文 丹，胥正敏，林師宇，黃 蓉

（1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 南充 637000）

未分化甲狀腺癌（anaplastic thyroid cancer，ATC）是起源于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的高度侵襲性腫瘤，由于其具有失分化、惡性程度高、易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，該類患者往往預(yù)后較差、生存期不超過(guò)半年[1]。關(guān)于ATC 發(fā)病的分子機(jī)制目前仍不清楚。AXIN1 基因在多種腫瘤中表達(dá)降低并在腫瘤的發(fā)病過(guò)程中扮演著抑癌基因的角色，該基因表達(dá)異常可以導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌[2]、肝細(xì)胞癌[3]、結(jié)直腸癌[4]和胃腸道癌[5]等多種腫瘤發(fā)生。且研究發(fā)現(xiàn)[6]，采用重組AXIN1 過(guò)表達(dá)載體（pcDNA3.1-AXIN1）轉(zhuǎn)染人胚胎腫瘤衍生細(xì)胞系NTera2 后，與對(duì)照組相比，AXIN1表達(dá)量增加，Bcl-2 表達(dá)降低。另有研究發(fā)現(xiàn)[7]，運(yùn)用牙齦卟啉單胞菌-脂多糖（LPS-Pg）處理大鼠成骨細(xì)胞后可抑制Bcl-2 表達(dá)，而在此基礎(chǔ)上敲低AXIN1基因后，可逆轉(zhuǎn)Pg-LPS 誘導(dǎo)的促凋亡作用。這些研究都暗示AXIN1 和Bcl-2 基因在疾病發(fā)生過(guò)程中可能存在著某種關(guān)聯(lián)，但關(guān)于二者在ATC 腫瘤中的相關(guān)性尚需研究證實(shí)。本課題組前期研究采用CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)成功構(gòu)建出AXIN1 基因敲除的ACT-1 單克隆細(xì)胞系[8]。基于此，本研究構(gòu)建了AXIN1 基因過(guò)表達(dá)的ACT-1 腫瘤細(xì)胞系，以期在構(gòu)建成功的兩種工具細(xì)胞中探討敲除及過(guò)表達(dá)AXIN1 基因?qū)CT-1 中Bcl-2 的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 Nthy-ori-3-1 及ACT-1 細(xì)胞系均購(gòu)自ATCC 細(xì)胞庫(kù)，嘌呤霉素購(gòu)自Boster 公司，兔抗Bcl-2 單克隆抗體購(gòu)自CST 公司，DMEM 高糖培養(yǎng)基購(gòu)自invitrogen 公司；胎牛血清購(gòu)自NTC 公司；胰蛋白酶、二甲基亞砜、無(wú)菌PBS 及青霉素、鏈霉素均購(gòu)自Boster 公司；總RNA 提取試劑TRIzol、焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）處理水均購(gòu)自ABI 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo 公司；PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 購(gòu)自Applied Biosystem 公司；兔抗β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購(gòu)自Boster 公司；兔抗AXIN1 及Bcl-2 單克隆抗體均購(gòu)自CST 公司；二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒購(gòu)自博士德公司；臺(tái)式高速低溫離心機(jī)購(gòu)自上海力申；IX50 熒光顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus 公司;流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD Bioscience 公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建AXIN1 基因過(guò)表達(dá)病毒載體 將AXIN1的cDNA 序列克隆到MLPIC 病毒載體中，采用核酸內(nèi)切酶酶切鑒定出AXIN1 基因過(guò)表達(dá)的病毒載體MLPIC-AXIN1，從插入序列兩端及cDNA 序列中段測(cè)全序列的cDNA。

1.2.2 構(gòu)建AXIN1 基因過(guò)表達(dá)的ACT-1 腫瘤細(xì)胞系首先，采用HEK293T 細(xì)胞包裝病毒，24 h 后熒光顯微鏡觀察293T 轉(zhuǎn)染效率，收集48～72 h 病毒過(guò)濾后感染ACT-1 細(xì)胞，其陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組分別設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)復(fù)孔。流式檢測(cè)24 h 病毒感染效率在10%左右，因轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞含有嘌呤霉素抗性，隨即采用嘌呤霉素進(jìn)行細(xì)胞篩選，當(dāng)加藥后細(xì)胞無(wú)明顯死亡，可再次行流式檢測(cè)紅色熒光細(xì)胞比率，若比率達(dá)90%左右，則獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)AXIN1 的攜帶紅色熒光并含嘌呤霉素抗性基因穩(wěn)定腫瘤細(xì)胞株。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)細(xì)胞中AXIN1 和Bcl-2 mRNA 表達(dá)情況 收取細(xì)胞，加入TRIzol 裂解液，反復(fù)吹打細(xì)胞至其完全裂解，按比例加入氯仿靜置分層，低溫離心機(jī)高速離心；吸取上清加入等體積異丙醇，室溫靜置，低溫離心機(jī)高速離心；棄上清，加入750 ml/L 酒精，低溫離心機(jī)離心；甩干酒精，加入RNA 無(wú)酶水使其充分溶解；按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行反轉(zhuǎn)錄過(guò)程；取cDNA 產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增；觀察每孔對(duì)應(yīng)樣品融解曲線及擴(kuò)增曲線圖，采用2△△CT法處理及分析數(shù)據(jù)并記錄。PCR 引物為：β-actin正向序列為5’-TTCTTTGAGCTCCTTCGTT-3’，反向序列為5’-ATGGAGGGGAATACAGCCC-3’；AXIN1 正向序列為5’-CCTCCTGGCATCTGTAAG-3’，反向序列為5’-CCGCTCCTTCTGTCTATG-3’；Bcl-2 正向序列為5’-GTGGATGACTGAGTACCTGAAC-3’，反向序列為5’-GAGACAGCCAGGAGAAATCAA-3’。PCR 反應(yīng)體系（20 μl）：稀釋后的cDNA 8 μl，正反向引物各1 μl，SYBR?Green 10 μl。PCR 擴(kuò)增程序如下：50 ℃2 min，95 ℃2 min；95 ℃解鏈15 s，55 ℃～60 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)40 次。

1.2.4 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞中AXIN1 和Bcl-2 蛋白表達(dá)情況 收取細(xì)胞于冰上，離心后棄上清，向細(xì)胞內(nèi)加入蛋白裂解液，槍尖充分吹打，冰上靜置裂解細(xì)胞，按比例加入上樣緩沖液，高溫變性后高速離心收取上清；BCA 蛋白定量試劑盒檢測(cè)所提取細(xì)胞蛋白樣品濃度。按每孔30 μg 總量上樣至SDS-PAGE 膠使其分離，將分離好的蛋白樣品轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，50 g/L 脫脂牛奶室溫封閉，分別加入β-actin 抗體（1∶5000）、兔抗AXIN1 單克隆抗體（1∶1000）及兔抗Bcl-2 單克隆抗體（1∶1000），4 ℃孵育過(guò)夜；PBS 清洗5 次，加入HRP 標(biāo)記的兔抗二抗（1∶5000），室溫孵育1.5 h；PBST 清洗后，采用化學(xué)發(fā)光法加入Western blot 曝光液顯影；導(dǎo)出數(shù)據(jù)，采用Image J 軟件進(jìn)行圖像吸光度（A）值分析，用AAXIN1/Aβ-actin或ABcl-2/Aβ-actin的比值分析AXIN1 及Bcl-2 的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Nthy-ori-3-1 及ACT-1 中AXIN1、Bcl-2 mRNA表達(dá)水平比較 與正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori-3-1相比，腫瘤細(xì)胞ACT-1 中AXIN1 及Bcl-2 mRNA表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 ACT-1 中AXIN1 及Bcl-2 基因mRNA 表達(dá)量

2.2 過(guò)表達(dá)AXIN1 的cDNA 病毒載體的構(gòu)建與驗(yàn)證與陰性對(duì)照組MLPIC 相比，實(shí)驗(yàn)組質(zhì)粒MLPICAXIN1 在進(jìn)行酶切鑒定后可見除載體外的小條帶，大小約4000 bp，見圖2、圖3。

圖2 MLPIC 質(zhì)粒工作結(jié)構(gòu)圖

圖3 質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

2.3 AXIN1 基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建 在過(guò)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功的基礎(chǔ)上，采用HEK293T 細(xì)胞分別包裝MLPIC 及MLPIC-AXIN1 病毒，轉(zhuǎn)染后24 h 熒光顯微鏡下可見細(xì)胞內(nèi)有明顯mCherry 紅色熒光表達(dá)，見圖4。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，ACT-1 細(xì)胞感染后24 h mCherry 陽(yáng)性比率分別為（5.87±0.21）%、（4.97±0.13）%及（5.23±0.15）%，（8.61±0.32）%、（7.30±0.21）%及（7.49±0.42）%，見圖5。感染后的ACT-1 經(jīng)嘌呤霉素篩選后可獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)AXIN1 的腫瘤細(xì)胞系，流式分析mCherry 陽(yáng)性比率可達(dá)（92.31±0.42）%、（96.32±0.71）%、（92.21±0.61）%及（95.03±0.82）%、（94.12±0.31）%及（89.61±0.52）%，見圖6。與陰性對(duì)照組ACT-1-MLPIC 相比，實(shí)驗(yàn)組ACT-1-MLPIC-AXIN1 中AXIN1 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖7。

圖4 HEK293T 細(xì)胞包病毒后24h 細(xì)胞形態(tài)及mCherry 表達(dá)

圖5 ACT-1 感染后24h 流式分析mCherry 陽(yáng)性細(xì)胞比率

圖6 新霉素篩選后流式分析ACT-1 mCherry 陽(yáng)性細(xì)胞比率

圖7 ACT-1 過(guò)表達(dá)細(xì)胞中AXIN1 表達(dá)量檢測(cè)

2.4 敲除及過(guò)表達(dá)AXIN1 的ACT-1 細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)水平比較 與陰性對(duì)照組ACT-1-scramble 相比，實(shí)驗(yàn)組ACT-1-sgAXIN1.Cr5-17 中Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與陰性對(duì)照組ACT-1-MLPIC 相比，實(shí)驗(yàn)組ACT-1-MLPIC-AXIN1 中Bcl-2 mRNA 及蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖8。

圖8 ACT-1 敲除及過(guò)表達(dá)細(xì)胞中Bcl-2 表達(dá)量檢測(cè)

3 討論

Wnt 信號(hào)通路對(duì)于細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和組織穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)十分重要。其中，該通路組成成分或關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子突變誘導(dǎo)的通路激活是腫瘤發(fā)生的重要原因，持續(xù)的Wnt 通路異常激活往往與腫瘤細(xì)胞的異常增殖及耐藥性相關(guān)[9，10]。AXIN1 基因作為Wnt通路重要的負(fù)調(diào)節(jié)因子，可在多種因子的介導(dǎo)下調(diào)控Wnt 通路而參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡過(guò)程[11]。Huang T 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，泛素特異性蛋白酶44（USP44）可通過(guò)Axin1 去泛素化作用使Wnt/β-catenin 途徑失活，從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡發(fā)生。Zhang Y 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，E3 泛素連接酶（UBE3C）過(guò)表達(dá)可通過(guò)促進(jìn)AXIN1 泛素化來(lái)上調(diào)β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡。Biechele TL 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路和AXIN1 可以在人黑色素瘤中調(diào)節(jié)由突變激酶BRAFV600E 的抑制引發(fā)的細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡是參與個(gè)體胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)和免疫的重要生物學(xué)過(guò)程，主要包括2 種途徑，即內(nèi)在凋亡途徑和外在凋亡途徑[15]。靶向凋亡途徑的成分，尤其是內(nèi)在途徑中的Bcl-2 家族，已被證明是改善血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者預(yù)后的有效治療方法[16]。Bcl-2基因作為抗凋亡基因家族重要的成員之一，可以通過(guò)抑制促凋亡蛋白（如BAX 和BAK）的激活來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)癌細(xì)胞存活[17]。通常情況下，抗凋亡因子Bcl-2 蛋白家族可能通過(guò)破壞凋亡與抗凋亡之間的平衡，在濾泡上皮細(xì)胞起源的甲狀腺腫瘤病理類型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用[18]。Gupta A 等[19]、Fourati A 等[20]對(duì)不同病理類型的甲狀腺癌進(jìn)行免疫組化發(fā)現(xiàn)，與分化良好的甲狀腺腫瘤相比，ATC 腫瘤中Bcl-2 表達(dá)明顯降低。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACT-1細(xì)胞系中Bcl-2 表達(dá)同樣降低，與上述研究[19，20]基本一致。在AXIN1 敲除的單克隆細(xì)胞系中，Bcl-2 表達(dá)增加；在ACT-1 過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系中，Bcl-2 表達(dá)降低，提示ATC 腫瘤發(fā)生過(guò)程中Bcl-2 與AXIN1 之間的關(guān)聯(lián)性，AXIN1 的低表達(dá)可能參與了ATC 腫瘤失分化過(guò)程，并且當(dāng)抑癌基因AXIN1 發(fā)生突變時(shí)，可能通過(guò)上調(diào)Bcl-2 的表達(dá)來(lái)調(diào)控細(xì)胞的凋亡過(guò)程，因此Bcl-2 有望成為ATC 治療的另一個(gè)靶標(biāo)。

綜上所述，在未分化甲狀腺癌細(xì)胞中，AXIN1基因在ATC 細(xì)胞中起著重要的抑癌作用，Wnt 通路中AXIN1 基因的突變可能通過(guò)上調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2 的表達(dá)參與ATC 腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，后期可以在前期研究的基礎(chǔ)上，利用小分子抑制劑對(duì)ATC中Bcl-2 分子作用機(jī)制進(jìn)行更深入研究。