組有部分重合，QC樣本聚集較好。PLS-DA分析顯示，兩組樣本能有效區(qū)分（圖3B）。交叉驗(yàn)證模型變量結(jié)果R2=0.864 72，Q2=0.775 38。以VIP 值大于1和t檢驗(yàn)P值小于0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異代謝物結(jié)果見(jiàn)表2，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比共篩出10種差異代謝物，其濃度變化均呈下降趨勢(shì)。

表2 血漿樣本差異代謝物

圖3 兩組樣本PCA和PLS-DA得分圖

3.4 血漿差異代謝物的通路分析 差異代謝物代謝通路分析結(jié)果見(jiàn)表3。血漿差異代謝物主要參與氨酰-tRNA生物合成和苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成代謝。即苯丙氨酸、絲氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酸參與氨酰-tRNA生物合成代謝通路；苯丙氨酸、酪氨酸參與苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成代謝。

表3 血漿代謝通路信息表

4 討論

精神分裂癥是一種嚴(yán)重的精神疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，已經(jīng)成為全球衛(wèi)生資源的沉重負(fù)擔(dān)。然而，精神分裂癥的病因和機(jī)制仍未闡明。精神分裂癥研究公認(rèn)的藥理模型是NMDA受體的非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑（MK-801和氯胺酮），因此本研究參照文獻(xiàn)［11］方法采用MK-801給藥，模擬大鼠的精神分裂癥樣行為，構(gòu)建了精神分裂癥的大鼠模型。通過(guò)代謝組學(xué)的技術(shù)探索MK-801誘導(dǎo)類似精神分裂癥模型大鼠體內(nèi)內(nèi)源小分子的代謝，挖掘與精神分裂癥相關(guān)的特征性生物標(biāo)志物及代謝途徑，為精神分裂癥病理提供新的見(jiàn)解。

自主活動(dòng)、焦慮及認(rèn)知障礙是精神分裂癥的典型癥狀，分別用曠場(chǎng)、高架十字迷宮和新物體識(shí)別試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。在OFT中，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組大鼠自主運(yùn)動(dòng)顯著降低。在EPM測(cè)試中，試驗(yàn)組大鼠進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)和在開(kāi)臂持續(xù)的時(shí)間較對(duì)照組顯著減少，表明MK-801慢性給藥誘導(dǎo)大鼠焦慮樣行為。NOR試驗(yàn)中模型大鼠識(shí)別能力較對(duì)照組顯著降低，表明認(rèn)知障礙。這與一項(xiàng)以MK-801構(gòu)建精神分裂為模型進(jìn)行治療藥物機(jī)制研究中的結(jié)果一致［14］。上述行為學(xué)結(jié)果表明采用MK-801給藥成功構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性精神分裂癥大鼠模型。

生物體代謝組的改變往往是受基因、疾病、環(huán)境、藥毒物等多因素作用后的最末端反應(yīng)，可以為尋找表型變化的“線索”［15］。本實(shí)驗(yàn)采用基于GC-MS的代謝組學(xué)檢測(cè)方法對(duì)亞慢性MK-801給藥后大鼠血漿樣本進(jìn)行檢測(cè)，PCA分析結(jié)果顯示QC樣本聚集較好，提示GC-MS在樣品分析過(guò)程中較為穩(wěn)定，系統(tǒng)誤差??；對(duì)照組與試驗(yàn)組有部分重合說(shuō)明兩組存在一定代謝物差異。PLS-DA分析結(jié)合交叉驗(yàn)證結(jié)果表明該模型可靠、擬合準(zhǔn)確性好。經(jīng)過(guò)差異代謝物篩選，試驗(yàn)組多種氨基酸濃度較對(duì)照組顯著降低，包括蘇氨酸、絲氨酸、肌氨酸、丙氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、檸檬酸、酪氨酸和色氨酸，其濃度均顯著下降。提示MK-801誘導(dǎo)的精神分裂癥可能導(dǎo)致血漿氨基酸代謝紊亂。

氨基酸是三羧酸循環(huán)的前體，影響蛋白質(zhì)合成和能量代謝［16］。氨基酸代謝異常與多種神經(jīng)精神障礙有關(guān)，包括自閉癥譜系障礙［17］、智力殘疾、癲癇［18］和精神分裂癥［19］等。如谷氨酸和D-絲氨酸水平與抑郁癥、精神分裂癥和認(rèn)知缺陷的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)［20-22］，其中，谷氨酸能缺陷被認(rèn)為是精神分裂癥中常見(jiàn)的許多癥狀的基礎(chǔ)，特別是陰性和認(rèn)知癥狀。研究表明，谷氨酸和D-絲氨酸均是NMDAR激動(dòng)劑，可以改變NMDAR的功能。而NMDAR對(duì)神經(jīng)興奮性傳遞、突觸可塑性、學(xué)習(xí)和記憶［23］至關(guān)重要，NMDAR功能減退是精神分裂癥的一個(gè)重要病因成分［21］。此外，氨基酸對(duì)于蛋白質(zhì)合成、能量代謝和神經(jīng)傳遞等代謝過(guò)程至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，MK-801引起大鼠血漿谷氨酸和絲氨酸水平的下降，表明MK-801擾亂二者體內(nèi)代謝的穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而影響NMDAR甘氨酸位點(diǎn)的底物代謝，導(dǎo)致NMDAR功能障礙，這與人類慢性精神分裂癥患者中發(fā)現(xiàn)谷氨酸合成全面下調(diào)結(jié)果一致［24］。精神分裂癥是復(fù)雜行為和精神心理的綜合狀態(tài)，可能與多條代謝通路有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)了部分差異代謝物，并篩選出主要參與的相關(guān)代謝通路，其中顯著改變的絲氨酸、色氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸等可能成為與精神分裂癥相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，下一步將利用靶向代謝組學(xué)進(jìn)行深入研究，希望能為精神分裂癥相關(guān)機(jī)制的研究提供更進(jìn)一步的基礎(chǔ)。