崔方強，王悅芬，蔡朕，孟元，江心燦，趙文景

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010）

糖尿病腎?。―N）已經(jīng)成為中國終末期腎?。‥SRD）及透析患者的主要原發(fā)腎臟疾病[1]，但目前針對DN 發(fā)病的關(guān)鍵病理機制缺少相對應(yīng)的治療措施。研究表明，腎小球炎癥介導(dǎo)的系膜基質(zhì)增生是DN 發(fā)生及進展的重要病理機制[2]。而抑制炎癥減輕系膜基質(zhì)增生可能成為DN 治療的潛在靶點[3]。中醫(yī)藥在防治DN 方面具有獨特的優(yōu)勢，保腎通絡(luò)方為首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院腎病科臨床經(jīng)驗方，被廣泛應(yīng)用于臨床防治DN。保腎通絡(luò)方治療DN 臨床療效確切，但其防治DN 的分子機制目前尚不清楚。因此本研究觀察了保腎通絡(luò)方對于DN 小鼠腎臟病理損傷、腎小球細胞外基質(zhì)蛋白Ⅳ型膠原蛋白（Collagen Ⅳ）及纖連蛋白（FN）、腎小球炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及白細胞介素-6（IL-6）水平的影響，進而探討其防治DN 的分子機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 本研究應(yīng)用的KK-Ay 小鼠及C57BL/6J 小鼠均購自北京華阜康生物科技股份有限公司，其中KK-Ay 小鼠30 只，C57BL/6J 小鼠10 只，所有小鼠均為8 周齡SPF 級雄性，體質(zhì)量為（25±5）g，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2014-0004。小鼠在12 h 光照/黑暗循環(huán)，溫度（24±1）℃，濕度50%～70%條件下飼養(yǎng)，并可自由進食進水。本研究已通過實驗動物倫理委員會批準，動物造模及實驗過程嚴格遵守動物福利倫理原則。

1.2 試劑和藥物 Collagen Ⅳ抗體（ab6586，abcam，英國）、FN 抗體（ab2413，abcam，英國）、糖原（PAS）染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，C0142M）、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，C0105S）、Masson 染色試劑盒（武漢谷歌生物科技有限公司，G1006）、IL-6 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml023130）、TNF-α、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ml077385）、尿蛋白定量檢測試劑盒（南京建成，C035-2）、肌酐測定試劑盒（ROCHE，瑞士，657881）、尿素氮測定試劑盒（ROCHE，瑞士，658513）、纈沙坦膠囊（北京諾華制藥有限公司，批號：X1440）；保腎通絡(luò)方顆粒劑，由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院藥劑科制備。

1.3 主要儀器 酶標儀（北京市新風(fēng)機電技術(shù)公司，ZS-3）、離心機（美國Sigma，3K18）、全自動生化分析儀（上?？迫A生物工程股份有限公司，ZY1280）、倒置顯微鏡（德國Leica 公司，DMILPH1）、凝膠化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（法國Vilber 公司，F(xiàn)USION FX6 XT）、高電流電泳電源（美國伯樂公司，1645052）。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物模型建立及分組給藥 首先建立DN 小鼠模型，8 周齡雄性KK-Ay 小鼠予高脂飼料喂養(yǎng)，C57BL/6J 小鼠予普通飼料飼養(yǎng)。4 周后檢測各組小鼠血糖及24 h 尿蛋白定量。當KK-Ay 小鼠血糖≥16．7 mmol/L，并且24 h 尿蛋白明顯高于C57BL/6J小鼠時，DN 小鼠模型造模成功。DN 小鼠以血糖、24 h尿蛋白定量并結(jié)合體質(zhì)量進行分層，隨機分為模型組、保腎通絡(luò)方組及纈沙坦組，另外將C57BL/6J 小鼠作為正常對照組，每組10 只。保腎通絡(luò)方予保腎通絡(luò)方顆粒劑灌胃，灌胃劑量為20 g/（kg·d）（生藥劑量），纈沙坦組予10 mg/（kg·d）纈沙坦灌胃，其余兩組予等劑量蒸餾水灌胃，連續(xù)灌胃12 周。

1.4.2 標本采集與處理 于灌胃0、4、8 和12 周收集小鼠24 h 尿液，檢測尿蛋白水平。灌胃結(jié)束后，小鼠予戊巴比妥麻醉，心尖取血，靜置20 min 左右，離心半徑8 cm，2 000 r/min 離心20 min，分離血清，后檢測血肌酐及尿素氮水平。摘取腎臟組織，一部分腎組織放入4%多聚甲醛固定，然后石蠟包埋切片，用于免疫組化及腎臟病理檢測，另外部分放入-80 ℃冰箱，用于逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測及ELISA 檢測。

1.4.3 HE、PAS 染色 將石蠟切片進行脫蠟處理，然后將切片放入伊紅或無色鹽基性品紅溶液對切片進行染色，染色結(jié)束后流水沖洗，后用蘇木精對細胞核進行染色，程序性脫水透明后，封片，光鏡下觀察腎臟病理改變。

1.4.4 Masson 染色 將石蠟切片進行脫蠟處理，Weigert 鐵蘇木素染色液染核5～10 min，1%鹽酸酒精分化5～15 s，充分水洗，麗春紅酸性品紅液染5～10 min，用苯胺藍液復(fù)染5 min，程序性脫水透明后，封片，光鏡下觀察腎臟病理改變。

1.4.5 酶聯(lián)免疫法檢測 將各組小鼠腎組織用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗，放置在冰上勻漿，應(yīng)用離心機4 ℃、12 000×g、離心10 min，取離心后的上清液，應(yīng)用BCA 蛋白定量試劑盒測定上清液總蛋白濃度，根據(jù)ELISA 試劑盒說明書操作步驟對腎組織中的IL-6、TNF-α 水平進行檢測。

1.4.6 免疫組化 首先將石蠟切片脫蠟，然后將一抗稀釋成特定濃度（Collagen Ⅳ1∶1 000；FN 1∶1 000），一抗稀釋液滴加到不同組別切片上，4 ℃孵育過夜，后流水沖洗，加入二抗37 ℃孵育1 h，用蘇木精進行染核，封片。光鏡下觀察蛋白表達水平。

1.4.7 RT-PCR 首先對腎臟總RNA 進行提取，然后將mRNA 反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，對cDNA 進行擴增和熒光定量分析。采用2-ΔΔCT法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析，所有操作均按照產(chǎn)品說明書進行。利用Primer 5．0 軟件設(shè)計引物序列，見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primers sequence

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20．0 進行統(tǒng)計處理，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），多重比較采用LSD 檢驗，P＜0．05 表示有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般狀態(tài)比較 正常對照組小鼠毛發(fā)光澤，對外界刺激反應(yīng)靈敏，精神狀態(tài)良好；而模型組小鼠毛色晦暗，反應(yīng)遲鈍，精神萎靡，并出現(xiàn)多飲和形體消瘦；而保腎通絡(luò)方組和纈沙坦組小鼠一般狀態(tài)均較模型組有不同程度的改善。

2.2 保腎通絡(luò)方對DN 小鼠24 h 尿蛋白水平的影響 正常對照組小鼠24 h 尿蛋白水平在整個實驗期間均維持在低水平。與正常對照組相比，模型組小鼠在不同時間節(jié)點其24 h 尿蛋白水平均有不同程度升高（P＜0．05），并且隨著時間延長，其尿蛋白水平呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。與模型組相比，保腎通絡(luò)方及纈沙坦組小鼠在灌胃4、8 和12 周其24 h 尿蛋白水平均有明顯下降（P＜0．05）。見圖1。

圖1 各組小鼠不同時間點24 h 尿蛋白的比較（n=10）Fig.1 Comparison of 24 h proteinuria from mice in different groups（n=10）

2.3 保腎通絡(luò)方對DN 小鼠血肌酐、尿素氮水平影響 模型組小鼠血肌酐及尿素氮水平較正常對照組明顯升高（P＜0．05）；與模型組相比，保腎通絡(luò)方組及纈沙坦組小鼠血肌酐、尿素氮水平均有明顯下降（P＜0．05）。見圖2。

圖2 各組小鼠血肌酐（A）及血尿素氮（B）水平比較（±s，n=10）Fig.2 Comparison of Scr(A)and BUN(B)from mice in different groups（±s，n=10）

2.4 保腎通絡(luò)方對DN 小鼠腎臟病理的影響 正常對照組小鼠腎小球系膜細胞較少，細胞外基質(zhì)正常；與正常對照組相比，模型組小鼠腎小球系膜細胞明顯增多，細胞外基質(zhì)增生明顯。與模型組相比，保腎通絡(luò)方組及纈沙坦組小鼠腎小球系膜細胞減少，細胞外基質(zhì)增生減輕。見圖3。

圖3 各組小鼠腎小球腎臟病理改變比較（×200）Fig.3 Comparison of renal pathology from mice in different groups(×200)

2.5 保腎通絡(luò)方對DN 小鼠腎小球細胞外基質(zhì)FN蛋白及mRNA 表達的影響 與正常對照組相比，模型組小鼠腎小球細胞外基質(zhì)FN 蛋白及mRNA 表達明顯上調(diào)（P＜0．05）；與模型組相比，保腎通絡(luò)方組及纈沙坦組小鼠腎小球細胞外基質(zhì)FN 蛋白及mRNA表達明顯下調(diào)（P＜0．05）。見圖4。

圖4 各組小鼠足細胞FN 蛋白（A-B）及mRNA（C）表達水平的比較Fig.4 Comparison of FN protein(A-B)and mRNA(C)expression levels in mice podiocytes in each group

2.6 保腎通絡(luò)方對DN 小鼠腎小球細胞外基質(zhì)Collagen Ⅳ蛋白及mRNA 表達的影響 與正常對照組相比，模型組小鼠腎小球細胞外基質(zhì)Collagen Ⅳ蛋白及mRNA 表達明顯上調(diào)（P＜0．05）；與模型組相比，保腎通絡(luò)方組及纈沙坦組小鼠腎小球細胞外基質(zhì)Collagen Ⅳ蛋白及mRNA 表達明顯下調(diào)（P＜0．05）。見圖5。

2.7 保腎通絡(luò)方對DN 小鼠腎組織TNF-α 及IL-6的影響 與正常對照組相比，模型組小鼠腎組織TNF-α 及IL-6 水平明顯升高（P＜0．05）；與模型組相比，保腎通絡(luò)方組及纈沙坦組小鼠腎組織TNF-α及IL-6 水平明顯降低（P＜0．05）。見圖6。

圖6 各組小鼠腎組織IL-6（A）及TNF-α（B）水平比較（±s，n=10）Fig.6 Comparison of IL-6(A)and TNF-α(B)expression from mice in different groups（±s，n=10）

3 討論

DN 發(fā)病率逐年升高，已經(jīng)成為導(dǎo)致終末期腎病（ESRD）主要的原發(fā)腎臟疾病[4]。目前關(guān)于DN 的治療取得了一些進展，包括應(yīng)用鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白2（SGLT-2）抑制劑和胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體激動劑，但這些藥物在中重度腎功能受損患者仍需減量或者停藥[5]。此外盡管采取了以上積極早期的臨床干預(yù)措施，仍有很多患者快速進入ESRD。因此積極探討DN 的發(fā)病機制，進而尋求其潛在治療靶點及新的治療策略顯得尤為重要。

腎小球系膜細胞增多及細胞外基質(zhì)增生是DN特征性的病理改變[6]。其中細胞外基質(zhì)增生是導(dǎo)致DN 腎小球纖維化及疾病進展的重要病理機制[7]。腎小球細胞外基質(zhì)主要包括Collagen Ⅳ和FN，其中FN 是一種大分子糖蛋白，廣泛存在于細胞外基質(zhì)、基膜及體液中，并在細胞外基質(zhì)中相互交叉，形成網(wǎng)絡(luò)，為其他細胞外基質(zhì)成分沉積提供支架[8]。Collagen Ⅳ是一種基膜膠原，存在于上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞基膜中。Collagen Ⅳ同時也是腎小球系膜基質(zhì)及基底膜的主要成分，其在系膜細胞間相互交叉呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[9]。生理情況下，腎小球細胞外基質(zhì)生成和降解處于動態(tài)平衡。在DN 中，腎小球系膜細胞外基質(zhì)生成增多，降解減少，進而引起細胞外基質(zhì)累積。而抑制腎小球細胞外基質(zhì)蛋白FN 及Collagen Ⅳ生成，減輕細胞外基質(zhì)增生可以有效的延緩DN 疾病進展[10]。

炎癥介導(dǎo)腎小球系膜基質(zhì)增生是DN 發(fā)生及進展的重要病理機制。DN 患者腎小球處于一種局部的、非顯性的慢性低度炎癥，并非由病原微生物引起，而是與多種致炎因子相關(guān)的免疫性炎癥[11]。研究發(fā)現(xiàn)，高糖等病理因素會引起巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞在腎小球浸潤，并釋放相關(guān)炎性因子[12]。而炎性因子可作用于腎臟固有細胞，引起系膜細胞增殖及細胞外基質(zhì)增生，進而引起腎小球纖維化，最終導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生及腎功能的進展[13]。其中IL-6 及TNF-α 是介導(dǎo)DN 腎小球炎癥及系膜基質(zhì)增生的重要炎性因子。研究發(fā)現(xiàn)，DN 患者IL-6 水平較無腎臟損傷人群明顯升高，且隨著IL-6 水平的升高，其腎小球系膜細胞基質(zhì)增生呈現(xiàn)逐漸加重趨勢[14]。TNF-α 不僅可以直接介導(dǎo)系膜細胞損傷，同時可以刺激成纖維細胞生長和局部膠原的增加，在腎纖維化中發(fā)揮作用[15]。

中醫(yī)藥在防治DN 方面具有獨特的優(yōu)勢，并顯示出較好的減輕炎癥抑制系膜基質(zhì)增生作用[16-17]。全國名老中醫(yī)張炳厚教授長期從事中醫(yī)藥防治DN 的臨床研究工作，提出“腎氣精兩虛，腎失封藏，腎絡(luò)閉阻”是DN 發(fā)病的核心病機，并主張治療糖尿病腎病應(yīng)采用補腎活血通絡(luò)的治療原則。保腎通絡(luò)方是在補腎活血通絡(luò)的治則指導(dǎo)下組方而成，由黃芪、熟地黃、菟絲子、劉寄奴、鬼箭羽、水蛭、丹參組成，本研究在補腎藥物基礎(chǔ)上加入蟲蟻通絡(luò)藥和辛潤通絡(luò)藥。方中熟地黃滋陰補腎，重用為君藥，黃芪健脾益氣，菟絲子補腎澀精，三者配伍，共奏益氣養(yǎng)陰、補益脾腎之效，加用丹參、劉寄奴、鬼箭羽活血化瘀通絡(luò)，但糖尿病腎病腎絡(luò)閉阻日久，單憑草木之力難以起效，加用水蛭加強通絡(luò)之力。臨床試驗已經(jīng)證實，保腎通絡(luò)方對于DN 患者具有較好的降低尿蛋白、改善腎功能的作用[18]。此外基礎(chǔ)實驗證實，保腎通絡(luò)方能夠減輕DN 小鼠足細胞損傷，延緩疾病進展[19]。但是保腎通絡(luò)方對DN 腎小球炎癥及系膜基質(zhì)增生的作用目前并不清楚。

因此，課題組進行了前期動物實驗研究，設(shè)立了保腎通絡(luò)方低、中、高劑量組，實驗結(jié)果證實，中劑量組[20 g/（kg·d）]小鼠腎功能改善明顯優(yōu)于其他兩個劑量組，因此本實驗中保腎通絡(luò)方的給藥劑量為20 g/（kg·d）。研究結(jié)果顯示保腎通絡(luò)方能夠顯著降低DN 小鼠蛋白尿，降低DN 小鼠血肌酐、血尿素氮水平。此外保腎通絡(luò)方可以降低DN 小鼠腎小球系膜細胞數(shù)目，減輕腎小球細胞外基質(zhì)增生，改善腎臟病理。基于FN 及Collagen Ⅳ在DN 腎小球細胞外基質(zhì)增生中的重要作用，本課題觀察了不同組別小鼠腎小球FN 及Collagen Ⅳ的表達情況。結(jié)果顯示，保腎通絡(luò)方能夠明顯下調(diào)DN 小鼠腎小球FN及Collagen Ⅳ蛋白及mRNA 表達。與此同時，保腎通絡(luò)方可以降低DN 小鼠腎組織炎性因子IL-6 及TNF-α 水平。本實驗研究結(jié)果表明，保腎通絡(luò)方能夠降低DN 蛋白尿，保護腎功能。同時保腎通絡(luò)方能夠下調(diào)FN 和Collagen Ⅳ表達，降低炎性因子IL-6和TNF-α 水平，減輕腎小球炎癥及系膜基質(zhì)增生。至于其減輕DN 腎小球炎癥和系膜基質(zhì)增生的詳細的分子機制有待進一步研究。