楊 慶，王 鑄，許欣宇，黃開龍，，，王德朋，左怡琳，張徐祥

（1.南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，污染控制與資源化研究國家重點實驗室，江蘇南京 210023；2.廣州大學(xué)大灣區(qū)環(huán)境研究院，珠江三角洲水質(zhì)安全與保護教育部重點實驗室，廣東廣州 510006；3.南京江島環(huán)境科技研究院有限公司，江蘇南京 210019）

壬基酚（NP）作為使用量大、污染范圍廣、生物累積性和內(nèi)分泌干擾活性強的一類烷基酚物質(zhì)，是最典型的烷基酚類內(nèi)分泌干擾物，已被聯(lián)合國環(huán)境保護署確定為優(yōu)先控制污染物，同時也被歐盟列為13 種優(yōu)先控制的有毒污染物之一〔1〕。近年來，NP 在湖泊、河流、地下水、土壤等環(huán)境介質(zhì)中均有檢出〔2〕。NP 是一種重要的精細化工原料和中間體，約70%用于生產(chǎn)非離子表面活性劑壬基酚聚氧乙烯醚（NPEO，市場份額達80%以上〔3〕），環(huán)境中的NP 主要來源于NPEO 的降解〔4〕。在印染行業(yè)生產(chǎn)過程的漂白、煉煮、絲光等工序中需加入大量的染整助劑，NPEO 作為滲透劑、乳化劑、洗滌劑和分散劑被大量使用。我國每年約有6~7 億t 印染廢水排入受納水體，由于NPEO 的大量使用，其降解產(chǎn)物NP 被大量外排，環(huán)境中的NP 嚴重威脅動植物的生長與安全。NP可導(dǎo)致魚類急性致死效應(yīng)〔5-6〕，抑制種子發(fā)芽和生長〔7〕，并可通過抑制雌激素與其受體的結(jié)合破壞哺乳動物激素系統(tǒng)的正常功能〔8-9〕。因此，對印染廢水中NP的高效去除意義重大。

目前對于NP 的處理方法主要分為物理法、化學(xué)法與生物法〔10〕。生物法因成本低廉、去除率高且綠色環(huán)保，成為去除環(huán)境介質(zhì)中NP 的一種快速有效的方法〔11〕。NP 去除的生物強化技術(shù)是生物法中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，其關(guān)鍵在于功能菌株的獲取。傳統(tǒng)生物篩選是通過以特定污染物作為選擇培養(yǎng)基組分篩選獲得高效菌株，再根據(jù)降解效率進行復(fù)配，因微生物不易觀測、篩分及系統(tǒng)具有復(fù)雜性使得篩選與復(fù)配工作盲目性較高。生物分離及分子生物學(xué)技術(shù)的進步為微生物的識別與構(gòu)建提供了有效手段。磁性納米顆粒介導(dǎo)分離（MMI）技術(shù)是利用生物相容的磁性納米顆粒（MNPs）使所有微生物具有磁性，活性微生物隨著細胞分裂的進行，其表面的MNPs 逐漸脫落并最終失去磁性，通過外加磁場可將功能微生物從未分裂或不活躍且維持磁性的微生物群落中分離開來〔12〕。MMI 無需底物標記即可從復(fù)雜微生物系統(tǒng)分離具有活性的功能微生物或微生物菌群〔13〕，從微生物群落中有效分離具有污染物降解功能的微生物，從而有效提高目標微生物的相對豐度，是特定功能微生物分選富集的有力工具〔14〕。本研究基于MMI 技術(shù)對印染廢水好氧污泥進行富集分離，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，識別并獲得NP 降解的關(guān)鍵功能菌，并依據(jù)其相對豐度比例構(gòu)建復(fù)合功能菌群，同時評估復(fù)合功能菌群對印染廢水中NP 的降解效率和毒性削減效果，以期為印染廢水中NP 的高效降解提供微生物種質(zhì)資源，為印染廢水中特征污染物的生物強化降解以及廢水毒性的深度削減提供新的解決方案和技術(shù)思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 污泥來源

污泥采集自江蘇省宜興市3 個印染廠（ZX、YZ、WX）廢水處理流程中好氧池的活性污泥。

1.1.2 試劑

聚烯丙基胺鹽酸鹽（PAAH），相對分子質(zhì)量15 000~20 000，購自美國麥克林；壬基酚（Nonylphenol），優(yōu)級純，購自美國麥克林；酵母粉LP0021B、胰蛋白胨LP0042B，均購自英國Oxoid；化學(xué)試劑NH4Cl、KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnCl2·4H2O、CaCl2·2H2O、FeCl3、FeCl2等均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

1）壬基酚選擇培養(yǎng)基。

無機鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基：NH4Cl 2.5 g，KH2PO42.5 g，Na2HPO45 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g，MnCl2·4H2O 0.02 g，CaCl2·2H2O 0.05 g，蒸餾水1 000 mL，pH 在7.0~7.2之間，121 ℃高壓滅菌20 min，備用。

無機鹽-NP 液體篩選培養(yǎng)基：以無水乙醇為溶劑配制0.05 g/mL 的NP 溶液，用0.45 μm 濾膜過濾除菌后制備成NP-乙醇儲備液；在無機鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入滅菌后的NP-乙醇儲備液，使培養(yǎng)基NP 質(zhì)量濃度為200 mg/L。

選擇性固體培養(yǎng)基：在無機鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加18 g瓊脂，121 ℃高壓滅菌后倒平板，在平板上噴灑100 μL NP-乙醇儲備液并涂抹均勻，待乙醇揮發(fā)完畢后使用。

2）富集培養(yǎng)基。

LB 固體培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，瓊脂20 g/L，pH 為7.0~7.5。

LB 液體培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，pH 為7.0~7.5。

1.1.4 實際廢水

采集江蘇省宜興市某印染廠廢水處理工藝的好氧池進水，加入NP-乙醇儲備液使廢水中NP 質(zhì)量濃度分別為1、200 mg/L。

1.2 實驗方法

1.2.1 MNPs 的合成及功能化

采用改進后的化學(xué)沉淀法進行MNPs 的合成〔3，15〕。將2.0 mL 1 mol/L 的氯化鐵和0.5 mL 2 mol/L的氯化亞鐵水溶液混合并劇烈攪拌，之后滴加25 mL 2 mol/L 的氫氧化鈉溶液，持續(xù)攪拌約30 min。用永磁體對反應(yīng)溶液進行分離得到磁性納米顆粒（MNPs）沉淀，棄去上清液，用與上清液等體積的去離子水重復(fù)洗滌分離，直至MNPs 溶液的pH 為7，獲得MNPs 溶液。取5 mL 上述MNPs 溶液，將其加入到45 mL 10 g/L 的PAAH 溶液中，超聲穩(wěn)定60 min。然后放入離心機離心10 min，棄去上清液后將顆粒重懸在50 mL 去離子水中并渦旋分散，之后溶液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后得到功能化磁性納米顆粒（PAAH-MNPs）。

1.2.2 基于MMI 技術(shù)的功能菌群富集

將采集獲得的好氧污泥（ZX、YZ、WX 印染廠對應(yīng)的污泥樣品編號為ZXC-0、YZC-0、WXC-0）進行富集培養(yǎng)。污泥于4 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心10 min，取離心后固體3 g 于干凈的錐形瓶中，加入90 mL 過膜后的PAAH-MNPs 溶液，用渦旋振蕩器使污泥均勻分布在PAAH-MNPs 溶液中，之后常溫下將其置于搖床中以150 r/min 轉(zhuǎn)速振蕩20 min 后轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，用永磁體吸附沉淀，棄去上清液，加入與上清液等體積的無菌水洗滌，再次在4 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心10 min，棄去上清液，將離心后固體轉(zhuǎn)移至錐形瓶中。向錐形瓶中加入NP-乙醇溶液，使混合液中NP 質(zhì)量濃度為50 mg/L，于28 ℃置于搖床中以150 r/min 轉(zhuǎn)速馴化一周。馴化結(jié)束后用永磁體分離，取5 mL 分離后的懸濁液用無水乙醇按1∶1 體積比保存用于DNA 提?。╖X、YZ、WX 印染廠污泥對應(yīng)的功能菌培養(yǎng)后樣品編號為ZXC-50、YZC-50、WXC-50），剩余懸濁液重新功能化培養(yǎng)，提升NP 馴化質(zhì)量濃度至200 mg/L，置于搖床中于28 ℃、150 r/min 條件下馴化一周，之后取5 mL 分離后的懸濁液用無水乙醇按1∶1 體積比保存同樣用于DNA 提取（ZX、YZ、WX 印染廠污泥對應(yīng)的功能菌培養(yǎng)后樣品編號為ZXC-200、YZC-200、WXC-200），剩余懸濁液用于NP 降解菌株的篩選。

1.2.3 16S rRNA 高通量測序和微生物群落結(jié)構(gòu)分析

分別采集馴化前及馴化過程中的污泥樣本，運用DNA 提取試劑盒（FastDNA?Spin Kit，MP Biomedicals，美國）提取活性污泥的總DNA。將上述獲得的DNA 樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行16S rRNA（V3~V4 區(qū)）高通量測序。選取0.97的相似度閾值進行OTUs 劃分，最后利用RDP Classifier 算法，通過比對Greengenes 數(shù)據(jù)庫進行物種分類信息注釋〔16-17〕。基于OTUs 水平的數(shù)據(jù)，采用Bray-Curtis 算法進行主坐標分析（PCoA），評估每個樣本物種組成的相似性。

1.2.4 NP 降解菌的篩選、鑒定及功能菌群構(gòu)建

分別取不同印染廠馴化完成的好氧污泥懸濁液1 mL，將懸濁液稀釋至濃度為原濃度的10-1、10-2、10-3、10-4，取100 μL 稀釋液按濃度梯度從低到高均勻涂布到NP 篩選培養(yǎng)平板中，放于生化培養(yǎng)箱內(nèi)于28 ℃倒置培養(yǎng)3~5 d。挑取顏色、形態(tài)、大小不同的單菌落，于LB 固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，多次劃線培養(yǎng)至獲得單一菌落，觀察LB 培養(yǎng)基上菌落形態(tài)，利用革蘭氏染色法〔18〕進行初步鑒定，并于LB 斜面上劃線保存。然后將獲得的所有單一菌株通過16S rDNA技術(shù)進行分子鑒定，測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。將所獲序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 搜索同源序列比對，運用MEGA 軟件中Neighbor-Joining 方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定細菌種屬〔19〕。將純化識別得到的單菌株接種于液體LB 培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 r/min 轉(zhuǎn)速下避光振蕩培養(yǎng)。取吸光度（OD600）為1.0 的菌液，按V菌液∶V培養(yǎng)基=1∶10 接種至無機鹽-壬基酚選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，每天取樣，樣品過0.45 μm 濾膜，通過高效液相色譜法檢測培養(yǎng)過程中NP 濃度，計算NP 降解率〔20〕。

將篩選鑒定的微生物種屬與基于群落結(jié)構(gòu)分析得到的NP 降解功能種屬進行比對，選擇識別獲得的關(guān)鍵功能菌屬并參考其相對豐度進行復(fù)配，構(gòu)建基于MMI 技術(shù)識別的NP 降解關(guān)鍵功能菌群。構(gòu)建過程如下：將篩選識別的NP 降解功能菌分別接種于液體LB 培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 r/min 條件下避光振蕩培養(yǎng)至菌液吸光度（OD600）為1.0。以識別得到的各功能菌屬的相對豐度比為體積比，取不同種類單菌菌液混合均勻得到菌母液。按V菌母液∶V培養(yǎng)基=1∶10 接種菌母液至無機鹽-壬基酚選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，每天取樣，樣品過0.45 μm 濾膜后測定NP 濃度。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合功能菌群降解NP 的條件

通過單因素實驗確定對NP 降解關(guān)鍵功能菌群影響顯著的因素，包括初始pH、溫度、搖床轉(zhuǎn)速的取值范圍，進而確定正交實驗因素及水平范圍（表1）。然后利用Design Expert 軟件，以pH（A）、溫度（B）、搖床轉(zhuǎn)速（C）3 個因素為自變量，以NP 降解率為響應(yīng)值，按Box-Behnken Design（BBD）原理設(shè)計響應(yīng)面實驗〔21〕。根據(jù)軟件輸出的實驗組條件，以V菌母液∶V培養(yǎng)基=1∶10 接種復(fù)合菌群菌母液至無機鹽-壬基酚選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d取樣，樣品過0.45 μm 濾膜后測定NP 濃度，計算NP 降解率。將響應(yīng)值輸入實驗設(shè)計表后，分析最終優(yōu)化結(jié)果。在最優(yōu)條件下，測定復(fù)合菌群的生長量（吸光度OD600值）與NP 降解率。

表1 復(fù)合菌群響應(yīng)面優(yōu)化因素水平設(shè)計表Table 1 Response surface optimization factor level design table of complex flora

1.2.6 復(fù)合功能菌群對實際廢水中NP 的降解動力學(xué)研究

將復(fù)合菌群的菌母液按V菌母液∶V培養(yǎng)基=1∶10 的接種量接種至實際廢水中，在最優(yōu)降解條件下培養(yǎng)，定時（0 h、2 h、4 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）取樣測定NP 濃度，利用零級動力學(xué)模型和一級動力學(xué)模型對降解數(shù)據(jù)進行擬合。

1.2.7 復(fù)合功能菌群對實際廢水毒性削減研究

毒性實驗設(shè)置對照組（不加菌）和處理組（投加復(fù)合菌劑）。在最優(yōu)降解條件下采用復(fù)合功能菌群處理NP 初始質(zhì)量濃度分別為1、200 mg/L 的實際廢水，分別采集處理過程中不同時間段的反應(yīng)液3 mL，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾得到濾液，作為毒性實驗樣品。發(fā)光細菌急性毒性和類雌激素效應(yīng)分別采用國家標準《水質(zhì)急性毒性測定 發(fā)光細菌法》（GB/T 15441—1995）的優(yōu)化方法〔22〕和重組酵母Saccharomyces cerevisiae BLYES 培養(yǎng)法〔23〕測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于MMI 技術(shù)對NP 降解功能菌群的識別

對3 個印染廠廢水處理工藝好氧段活性污泥經(jīng)MMI 富集分離的樣品進行PCoA 分析，結(jié)果見圖1。

圖1 基于MMI 富集分離污泥樣品的PCoA 分析Fig. 1 PCoA analysis of sludge samples based on MMI enrichment and isolation

由圖1 可知，初始活性污泥樣本中ZXC-0 與另外兩個廠區(qū)的微生物結(jié)構(gòu)差異較大，這可能是由于工藝差別所致，ZX 處理工藝為單一“好氧處理”，而YZ 與WX 處理工藝為“厭氧-好氧”組合工藝。經(jīng)MMI 富集馴化后，來源不同的種泥中微生物群落結(jié)構(gòu)趨于相似，且隨著NP 馴化濃度的增加，樣本間微生物群落結(jié)構(gòu)相似度逐漸升高。

對不同印染廠廢水處理工藝好氧活性污泥在MMI富集過程中群落結(jié)構(gòu)的變化進行分析，結(jié)果見圖2。

圖2 基于MMI 富集分離的微生物群落結(jié)構(gòu)及優(yōu)勢種屬Fig. 2 Microbial community structure and dominant species analysis based on MMI enrichment and isolation

由圖2（a）可知，初始活性污泥ZXC-0、YZC-0、WXC-0 優(yōu)勢菌門分別為變形菌門（Proteobacteria，61.23%）、綠彎菌門（Chloroflexi，16.75%）、unclassified_Bacteria（9.25%）。隨著NP 馴化濃度的增加，3 種污泥中變形菌門（Proteobacteria，61.23%~83.24%）、厚壁菌門（Firmicutes，0.62%~9.53%）與放線菌門（Actinobacteria，1.89%~3.02%）的平均相對豐度均上升，逐漸成為馴化體系中的優(yōu)勢菌門，最終總豐度超過90%。其中，變形菌門的平均相對豐度83.24%，表明其對NP具有較強的耐受性〔24〕。

由圖2（b）可知，未馴化前污泥中優(yōu)勢菌目分別為嗜甲基菌目（Methylophilales，17.85%）、著色菌目（Chromatiales，15.66%）、紅環(huán)菌目（Rhodocyclales，10.09%）、交替單胞菌目（Alteromonadales，9.05%）。隨著NP 馴化濃度的增加，腸桿菌目（Enterobacteriales，0.53%~33.93%）、伯克氏菌目（Burkholderiales，3.38%~21.29%）、假單胞菌目（Pseudomonadales，1.04%~22.86%）、氣單胞菌目（Aeromonadales，1.15%~8.23%）、梭菌目（Clostridiales，1.16%~10.67%）、放線菌目（Actinomycetales，0.57%~0.72%）、彎曲桿菌目（Campylobacterales，0.13%~0.58%）的相對豐度均有所增加，表明上述菌目可能與NP 的降解相關(guān)。

進一步解析上述菌目中相對豐度超過0.5%的屬，結(jié)果如圖2（c）所示，未馴化前的優(yōu)勢菌屬為氣單胞菌屬（Aeromonas，13.41%）、unclassified_Actinobacteria（9.40%）、unclassified_Burkholderiales（8.85%）、Delftia（8.65%）等。隨NP馴化濃度的增加，unclassified_Enterobacteriaceae（5.33%~30.17%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，6.53%~28.63%）、水桿形菌屬（Undibacterium，1.52%~9.32%）、Clostridium_sensu_stricto（2.62%~10.32%）、貪銅菌屬（Cupriavidus，4.31%~9.45%）、紫色桿菌屬（Janthinobacterium，1.37%~7.55%）、短波單胞菌屬（Brevundimonas，0.31%~5.63%）、梭形桿菌屬（Fusibacter，0.55%~0.99%）、溫泉胞菌屬（Fonticella，0.16%~0.91%）、從單胞菌屬（Comamonas，0.25%~0.73%）、弓形菌屬（Arcobacter，0.08%~0.63%）、unclassified_Oxalobacteraceae（0.11%~0.63%）、龍包茨氏菌屬（Romboutsia，0.12%~0.28%）、纖維單胞菌屬（Cellulomonas，0.037%~0.23%）、土生孢桿菌屬（Terrisporobacter，0.024%~0.17%）、解蛋白質(zhì)菌屬（Proteiniclasticum，0.05%~0.15%）的相對豐度都有所增加。其中unclassified_Enterobacteriaceae、Pseudomonas、Undibacterium、Clostridium_sensu_stricto、Cupriavidus、Janthinobacterium、Brevundimonas在NP馴化過程中，不同廠污泥中平均相對豐度超過5%且相比未馴化前增加2倍以上〔圖2（d）〕，上述菌屬即為MMI 技術(shù)富集分離識別出的具有潛在降解NP 性能的關(guān)鍵功能菌屬。研究表明，貪銅菌〔25〕、假單胞菌〔26〕均可降解NP，降解率在49.63%~72.83%之間；Undibacterium對內(nèi)分泌干擾物鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）的降解有一定促進作用〔27〕；Enterobacteriaceae細菌多具有抗生素耐藥基因〔28〕；Clostridium_sensu_stricto可促進醇類的氧化〔29〕；Janthinobacterium可進行異養(yǎng)硝化作用〔30〕；Brevundimonas具有耐藥性且對有機磷農(nóng)藥有降解作用〔31〕。因此，基于MMI 富集分離識別的潛在關(guān)鍵菌屬包括抗藥優(yōu)勢菌株、NP 主要代謝菌株、氮磷代謝菌株，其中以抗藥優(yōu)勢菌、NP 主要代謝菌優(yōu)勢最大，是NP 降解的關(guān)鍵功能菌。

2.2 壬基酚降解菌的篩選、構(gòu)建與評價

在NP 選擇培養(yǎng)基中，采用稀釋涂布法從MMI 富集分離后的活性污泥樣本中共篩選獲得12 株生長較快的菌株。經(jīng)純化分離擴大培養(yǎng)、革蘭氏染色及16S rRNA 鑒定（表2），本研究獲得2 株檸檬酸桿菌（Citrobacter freundiistrain WXC-1、Citrobacter werkmaniistrain ZXC-1）、2 株嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophilastrain ZXB-1、Aeromonas hydrophilastrain YZC-2）、1 株水稻食酸菌（Acidovorax oryzaeZXB-4）、2 株假單胞菌（Pseudomonas veroniistrain ZXB-2、Pseudomonas sivasensisstrain WXB-4）、1 株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilissubsp. WXB-1）、1 株貪銅菌（Cupriavidus basilensisstrain YZB-1）、2 株腸桿菌（Enterobacter moristrain WXB-3、Enterobacter moristrain WXB-2）、1 株類肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella quasipneumoniaeYZC-1）。其中腸桿菌、假單胞菌和貪銅菌與微生物群落中識別的NP 降解關(guān)鍵功能菌屬一致，表明腸桿菌、假單胞菌和貪銅菌能夠直接利用NP 作為碳源進行代謝。

表2 MMI 富集培養(yǎng)所篩選菌株的形態(tài)及鑒定結(jié)果Table 2 Morphology and identification results of the strains screened by MMI enrichment culture

上述腸桿菌、假單胞菌和貪銅菌涉及到的5 株降解菌Pseudomonas veroniistrain ZXB-2、Pseudomonas sivasensisstrain WXB-4、Cupriavidus basilensisstrain YZB-1、Enterobacter moristrain WXB-3、Enterobacter moristrain WXB-2 對200 mg/L NP 的降解率見圖3。

圖3 單一菌株對NP 的降解效率Fig. 3 Degradation efficiency of NP by a single type of strain

由圖3 可知，5 株降解菌對NP 的降解速率隨時間延長均呈現(xiàn)先增加再降低的趨勢，且不同微生物處理下NP 最終降解率差異顯著，降解反應(yīng)7 d 后各菌株對200 mg/L NP 的降解率分別為（86.67±1.21）%、（82.53±3.02）% 、（72.7±3.10）% 、（80.38±1.65）% 、（74.81±1.35）%。優(yōu)選腸桿菌Enterobacter moristrain WXB-3、假單胞菌Pseudomonas veroniistrain ZXB-2 與貪銅菌Cupriavidus basilensisstrain YZB-1 進行復(fù)配，根據(jù)馴化后unclassified_Enterobacteriaceae（30.17%）、Pseudomonas（28.63%）、Cupriavidus（9.45%）的相對豐度比2∶2∶1，構(gòu)建得到NP 降解復(fù)合功能菌群，如圖4 所示，其對200 mg/L 壬基酚7 d 降解率達到90%以上，相比單一菌株降解效率有所提高，表明菌株之間存在協(xié)同作用。楊振東等〔25-26〕通過直接篩選獲得的不同NP 降解菌株對NP 的降解率差異較大，在49.63%~72.83%之間；馬娟等〔10〕采用未經(jīng)馴化識別的復(fù)配菌株對NP 進行降解，NP降解率達到72.84%~80.00%；本研究基于MMI富集識別篩選得到的NP降解菌對NP的降解率均在70%以上，所構(gòu)建的復(fù)合菌群對NP的降解率可達90.92%。綜上，基于MMI馴化富集可有效識別出污泥中污染物關(guān)鍵降解功能菌，且基于富集豐度比例構(gòu)建所得的復(fù)合菌群對NP的降解率比單一菌株提高了4.25%~18.22%，為污染物降解關(guān)鍵功能菌群的構(gòu)建提供了參考。

圖4 復(fù)合菌群對NP 的降解效率Fig. 4 Degradation efficiency of NP by complex flora

2.3 復(fù)合菌群降解條件響應(yīng)面優(yōu)化

初始pH、溫度、氧氣條件是影響NP生物降解的主要環(huán)境因素〔32〕。研究表明，在初始pH 6~9〔26〕、溫度25~40 ℃〔25〕、好氧及厭氧條件下NP 均可被生物降解，且好氧條件下NP礦化速率隨體系溶解氧濃度升高而顯著提高〔33〕。在單因素實驗基礎(chǔ)上，設(shè)置因素最優(yōu)水平范圍，對初始pH、溫度及影響體系溶解氧濃度的搖床轉(zhuǎn)速3個因素進行響應(yīng)面優(yōu)化。

根據(jù)表3所示的正交實驗直觀分析結(jié)果，利用響應(yīng)面法對復(fù)合菌群降解NP 的應(yīng)用條件進行優(yōu)化，方差分析結(jié)果見表4。建立以pH（A）、溫度（B）、搖床轉(zhuǎn)速（C）為自變量，NP去除率（Y，%）為因變量的二次多項式，得到擬合回歸模型為：Y=90.03-1.13A-4.48B-2.76C-1.09AB-2.96AC+1.69BC-13.50A2+0.55B2-18.54C2。

表3 復(fù)合菌群反應(yīng)條件響應(yīng)面優(yōu)化直觀分析Table 3 Reaction condition response surface optimization analysis of complex flora

表4 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface regression model

由表4 可知，模型擬合效果良好（F值為16.57，p<0.001），失擬項對模型的影響不顯著（p>0.05），說明該模型能夠充分擬合實驗數(shù)據(jù)，準確分析NP 降解率且誤差小。一次項B對模型的影響為顯著（p<0.05），二次項A2和C2對模型的影響均極顯著（p<0.01）。其中溫度p值小于0.05，表示溫度對NP 降解效率影響顯著。

模型的決定系數(shù)R2為0.955 2，校正決定系數(shù)AdjR-Squared 為0.897 5，表明模型的相關(guān)度較好。響應(yīng)面圖是響應(yīng)值和各因素構(gòu)成的三維空間的曲面圖，等高線圖的形狀傳達了交互作用的水平和性質(zhì)。 本研究所得響應(yīng)面圖和等高線圖見圖5。

圖5 不同因素交互作用對NP 去除率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig. 5 Response surface and contour plots of the interaction of different factors on NP removal rate

由圖5 可知，pH-溫度、溫度-搖床轉(zhuǎn)速曲面呈現(xiàn)不均勻的變化且等高線中無完整的橢圓形，表明其交互作用顯著且溫度的影響最顯著。pH-搖床轉(zhuǎn)速曲面呈現(xiàn)完整的橢圓形且搖床轉(zhuǎn)速變化方向等高線較密集，表明pH 與搖床轉(zhuǎn)速交互作用不顯著，搖床轉(zhuǎn)速影響更顯著。因此，影響NP 降解率的因素順序為：溫度（B）>搖床轉(zhuǎn)速（C）>pH（A）。經(jīng)過二元多項式的擬合和曲面分析，預(yù)測復(fù)合功能菌群的最佳應(yīng)用條件為：pH 6.87、溫度30.16 ℃、搖床轉(zhuǎn)速141.57 r/min，此條件下，降解7 d 后NP 降解率可達（94.80±4.19）%。

在優(yōu)化條件下，通過測量NP 的殘余量、菌體的生長量可獲得復(fù)合功能菌群生長曲線和NP 降解曲線，結(jié)果見圖6。

由圖6 可知，復(fù)合功能菌群適應(yīng)期較短，0~2 h 生物量即有增長；2~72 h 時，復(fù)合功能菌群進入對數(shù)生長期，OD600值顯著增加；72 h 后功能菌群基本進入穩(wěn)定期，微生物濃度不再增加，且隨著時間的增加有降低的趨勢。NP 降解實驗表明，初始NP 質(zhì)量濃度為200 mg/L 時，菌群對環(huán)境適應(yīng)較快，降解底物充足，功能菌群對NP 的降解速率隨著功能菌群生物量的增加而增加，且降解速率較快；進入穩(wěn)定期后NP 持續(xù)降解但趨于平穩(wěn)，在第7 天NP 降解率達到96.87%，與預(yù)測值較吻合。

2.4 復(fù)合菌群的壬基酚降解動力學(xué)分析

在優(yōu)化條件下，采用復(fù)合功能菌群處理NP 質(zhì)量濃度分別為1、200 mg/L 的實際印染廢水，考察NP 降解速率，并采用動力學(xué)模型對其進行擬合，較優(yōu)擬合結(jié)果見圖7、表5。

圖7 最優(yōu)條件下復(fù)合菌群處理實際廢水中NP 的降解動力學(xué)曲線Fig. 7 Kinetic curve of NP degradation in practical wastewater treated by complex flora under optimal conditions

表5 復(fù)合菌群降解不同濃度NP 的動力學(xué)方程及半衰期Table 5 Kinetic equation and half-life of NP degradation by complex flora

如圖7 所示，在最優(yōu)反應(yīng)條件下，復(fù)合菌群對實際廢水的適應(yīng)性較好，反應(yīng)30 h 后其對低質(zhì)量濃度NP（1 mg/L）的降解率可達100%，降解過程較符合一級動力學(xué)反應(yīng)；反應(yīng)7 d 后對高質(zhì)量濃度NP（200 mg/L）的降解率可達92.8%，降解過程較符合零級動力學(xué)反應(yīng)。表5 顯示復(fù)合菌群對低質(zhì)量濃度NP（1 mg/L）的降解半衰期為（7.69±0.05） h，對高質(zhì)量濃度NP（1 mg/L）的降解半衰期為（3.11±0.11） d。楊振東等〔25〕研究發(fā)現(xiàn)，微生物對NP（10 mg/L 以下）的降解過程一般符合一級動力學(xué)曲線，NP 的半衰期為44.44~48.02 h，本研究構(gòu)建的復(fù)合菌群顯著縮短了NP 的降解半衰期，且對高濃度NP 的降解反應(yīng)更接近零級動力學(xué)模型，這可能與高濃度NP 存在的毒性有關(guān)，高濃度條件下初期污水毒性較強，對生物降解存在一定抑制作用。

2.5 壬基酚生物降解過程的毒性評估

復(fù)合功能菌群處理不同濃度NP 實際廢水過程中水質(zhì)急性毒性與類雌激素效應(yīng)變化情況見圖8。

圖8 復(fù)合菌群處理實際廢水過程中急性毒性和類雌激素效應(yīng)變化（*p<0.05，**p<0.01）Fig. 8 Changes of acute toxicity and estrogenic effect in the treatment of practical wastewater by complex flora（*p<0.05，**p<0.01）

由圖8 可知，復(fù)合功能菌群對NP 的解毒效果顯著。當(dāng)NP 質(zhì)量濃度為1 mg/L 時，實際廢水的急性毒性表現(xiàn)為低毒（HgCl2毒性當(dāng)量<0.07）〔34〕，雌激素活性相當(dāng)于0.68 ng/L 雌二醇（E2）；隨著處理時間的增加，對照組急性毒性和類雌激素效應(yīng)有一定程度降低但不顯著，處理組急性毒性和類雌激素效應(yīng)則隨時間的增加而降低，6 h 后其急性毒性和類雌激素效應(yīng)較對照組降低顯著，最終處理組急性毒性和類雌激素效應(yīng)較對照組分別降低了64.29%和76.47%。當(dāng)NP 質(zhì)量濃度為200 mg/L 時，實際廢水急性毒性表現(xiàn)為高毒（0.12

3 結(jié)論

1）基于MMI富集分離方法從不同印染廢水活性污泥中富集的優(yōu)勢菌包括unclassified_Enterobacteriaceae（30.17%）、Pseudomonas（28.63%）、Undibacterium（9.32%）、Clostridium_sensu_stricto（10.32%）、Cupriavidus（9.45%）、Janthinobacterium（7.55%）、Brevundimonas（5.63%），其中unclassified_Enterobacteriaceae、 Pseudomonas、 Undibacterium、Clostridium_sensu_stricto、Cupriavidus為主要的碳代謝菌株，是潛在的NP 降解關(guān)鍵功能菌屬。

2）從馴化富集的活性污泥中篩選獲得NP 降解關(guān)鍵功能菌Pseudomonas veroniistrain ZXB-2、Pseudomonas sivasensisstrain WXB-4、Cupriavidus basilensisstrain YZB-1、Enterobacter moristrain WXB-3、Enterobacter moristrain WXB-2，其對200 mg/L NP 的降解率分別為86.67%、82.53%、72.7%、80.38%、74.81%；由此構(gòu)建NP 降解復(fù)合功能菌群，該菌群對200 mg/L NP降解率達90%以上。

3）響應(yīng)面優(yōu)化得到復(fù)合菌群降解NP 的影響因素及其排序為溫度>搖床轉(zhuǎn)速>pH，最佳應(yīng)用條件為pH 6.87、溫度30.16 ℃、搖床轉(zhuǎn)速141.57 r/min，此條件下復(fù)合菌群對200 mg/L NP 的降解率達96.87%。

4）復(fù)合菌群降解實際廢水中低質(zhì)量濃度NP（1 mg/L）的過程較符合一級動力學(xué)模型，NP 半衰期為（7.69±0.05） h；降解實際廢水中高質(zhì)量濃度NP（200 mg/L）的過程較符合零級動力學(xué)模型，NP半衰期為（3.11±0.11） d。

5）功能菌群對實際廢水的脫毒效果顯著，低質(zhì)量濃度NP（1 mg/L）廢水經(jīng)處理后，急性毒性和類雌激素效應(yīng)分別降低64.29%和76.47%；高質(zhì)量濃度NP（200 mg/L）廢水經(jīng)處理后，急性毒性由高毒降為低毒，毒性降低了58.21%，類雌激素效應(yīng)降低了88.34%。