喬曉莉，曹寧寧，王清果，劉曉軍，張海芳，肖學(xué)鳳

（1.天津市南開(kāi)醫(yī)院，天津 300100；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津300250；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617；4.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 301617）

清熱利膽片是天津市南開(kāi)醫(yī)院研制的院內(nèi)中藥制劑，由茵陳、金錢(qián)草、夏枯草、大黃、黃芩、厚樸6 味藥組成。方中茵陳清利濕熱、利膽退黃，且為黃疸要藥，為君藥；金錢(qián)草利濕退黃、利尿通淋，夏枯草清肝瀉火、散結(jié)消腫，兩者合用增強(qiáng)組方利膽之功效，共為臣藥；大黃清熱瀉火、瀉下攻積，黃芩清熱燥濕、瀉火解毒，厚樸燥濕消痰、下氣除滿，三者共為佐藥，泄化濕熱。6 味藥共奏清熱利膽之效，臨床用于治療急性單純性和輕度化膿性膽囊炎、膽管炎，急性膽囊胰腺炎，膽道術(shù)后綜合征等，療效顯著[1]。清熱利膽片的化學(xué)成分復(fù)雜，現(xiàn)院內(nèi)制定的制劑質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)僅測(cè)定大黃素和大黃酚的含量，難以對(duì)清熱利膽片進(jìn)行較為全面的評(píng)價(jià)，且目前關(guān)于清熱利膽片的報(bào)道較少，僅1 篇文獻(xiàn)測(cè)定了清熱利膽片中10 個(gè)成分的含量[2]。為較全面地反映清熱利膽片的內(nèi)在質(zhì)量，提高質(zhì)量評(píng)價(jià)水平，需建立一套靈敏、穩(wěn)定的清熱利膽片質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。

中藥指紋圖譜作為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要方法，可反映化學(xué)成分的整體組成和特征[3]，但無(wú)法在“量”上為制劑提供質(zhì)量保證，而這正是多成分定量分析的優(yōu)勢(shì)[4]。中藥指紋圖譜與多成分含量測(cè)定相結(jié)合，可更好地反映中藥制劑的內(nèi)在質(zhì)量，且近年來(lái)中藥指紋圖譜結(jié)合多成分含量測(cè)定的方法已逐漸應(yīng)用于中藥制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)[5]。因此，本研究建立了15 批清熱利膽片的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，同時(shí)對(duì)其中14 個(gè)成分進(jìn)行多成分含量測(cè)定，以期提高清熱利膽片質(zhì)量評(píng)價(jià)水平。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent1260 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Eclipse XDB-C18色譜柱（美國(guó)Agilent 公司）；SHIMADZUAUW120D 分析天平（日本島津公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵（河南省予華儀器有限公司）；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥品 綠原酸（批號(hào)：110753-202119，純度為96.3%），蘆?。ㄅ?hào)：100080-201811，純度為92.4%），金絲桃苷（批號(hào)：111521-201809，純度為94.9%），迷迭香酸（批號(hào)：111871-202007，純度為98.1%），黃芩苷（批號(hào)：110715-202223，純度為97.2%），槲皮素（批號(hào)：100081-201610，純度為99.80%），蘆薈大黃素（批號(hào)：110795-201710，純度為98.3%），大黃酸（批號(hào)：110757-201607，純度為99.30%），大黃素（批號(hào)：110756-201512，純度為98.7%），和厚樸酚（批號(hào)：110730-201915，純度為99.8%），厚樸酚（批號(hào)：110729-202015，純度為99.0%），大黃酚（批號(hào)：110796-201922，純度為99.4%），大黃素甲醚（批號(hào)：110758-201817，純度為99.2%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；山奈酚（批號(hào)：520-18-3，純度為98.0%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；乙腈（色譜純，DIKMA 公司）；甲醇（色譜純，天津市康科德科技有限公司）；磷酸（分析純，天津市化學(xué)試劑供銷(xiāo)公司）；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈飲用純凈水，其他試劑均為分析純。15 批清熱利膽片均為天津市南開(kāi)醫(yī)院研制的院內(nèi)中藥制劑，編號(hào)分別為S1～S15，具體信息見(jiàn)表1。

表1 清熱利膽片樣品信息Tab.1 Sample information of Qingre Lidan Tablet

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、迷迭香酸、黃芩苷、槲皮素、山奈酚、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、和厚樸酚、厚樸酚、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，加甲醇配制成質(zhì)量濃度為500.33、200.79、101.49、500.52、3005.21、500.62、399.01、350.97、380.28、415.74、898.26、2002.13、967.25、246.92 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。測(cè)定前用甲醇稀釋0、5、10、20、40 和80 倍，得到系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 清熱利膽片供試品溶液的制備 取清熱利膽片10 片，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置于塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（360 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm 濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性供試品及單味藥材溶液的制備 按照清熱利膽片處方制備工藝，制備茵陳、金錢(qián)草、夏枯草、大黃、黃芩、厚樸的陰性樣品，再按“2.1.2”項(xiàng)下方法制得各陰性供試品溶液。取各單味藥材，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備單味藥材溶液。

2.2 指紋圖譜研究

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Eclipse XDB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：0.1%磷酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0～22 min，5%～20% B；22～61 min，20%～41% B；61 ～67 min，41%～60% B；67 ～74 min，60%～66% B；74～83 min，66%～85% B；83～83.1 min，85%～5% B；83.1～86 min，5% B；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：294 nm。

2.2.2 方法學(xué)考察 1）精密度實(shí)驗(yàn)。取同一份清熱利膽片（S7）按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄圖譜數(shù)據(jù)。選取黃芩苷（28 號(hào)峰）作為參照，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 值為0.11%～0.25%，相對(duì)峰面積的RSD 值為0.20%～0.79%，表明儀器精密度良好。

2）重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。取6 份清熱利膽片（S7）按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄圖譜數(shù)據(jù)。選取黃芩苷（28 號(hào)峰）作為參照，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 值為0.29%～0.56%，相對(duì)峰面積的RSD 值為1.41%～2.93%，表明該方法重復(fù)性良好。

3）穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。取同一份清熱利膽片（S7）按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、6、8、10、24 h 進(jìn)樣，記錄圖譜數(shù)據(jù)。選取黃芩苷（28 號(hào)峰）作為參照，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 值為0.09%～0.23%，相對(duì)峰面積的RSD 值為0.96%～1.27%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3 指紋圖譜的建立及相似度分析 取15 批清熱利膽片按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，將圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)開(kāi)發(fā)的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）進(jìn)行數(shù)據(jù)匹配，以S7 為參照色譜圖，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度設(shè)為0.1 min，進(jìn)行多點(diǎn)校正和色譜峰匹配，得到15 批樣品的指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜，分別見(jiàn)圖1 和圖2，共標(biāo)定出62 個(gè)共有峰，計(jì)算15 批樣品的相似度在0.983～0.996，結(jié)果見(jiàn)表2。15 批清熱利膽片的指紋圖譜相似度均大于0.983，表明清熱利膽片批次間一致性良好，整體質(zhì)量穩(wěn)定。

圖1 15 批清熱利膽片HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint chromatogram of 15 batches of Qingre Lidan Tablet

圖2 清熱利膽片對(duì)照指紋圖譜Fig.2 Representative fingerprint chromatogram of Qingre Lidan Tablet

圖3 清熱利膽片樣品、混合對(duì)照品、各陰性樣品及單味藥的HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of Qingre Lidan Tablet sample，mixed reference substances，negative sample andsingle-flavor medicine

表2 15 批清熱利膽片相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.2 Similarity evaluation of 15 batches of Qingre Lidan Tablet

2.2.4 共有峰歸屬與指認(rèn) 取清熱利膽片供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、各陰性供試品及單味藥材溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄圖譜數(shù)據(jù)，并對(duì)共有峰進(jìn)行歸屬，其中7、12～14、16、17、32、38～40、49、50 號(hào)峰歸屬于茵陳，2、5、7、15、16、22、23、29、30、33、43 號(hào)峰歸屬于金錢(qián)草，18、20、21、24、25、53～56 號(hào)峰歸屬于夏枯草，1、3、4、8～14、34～36、38～41、44～52、58、60～62 號(hào)峰歸屬于大黃，19、26～28、32、33、37、42、43、53～56 號(hào)峰歸屬于黃芩，13～15、31、32、46、47、49～52、57、59 號(hào)峰歸屬于厚樸。經(jīng)對(duì)照品比對(duì)指認(rèn)14 個(gè)色譜峰，分別為7 號(hào)峰綠原酸、16 號(hào)峰蘆丁、17 號(hào)峰金絲桃苷、25 號(hào)峰迷迭香酸、28 號(hào)峰黃芩苷、33 號(hào)峰槲皮素、43 號(hào)峰山奈酚、51 號(hào)峰蘆薈大黃素、52 號(hào)峰大黃酸、57 號(hào)峰厚樸酚、58 號(hào)峰大黃素、59 號(hào)峰厚樸酚、60 號(hào)峰大黃酚、61 號(hào)峰大黃素甲醚。

2.3 多成分含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜條件同“2.2.1”。

2.3.2 方法學(xué)考察 1）專屬性考察。取空白溶劑、混合對(duì)照品溶液、清熱利膽片樣品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，色譜圖如圖4。結(jié)果表明，混合對(duì)照品溶液與供試品溶液在相同保留時(shí)間處均有相應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)，且空白溶劑指標(biāo)性成分出峰處無(wú)干擾，說(shuō)明方法專屬性良好。

圖4 專屬性考察色譜圖Fig.4 Chromatograms for investigation of specificity

2）線性關(guān)系考察。取“2.1.1”項(xiàng)下稀釋后的系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄各對(duì)照品的色譜峰面積，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y），各對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表3，各對(duì)照品線性關(guān)系良好。

表3 清熱利膽片中14 個(gè)成分的線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.3 Linear relationship of 14 components in Qingre Lidan Tablet

3）精密度實(shí)驗(yàn)。取同一份清熱利膽片（S7）按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次。14 個(gè)成分峰面積的RSD 值為0.12%～0.85%，表明儀器精密度良好，符合含量測(cè)定的要求。

4）重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。取同一批清熱利膽片（S7）6 份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。14 個(gè)成分峰面積的RSD 值為1.34%～2.10%，表明該方法重復(fù)性良好，符合含量測(cè)定的要求。

5）穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。取同一份清熱利膽片（S7）按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、6、8、10、24 h 進(jìn)樣。14 個(gè)成分峰面積的RSD 值為0.49%～1.26%，表明供試品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定，符合含量測(cè)定的要求。

6）加樣回收率實(shí)驗(yàn)。取同一批已知含量的清熱利膽片（S7）6 份，每份約0.05 g，分別按樣品：對(duì)照品（1∶1）的比例加入各對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。14 個(gè)成分的加樣回收率為98.97%～100.89%，RSD 值為0.37%～2.81%。

2.3.3 樣品含量測(cè)定 取15 批清熱利膽片按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄14 個(gè)成分峰面積，計(jì)算其在15 批樣品中的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 15 批清熱利膽片中14 種成分含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.4 Results of the 14componentscontent determinationof samples of 15 batches of Qingre Lidan Table（tn=3） mg/片

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化 清熱利膽片中化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有酚酸類[6-7]、蒽醌類[8]、黃酮類[9-10]、酚類[11]等成分?！吨袊?guó)藥典》（2020 年）中，茵陳、金錢(qián)草、夏枯草、大黃、黃芩、厚樸含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為327、360、330、254、280、294 nm[12]，為實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分的同時(shí)測(cè)定，本研究對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在294 nm 波長(zhǎng)下，色譜峰數(shù)量較多，且峰強(qiáng)度較為適中，基線相對(duì)穩(wěn)定，故選擇294 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。另外，本研究考察了流動(dòng)相（水-乙腈、水-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.1%磷酸水溶液-乙腈、0.2%磷酸水溶液-乙腈）、柱溫（30、35、40 ℃）、流動(dòng)相流速（0.3、0.5、1.0 mL/min），最終確定色譜條件為乙腈-0.1%的磷酸溶液梯度洗脫，柱溫35 ℃，流速1.0 mL/min 時(shí)，色譜峰峰數(shù)較多，紫外吸收較強(qiáng)，峰形對(duì)稱，分離度較好，且基線較為平穩(wěn)。

3.2 指紋圖譜結(jié)果分析 15 批清熱利膽片的HPLC 指紋圖譜共確定62 個(gè)共有峰，并指認(rèn)出其中14 個(gè)成分。以峰形、分離度較好的黃芩苷為參照峰，15 批清熱利膽片樣品相似度較高，各成分保留時(shí)間穩(wěn)定，表明所建立的指紋圖譜方法穩(wěn)定可靠。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，15 批清熱利膽片的指紋圖譜相似度均大于0.983，表明清熱利膽片批次間一致性良好，化學(xué)成分基本一致，整體質(zhì)量穩(wěn)定。

3.3 指標(biāo)成分的選擇 清熱利膽片由茵陳、金錢(qián)草、夏枯草、大黃、黃芩、厚樸6 味藥組成，綠原酸、槲皮素、山奈酚、迷迭香酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、黃芩苷、厚樸酚和厚樸酚分別為《中國(guó)藥典》（2020 年版）規(guī)定的6 味中藥含量測(cè)定指標(biāo)成分[12]。且現(xiàn)代研究表明，以上成分具有保肝、抑制肝纖維化、促進(jìn)膽汁分泌等藥理作用，如綠原酸、厚樸酚和和厚樸酚對(duì)四氯化碳（CCl4）所致肝損傷小鼠具有肝保護(hù)作用[13-14]，其中綠原酸還可通過(guò)抑制TLR4（Toll 樣受體4）/NF-κB（核因子-κB）信號(hào)通路來(lái)預(yù)防刀豆蛋白（Con A）誘導(dǎo)的小鼠肝炎[15]；金絲桃苷可減輕急性酒精性肝損傷小鼠的肝纖維化和損傷[16]；山奈酚可下調(diào)脂多糖誘導(dǎo)的Kupffer 細(xì)胞活化及HIF-1α/HK2 表達(dá)，抑制糖酵解和乳酸生成，顯著減少炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激，進(jìn)而發(fā)揮肝細(xì)胞保護(hù)作用[17]；槲皮素可降低肝臟中總膽汁酸水平，同時(shí)升高血清中總膽汁酸水平[18]；蘆丁為槲皮素的一種糖苷，能夠有效改善經(jīng)前煩躁障礙肝氣逆證的情緒和軀體癥狀[19]；迷迭香酸和黃芩苷可以抑制肝星狀細(xì)胞中典型Wnt 信號(hào)介導(dǎo)的過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）表達(dá)，從而抑制膽汁淤積性肝纖維化[20]。研究發(fā)現(xiàn)大黃總蒽醌能夠減輕肝損傷，有效改善肝纖維化[21-22]，其中大黃素可通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、減輕肝細(xì)胞凋亡從而減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肝損傷[23]；大黃酚和大黃素甲醚可減輕非酒精性肝損傷和酒精性肝損傷的肝脂肪變性[24-25]；蘆薈大黃素可減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝紊亂[26]；大黃酸抑制肝星形細(xì)胞激活，來(lái)降低膽汁淤積性肝纖維化程度[27]。因此，以上成分為清熱利膽片的保肝利膽藥效相關(guān)成分。

本研究共選擇14 個(gè)成分作為質(zhì)量控制的成分，其中綠原酸為君藥茵陳的指標(biāo)成分，迷迭香酸為臣藥夏枯草的指標(biāo)成分，黃芩苷為黃芩的指標(biāo)成分，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚均為佐藥大黃的指標(biāo)成分，厚樸酚和厚樸酚為佐藥厚樸的指標(biāo)成分；槲皮素、山奈酚和蘆丁為茵陳、金錢(qián)草和夏枯草的共有成分，金絲桃苷為茵陳和夏枯草的共有成分。這14 個(gè)成分的選擇，既考慮到君臣佐的配伍意義，又兼顧保肝利膽藥效作用，提高了清熱利膽片質(zhì)量評(píng)價(jià)的水平。

3.4 含量測(cè)定結(jié)果分析 本研究通過(guò)混合對(duì)照品比對(duì)指認(rèn)了14 個(gè)共有峰，分別為綠原酸、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚、蘆丁、迷迭香酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、黃芩苷、厚樸酚、和厚樸酚。在此基礎(chǔ)上，對(duì)指認(rèn)出的成分進(jìn)行含量測(cè)定，測(cè)得其平均含量分別為（0.31±0.04）（0.04±0.01）（0.25±0.02）（0.20±0.06）（0.10±0.02）（0.23±0.05）（0.17±0.01）（0.19±0.02）（0.18±0.03）（0.56±0.08）（0.14±0.02）（1.98±0.17）（1.03±0.12）（0.65±0.04）mg/片。

本研究建立的清熱利膽片HPLC 指紋圖譜及14 個(gè)成分含量測(cè)定方法穩(wěn)定可靠、操作簡(jiǎn)便，可為清熱利膽片的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。