劉芷含

（浮梁縣疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，江西 浮梁 333400）

霍亂（cholera）為我國(guó)法定甲類傳染病之一，由霍亂弧菌（Vibrio cholerae）感染所致，多伴有劇烈嘔吐、腹瀉等明顯癥狀，可引發(fā)脫水、休克等不良后果，具有發(fā)病急、傳播快、致死率高等特點(diǎn)，對(duì)國(guó)內(nèi)外公共衛(wèi)生安全均構(gòu)成了較大威脅[1，2]?，F(xiàn)如今，病原學(xué)診斷一直為我國(guó)疫情確診報(bào)告金標(biāo)準(zhǔn)，其實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果可直接影響防疫管控工作的制定與開展，其中玻片凝集法（slide agglutination test）與膠體金法（colloidal gold method）均為霍亂弧菌常用檢測(cè)方式，其培養(yǎng)基的選擇在病株分離鑒定中具有重要意義[3，4]。目前，4 號(hào)瓊脂、TCBS 瓊脂與慶大霉素瓊脂均為致病性弧菌的選擇性培養(yǎng)基，其平板制作及配方組成均存在一定差異，臨床選擇存在較大爭(zhēng)議[5，6]。在此，本研究結(jié)合2022 年1 月-2023 年3 月浮梁縣疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科分離保存的霍亂弧菌株，觀察4 號(hào)瓊脂、TCBS 瓊脂及慶大霉素瓊脂在霍亂監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用效果，以期為霍亂弧菌培養(yǎng)基的選擇提供有效參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 選取2022 年1 月-2023 年3 月浮梁縣疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科分離保存的霍亂弧菌株，該菌株種類為O139 群霍亂弧菌，保存環(huán)境為-80 ℃，培養(yǎng)前經(jīng)霍亂防治手冊(cè)鑒定。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基制作 4 號(hào)瓊脂培養(yǎng)基：取4 號(hào)瓊脂（生產(chǎn)編號(hào)：025030，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，規(guī)格：250 g）53.5 g，置于1000 ml 蒸餾水中加熱煮沸，充分溶解后，冷卻至50 ℃左右，滅菌后倒平板，凝固后備用。TCBS 瓊脂培養(yǎng)基：取TCBS 瓊脂（生產(chǎn)編號(hào)：022041，上海研尊生物科技有限公司，規(guī)格：250 g）88 g，置于1000 ml 蒸餾水中加熱煮沸，充分溶解后，冷卻至50 ℃左右，滅菌后倒平板，凝固后備用。慶大霉素瓊脂培養(yǎng)基：取慶大霉素瓊脂（生產(chǎn)批號(hào)：2108271，北京陸橋技術(shù)股份有限公司，規(guī)格：250 g）56 g，置于1000 ml 蒸餾水中加熱煮沸，充分溶解后，冷卻至50 ℃左右，滅菌后倒平板，凝固后備用。

1.2.2 病菌培養(yǎng) 將初始霍亂弧菌接種堿性蛋白胨水（生產(chǎn)批號(hào)：20210610，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，規(guī)格：250 g）進(jìn)行增菌培養(yǎng)，37 ℃增菌6～8 h 后，于其菌膜下表層取接種環(huán)培養(yǎng)物，分別接種于4 號(hào)瓊脂、TCBS 瓊脂與慶大霉素瓊脂3 種培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基各設(shè)置10 個(gè)平板，采用生化培養(yǎng)箱（上海恒一科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)LRH-150F），37 ℃培養(yǎng)18～24 h。

1.2.3 病菌檢測(cè) 取培養(yǎng)物進(jìn)行玻片凝集法與膠體金法檢測(cè)。玻片凝集法：取培養(yǎng)基菌落與霍亂弧菌單克隆抗體（生產(chǎn)批號(hào)：20220301，鄭州萬(wàn)泰生物科技有限公司，規(guī)格：4×1 支/盒）進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，若菌落10 s 內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集顆粒，且在生理鹽水中不凝集，則評(píng)定為陽(yáng)性。膠體金法：采用霍亂弧菌檢測(cè)試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：20220401，鄭州萬(wàn)泰生物科技有限公司，規(guī)格：50 人份）進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)線與質(zhì)控線均顯示紅色條杠，則評(píng)定為陽(yáng)性。

1.3 觀察指標(biāo) ①比較三種培養(yǎng)基成分；②比較霍亂弧菌在不同培養(yǎng)基中的菌落特征；③比較霍亂弧菌在不同培養(yǎng)基中的檢測(cè)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三種培養(yǎng)基配方成分比較 4 號(hào)瓊脂、TCBS 瓊脂與慶大霉素瓊脂培養(yǎng)基配方成分存在一定差異，其中TCBS 瓊脂培養(yǎng)基成分種類最多，但三者瓊脂含量相同，其pH 值無差異（F=5.021，P=0.857），見表1。

表1 三種培養(yǎng)基配方成分比較（n，±s）

表1 三種培養(yǎng)基配方成分比較（n，±s）

2.2 霍亂弧菌在不同培養(yǎng)基中的菌落特征比較 霍亂弧菌在4 號(hào)瓊脂、TCBS 瓊脂與慶大霉素瓊脂中的菌落生長(zhǎng)特征存在一定差異，見表2。

表2 霍亂弧菌在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特征

2.3 霍亂弧菌在不同培養(yǎng)基中的檢測(cè)情況比較 霍亂弧菌檢出率由高至低依次為4 號(hào)瓊脂＞慶大霉素瓊脂＞TCBS 瓊脂（χ2=4.445，P=0.035），見表3。

表3 霍亂弧菌在不同培養(yǎng)基中的檢測(cè)率比較[n（%）]

3 討論

霍亂弧菌屬于典型革蘭氏陰性菌，呈弧形或逗點(diǎn)狀，其血清群豐富，細(xì)菌運(yùn)動(dòng)活躍，存活時(shí)間較長(zhǎng)，多發(fā)于免疫力低下人群，具有較高易感風(fēng)險(xiǎn)[7，8]。其中，O1 群與O139 群霍亂弧菌是引發(fā)霍亂的主要病原菌，二者可通過毒素共調(diào)菌毛（toxincoregulatedpilus，TCP）與霍亂毒素（choleratoxin，CT）的釋放，引發(fā)急性腸胃道癥狀，對(duì)患者生命安全構(gòu)成了極大威脅，其臨床診斷尤為重要[9，10]。目前，玻片凝集法與膠體金法均為霍亂弧菌常用鑒定方式，其檢測(cè)需從強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基中挑取可疑菌落，以完成病菌的快速測(cè)定，實(shí)現(xiàn)疫情的及時(shí)防控[11，12]。故，其培養(yǎng)基的選擇將直接影響病菌鑒定的時(shí)效性與準(zhǔn)確性，在疫情防控管理中具有重要意義。4 號(hào)瓊脂、TCBS 瓊脂與慶大霉素瓊脂均為分離霍亂弧菌的強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基，其菌落特征是識(shí)別病菌的重要依據(jù)，但其培養(yǎng)生長(zhǎng)速度不同，菌落特征存在一定差異，對(duì)其病菌檢出效果造成了一定影響[13，14]。

本研究結(jié)果顯示，4 號(hào)瓊脂、TCBS 瓊脂與慶大霉素瓊脂培養(yǎng)基配方成分存在一定差異，其中TCBS 瓊脂培養(yǎng)基成分種類最多，但三者瓊脂含量相同，其pH 值無差異（P＞0.05），表明4 號(hào)瓊脂、TCBS 瓊脂與慶大霉素瓊脂培養(yǎng)基的部分配方存在差異，但其瓊脂量與pH 值較為一致，均為固體堿性培養(yǎng)基。這是由于霍亂弧菌屬于兼性厭氧菌，其在固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，且堿性環(huán)境下增殖更快，以上培養(yǎng)基均可為霍亂弧菌的生長(zhǎng)提供良好條件[15，16]。其中，4 號(hào)瓊脂與慶大霉素瓊脂培養(yǎng)基的配方成分較為相近，二者均以蛋白胨、牛肉膏粉作為碳氮源、維生素及生長(zhǎng)因子的主要來源，通過氯化鈉維持滲透壓平衡，其配方中的亞硫酸鈉可刺激弧菌生長(zhǎng)，并以瓊脂作為培養(yǎng)基的凝固劑[17，18]。但在抑菌配方中，4 號(hào)瓊脂培養(yǎng)基包括慶大霉素、十二烷基硫酸鈉、豬膽汁粉與雷佛奴爾等成分，慶大霉素瓊脂培養(yǎng)基則以慶大霉素、檸檬酸鈉為主，其抑菌成分相對(duì)單一[19]。TCBS 瓊脂培養(yǎng)基配方中，其蛋白胨、酵母膏粉、蔗糖可作為碳氮源、維生素與生長(zhǎng)因子的主要來源，通過氯化鈉維持滲透壓平衡，刺激弧菌生長(zhǎng)，并利用檸檬酸鈉、膽酸鈉、牛膽粉及硫代硫酸鈉等成分抑制革蘭氏陽(yáng)性菌及大腸菌群的生長(zhǎng)，其中硫代硫酸鈉與檸檬酸鐵可作為硫化氫產(chǎn)生的重要指示劑，麝香草酚蘭則屬于培養(yǎng)基pH 指示劑[20]。在其培養(yǎng)生長(zhǎng)過程中，霍亂弧菌在4 號(hào)瓊脂、TCBS 瓊脂與慶大霉素瓊脂中的菌落生長(zhǎng)特征存在一定差異，提示不同培養(yǎng)基的菌落生長(zhǎng)速度存在一定差異。其中，4 號(hào)瓊脂與慶大霉素瓊脂培養(yǎng)基的菌落特征較為相近，這與其相似的培養(yǎng)基配方存在直接關(guān)聯(lián)，而TCBS 瓊脂培養(yǎng)基的菌落生長(zhǎng)速度明顯較慢，且在18 h 后出現(xiàn)兩大綠色菌落，易導(dǎo)致誤檢及漏檢的發(fā)生。本次檢測(cè)結(jié)果中，霍亂弧菌檢出率由高至低依次為4 號(hào)瓊脂＞慶大霉素瓊脂＞TCBS 瓊脂（P＜0.05），可見4 號(hào)瓊脂培養(yǎng)基的檢測(cè)效果最佳，而TCBS 瓊脂培養(yǎng)基的檢測(cè)作用相對(duì)最弱。分析認(rèn)為，4 號(hào)瓊脂與慶大霉素培養(yǎng)基均含有亞硫酸鈉與慶大霉素，前者可刺激弧菌生長(zhǎng)，后者則可有效抑制革蘭氏陽(yáng)性菌與部分革蘭氏陰性雜菌，其中4 號(hào)瓊脂還包含十二烷基硫酸鈉、豬膽汁粉與雷佛奴爾等成分，可進(jìn)一步減少培養(yǎng)基雜菌對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，保證霍亂弧菌的檢測(cè)準(zhǔn)確性[21]。而TCBS 瓊脂培養(yǎng)基的抗菌成分相對(duì)較少，僅通過枸櫞酸鈉、牛膽粉、牛膽酸鈉抑制腸道菌及革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，對(duì)霍亂弧菌的生長(zhǎng)速度造成了一定影響，同時(shí)TCBS 瓊脂的蔗糖成分相對(duì)較多，其蔗糖發(fā)酵菌的產(chǎn)生，可進(jìn)一步干擾弧菌的鑒定，不利于病菌的準(zhǔn)確檢出[22]。

綜上所述，4 號(hào)瓊脂、TCBS 瓊脂與慶大霉素瓊脂培養(yǎng)基均可有效分離霍亂弧菌，實(shí)現(xiàn)病菌檢測(cè)，其營(yíng)養(yǎng)基成分不同、菌落生長(zhǎng)表現(xiàn)各異，以4 號(hào)瓊脂培養(yǎng)基的檢出效果最佳。