池王胄

（上海天慈國際藥業(yè)有限公司 上海 201315）

吲哚胺2, 3-雙加氧酶（indoleamine 2, 3-dioxygenase,IDO）是近年來發(fā)現(xiàn)的惡性腫瘤治療新靶點。IDO 參與調(diào)節(jié)T 細胞的反應，它通過降解色氨酸，阻斷T 細胞的活化。T 細胞對色氨酸耗竭特別敏感，在色氨酸濃度較低時，T 細胞增殖就會靜止在G1 期[1]?；谶@種機制，在胎盤中表達的IDO 保護了胎兒免遭母體排斥[2]；而在腫瘤表達的IDO 介導了腫瘤的免疫逃逸[3]?？乖蔬f細胞如巨噬細胞、樹突狀細胞的IDO 均可通過抑制T 細胞增殖來誘導T 細胞對腫瘤抗原的免疫耐受[4]。

2018 年4 月6 日，Incyte/ 默沙東公布了一項名為ECHO-301 的Ⅲ期臨床試驗數(shù)據(jù)[5]，IDO1 抑制劑epacadostat 聯(lián)合抗PD-1 單克隆抗體帕博利珠單抗（pembrolizumab）治療不可手術(shù)切除或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，相比單獨使用帕博利珠單抗未能明顯改善無進展生存期而提前終止。之后Incyte 公司大大縮減了IDO 抑制劑的開發(fā)規(guī)模，關(guān)鍵性試驗由Ⅲ期轉(zhuǎn)為隨機Ⅱ期，多個Ⅲ期臨床試驗相繼暫?；蛑兄?，IDO 抑制劑的研發(fā)步入低谷。

在此之前，基于幾項臨床前和早期的臨床研究的積極結(jié)果，科學家對IDO抑制劑聯(lián)用程序性細胞死亡受體-1（programmed cell death-1, PD-1）或程序性細胞死亡受體配體-1（programmed cell death-ligand 1, PD-L1）抑制劑曾抱有極大的信心。但是，當前針對IDO 抑制劑的研究并未完全停止，目前仍有多家機構(gòu)在繼續(xù)探索其作為聯(lián)合免疫療法的一個組成部分的潛力。通過前期對大量的具有不同結(jié)構(gòu)骨架的化合物進行活性檢測，本研究開發(fā)了一種新型的IDO1 抑制劑氟哌色胺酮（圖1）。針對色胺酮的缺陷，在結(jié)構(gòu)中引入氟，不僅改變了分子內(nèi)部的電子密度分布，而且還能提高化合物的穩(wěn)定性、脂溶性和滲透性。哌嗪基團可與IDO1 活性口袋形成多個氫鍵和離子鍵，提高藥物的生物活性。鹽酸鹽則可以改善產(chǎn)物的溶解性和穩(wěn)定性，且方便制劑。

圖1 氟哌色胺酮（TC-FPT）鹽酸鹽

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞和動物

1）細胞 HEK-293 細胞及腸癌細胞株CT26.WT 購于上海ATCC 細胞庫。

2）實驗動物 Balb/c 小鼠330 只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0011。

1.1.2 藥物

IDO1 抑制劑氟哌色胺酮（TC-FPT 游離態(tài)、鹽酸鹽、L-乳酸鹽和馬來酸鹽，蘇州匯和藥業(yè)有限公司），IDO1 抑制劑NLG-919（上海芮暉化工科技有限公司），epacadostat（上海芮暉化工科技有限公司），D-1-MT（上海芮暉化工科技有限公司）。

1.1.3 試劑與儀器

DMEM 培養(yǎng)基、10%胎牛血清（GIBCO，美國）、RPMI1640 培養(yǎng)基（GIBCO，美國）、培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 給藥方法

將對數(shù)生長期的HEK-293 細胞收集起來，離心處理后用DMEM 完全培養(yǎng)基（DMEM 不完全培養(yǎng)基∶胎牛血清＝10 ∶1）重懸并將其接種于6 孔板中且每孔細胞數(shù)約為2×105個，等細胞完全貼壁后，移除培養(yǎng)基并用磷酸緩沖鹽溶液洗滌3 次后加入新的含藥培養(yǎng)基。

1.2.4.1 橡膠草懸浮細胞鮮重變化 懸浮細胞鮮重的測定方法：每隔2 d將裝有懸浮培養(yǎng)物的廣口瓶和3組空白的液體培養(yǎng)基分別稱重，記錄數(shù)據(jù)。W1：第1天懸浮培養(yǎng)物的重量；W2：第3天懸浮培養(yǎng)物的重量；W3：第1天空白的液體培養(yǎng)基的重量；W4：第3天空白的液體培養(yǎng)基的重量。細胞鮮重=（W2－W1）+（W3－W4）。記錄數(shù)據(jù)，并繪制懸浮細胞鮮重變化曲線圖。

1.2.2 IDO1 抑制實驗

重組人IDO1 蛋白經(jīng)大腸桿菌表達、鎳親合色譜純化而得。測定候選化合物TC-FPT 鹽酸鹽及游離態(tài)，陽性對照物D-1-MT、NLG9219 和epacadostat 對IDO1 的抑制活性。待測化合物的作用終濃度從100 000 nM 開始，4 倍梯度稀釋，10 個濃度點，每個濃度為復孔測試，對照DMSO 的終濃度為1%。將20 nM hIDO 和各化合物設(shè)定濃度100 μL 加入已有預熱至37 ℃的緩沖溶液中；在37 ℃保溫30 min；加入50 μL 30%（w/v）三氯乙酸停止酶反應。反應液經(jīng)12 000 r/min 離心處理，然后吸取100 μL 上層清液，再加入100 μL 埃利希試劑顯色，于波長480 nm 處讀取光密度（optical density, OD）。

1.2.3 HEK-293 細胞的抑制實驗

測定候選化合物TC-FPT 鹽酸鹽及游離態(tài)，陽性對照物D-1-MT、NLG9219 和epacadostat 對IDO1 在細胞水平（HEK-293 細胞）的抑制活性。待測化合物的作用終濃度從100 000 nM 開始，4 倍梯度稀釋，9 個濃度點，每個濃度為3 復孔測試。將20 nM hIDO 和各化合物設(shè)定濃度100 μL 加入已有預熱至37 ℃的緩沖溶液中；在37 ℃保溫30 min；加入50 μL 30%（w/v）三氯乙酸停止酶反應。反應液經(jīng)12 000 r/min 離心處理，然后吸取100 μL 上層清液，再加入100 μL 埃利希試劑顯色，于波長480 nm 處讀取OD。

1.3 觀察指標

1.3.1 小鼠腸癌CT26.WT 同種移植瘤模型的建立及抗腫瘤活性評價

CT26.WT 細胞2×105個重懸于0.1 mL 無血清培養(yǎng)基中，在無菌條件下，接種至小鼠右側(cè)背部皮下。待腫瘤長出后，用電子游標卡尺測量腫瘤長徑（a）和短徑（b），并按照如下公式進行腫瘤體積計算：腫瘤體積（V）＝1/2ab2。

腫瘤接種后第5 天，待平均腫瘤體積到達約50 mm3時，對小鼠進行隨機分組，分為溶媒對照組（5%阿拉伯膠）、epacadostat 組、NLG919 組、L- 乳酸TC-FPT 150 mg/kg 劑量組、L-乳酸TC-FPT 100 mg/kg 劑量組、L-乳酸TC-FPT 50 mg/kg 劑量組并給藥。分組當天記為Day 0，按照小鼠體質(zhì)量開始給藥。給藥期間，每周2 次測量腫瘤體積、小鼠體質(zhì)質(zhì)量，每天觀察小鼠臨床癥狀。

1.3.2 藥代動力學評價

靜脈給藥劑量為20 mg/kg，口服給藥劑量為100 mg/kg。在口服給藥前，所有小鼠禁食過夜（10 ～14 h），給藥后4 h給食。靜脈給藥組在給藥前和給藥后0.083、0.25、0.5、1、2、6、24 和48 h 從頸靜脈采集血樣；口服給藥組在給藥前和給藥后0.25、0.5、1、2、4、8、24 和48 h 從頸靜脈采集血樣。血液樣本采集后于30 min 之內(nèi)離心分離血漿（離心條件：8 000 r/min，6 min，2 ～8 ℃）。血漿樣本在分析前存放時則放于-70 ℃冰箱內(nèi)。

向50 μL 血漿樣品加入450 μL 乙腈，渦旋振蕩1 min，離心5 min（13 000 r/min），取上清400 μL 加入乙腈-水（1 ∶1）400 μL 混勻后，吸取10 μL 進行LCMS/MS 分析并計算相關(guān)參數(shù)。

1）色譜條件：分析柱，ACQUITY BEH C18柱，1.7 μm，50 mm×2.1 mm I.D.，美國Waters 公司生產(chǎn)；預柱：BEH C18柱，1.7 μm，VanGuard 保護柱，美國Waters 公司生產(chǎn)；流動相（組織）：乙腈-水-甲酸（85 ∶15 ∶0.05，v/v/v）；流動相（血漿）：乙腈-水（80 ∶20，v/v）；流速（血漿）：0.75 mL/min；進樣量：10 μL；樣品室溫度：4 ℃。

2）質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源（ESI 源）；正離子方式檢測；鞘氣溫度400 ℃；氣簾氣10 psi；碰撞氣8 psi；離子化電壓5 500 V；掃描方式為多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring, MRM）。

用空白血漿配制成相當于TC-FPT 血漿濃度依次為5、10、50、100、500、1 000、5 000 ng/mL 的樣品，按“血漿樣品預處理”操作，進行分析，記錄色譜圖。采用WinNonlin Professional v5.2 數(shù)據(jù)分析工具計算以下藥代動力學參數(shù)，血藥濃度-時間曲線下面積（area under curve, AUC）：AUC0-t，AUC0-∞，半衰期（t1/2），峰濃度（Cmax），藥物達峰時間（Tmax），分布容積（Vz），清除率（clearance,CL），和平均滯留時間（mean residence time, MRT）等。此外，生物利用度（F）將通過以下公式進行計算。

1.4 統(tǒng)計學分析

相對腫瘤體積（relative tumor volume, RTV）計算公式為：RTV ＝Vt/V0。其中V0為分組時的腫瘤體積，Vt為每次測量時的腫瘤體積。

抗腫瘤活性的評價指標為相對腫瘤增值率T/C（%）和抑瘤率（%），計算公式分別為：T/C ＝TRTV/CRTV×100%。TRTV為治療組RTV，CRTV為溶媒對照組RTV。抑瘤率＝（TWC-TWT）/TWC×100%，TWC為實驗結(jié)束時溶媒對照組平均腫瘤質(zhì)量，TWT為治療組平均腫瘤質(zhì)量。

荷瘤小鼠的體質(zhì)量變化（body weight change, BWC）計算如下：BWC ＝（BWt-BW0）/BW0×100%，BWt為測量時小鼠體質(zhì)量，BW0為分組時小鼠體質(zhì)量。

根據(jù)國家藥品監(jiān)督管理局《細胞毒類抗腫瘤藥物非臨床研究技術(shù)指導原則》（2006 年11 月），T/C ≤40%并經(jīng)統(tǒng)計學分析P＜0.05，該藥物劑量即為有效。若動物體質(zhì)量下降超過20%或藥物相關(guān)的死亡數(shù)超過20%，則認為該藥物劑量具有嚴重毒性。

以時間點為X 軸，腫瘤體積為Y 軸繪制腫瘤生長曲線（采用GraphPad Prism 數(shù)據(jù)分析繪圖軟件）；以時間點為X 軸，小鼠體質(zhì)量為Y 軸繪制體質(zhì)量變化曲線。測定數(shù)據(jù)以Mean±SEM 表示，采用Microsoft Excel 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，兩組間計量資料比較，經(jīng)方差齊性檢驗后選擇t檢驗，P＜0.05 為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 TC-FPT 鹽酸鹽等對IDO1 抑制的影響

如圖2 所示， 對IDO1 抑制活性由強至弱：epacadostat ＞NLG919 ＞TC-FPT 鹽酸鹽≌TC-FPT 游離態(tài)＞D-1-MT，IC50依次為71.52、188、5 624、7 829和27 651 nM。

圖2 TC-FPT鹽酸鹽等對IDO1抑制的影響

2.2 TC-FPT 鹽酸鹽等對HEK-293 細胞抑制的影響

如圖3 所示，對IDO1 的細胞水平抑制活性由強至弱：epacadostat ＞NLG919 ＞TC-FPT 鹽酸鹽?TC-FPT 游離態(tài)＞D-1-MT，IC50依次為22.80、974.7、4 250、5 032和＞100 000 nM。

圖3 TC-FPT鹽酸鹽等對HEK-293細胞抑制的影響

2.3 TC-FPT 對小鼠腸癌CT26.WT 同種移植瘤模型的影響

CT26.WT 細胞小鼠同種移植腫瘤生長曲線如圖4 所示，L-乳酸TC-FPT 150 mg/kg 和100 mg/kg 劑量組，腫瘤生長明顯低于溶媒對照組（P＜0.01）；L-乳酸TCFPT 50 mg/kg 劑量組腫瘤生長略低于溶媒對照組（P＞0.05）；epacadostate 組和NLG919 組腫瘤生長與溶媒對照組相當（P＞0.05）。

圖4 受試物對小鼠腸癌CT26.WT細胞的同種移植瘤的生長抑制作用（Mean±SEM，n＝10）

Day 14 時，L- 乳 酸TC-FPT 150 mg/kg、100 mg/kg和50 mg/kg 劑量組的相對腫瘤增值率（T/C）分別為38.66（P＜0.01）、43.33%（P＜0.01）和62.14%（P＞0.05）；epacadostate 和NLG919 組分別為86.27%（P＞0.05）和54.40%（P＞0.05）。Day 14 稱量結(jié)束后，對小鼠進行安樂死，取腫瘤稱重并拍照。如表1 所示，溶媒對照組平均瘤質(zhì)量為：（2.583±0.244）g；L-乳酸TCFPT 150 mg/kg、100 mg/kg 和50 mg/kg 劑量組平均瘤質(zhì)量為：（1.333±0.127）g、（1.736±0.151）g 和（2.14±0.29）g，與溶媒對照組相比分別下降了48.39%（P＜0.001）、32.79%（P＜0.01）和17.15%（P＞0.05）；epacadostate 和NLG919 平均瘤質(zhì)量為（2.16±0.284）g 和（1.796±0.309）g，比溶媒對照組下降了16.38%（P＞0.05）和30.47%（P＞0.05）。

如圖5 顯示，L- 乳酸TC-FPT 150 mg/kg 和100 mg/kg 劑量組腫瘤體積明顯小于溶媒對照組。在本試驗中，L-乳酸TC-FPT 表現(xiàn)出對腫瘤生長的明顯抑制作用，L-乳酸TC-FPT 150 mg/kg 劑量組具有明顯抗腫瘤活性（T/C ＜40%，P＜0.05）；epacadostate 和NLG919 組無明顯抗腫瘤活性。

圖5 受試物對小鼠腸癌CT26.WT的同種移植瘤的影響

溶媒對照組小鼠體質(zhì)量不斷增長，給藥小鼠體質(zhì)量有所下降（圖6）。Day 14 時，與Day 0 相比，溶媒對照組小鼠BWC 為17.43%；L-乳酸TC-FPT 150 mg/kg、100 mg/kg 和50 mg/kg 劑量組體質(zhì)量變化率分別為-0.71%、2.13%和7.95%；epacadostate 和NLG919 組體質(zhì)量變化率為13.75%和15.79%。藥物相關(guān)致死數(shù)為0。以上結(jié)果表明，L-乳酸TC-FPT 對小鼠體質(zhì)量增長具有一定的生抑制作用，但無明顯藥物相關(guān)毒性。

圖6 受試物對荷小鼠腸癌CT26.WT的Balb/c小鼠體質(zhì)量的影響（Mean±SEM，n=10）

2.4 藥代動力學

Balb/c 小鼠靜脈給予20 mg/kg TC-FPTL-malate type B 后雄性的Cmax為2 129.36 ng/mL，AUC0-t為6 248.47 h·ng/mL， 雌性的Cmax為1 880.12 ng/mL，AUC0-t為5 744.79 ng·h /mL；Balb/c 小鼠口服給予100 mg/kg TC-FPTL-malate type B 后雄性的Cmax為946.06 ng/mL，AUC0-t為8 887.52 ng·h /mL，F(xiàn) 為28.45 %，雌 性 的Cmax為1 681.71 ng/mL，AUC0-t為9 527.89 ng·h/mL，F(xiàn) 為33.17%（表2，圖7、8）。

表2 Balb/c小鼠單次靜脈/口服給予TC-FPT L-malate type B后藥代動力學參數(shù)

圖7 Balb/c小鼠單次靜脈給予TC-FPT L-malate type B后血漿藥物濃度-時間曲線（n=3/性別）

圖8 Balb/c小鼠單次口服給予TC-FPT L-malate type B后血漿藥物濃度-時間曲線（n=3/性別）

3 討論

IDO1 作為潛在的抗腫瘤治療靶標，盡管在臨床研究中出現(xiàn)了一些失敗，但還不能將其全盤否定。目前，仍有一些機構(gòu)在進行這方面的研究[6-7]，可能為未來的臨床研究提供支持，如Singh 等[8]基于人IDO1 的晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計了一些配體。本研究采用體外及體內(nèi)的生物活性評價法，初步考察了氟哌色胺酮的抗癌活性，氟哌色胺酮對IDO1 具有一定的抑制作用，且對小鼠腸癌CT26.WT同種移植瘤模型的腫瘤生長有明顯抑制作用。經(jīng)口給藥具有可接受的藥代動力學特性。

體外活性研究中epacadostat、NLG919 活性要高于TC-FPT，而體內(nèi)抑瘤效果卻不如后者，可能與epacadostat 的體內(nèi)代謝有關(guān)。Yue 等[9]研究報道了epacadostat 的體內(nèi)藥代動力學，經(jīng)口給藥后在大鼠和犬的生物利用度分別為11%和59%。從一般經(jīng)驗規(guī)律推知，epacadostat 在小鼠的生物利用度可能與大鼠的相當或更低。

因此TC-FPT 具有良好的體內(nèi)外抗腫瘤活性以及安全性。以上的結(jié)果均表明，該化合物可能夠作為一種新的抗腫瘤候選藥物。

當前該領(lǐng)域出現(xiàn)了如下幾個新的發(fā)展趨勢。其一，進一步研究開發(fā)針對IDO的抑制劑，但不限于化學小分子，如Zhu等[10]報道了一種通過靶向IDO1發(fā)揮抑制腫瘤生長、增強抗腫瘤免疫應答作用的功能性適配體（aptamer），并具有良好的安全性。其二，一些新的生物學機制的發(fā)現(xiàn)可能促進對該靶點的理解。如德國馬克斯·普朗克生物化學研究所的Peter J. Murray領(lǐng)導的研究團隊發(fā)現(xiàn)IDO代謝產(chǎn)物犬尿氨酸會通過SLC7A11（溶質(zhì)載體家族7成員11）運入細胞并抑制腫瘤的鐵死亡，從而揭示了IDO促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的新機制[11]。Zhai等[12]研究發(fā)現(xiàn)早先認為的與IDO相關(guān)的抗腫瘤作用可能與色氨酸代謝無關(guān)。其三，多靶點藥物的開發(fā)是一個研究方向。Wu等[13]報道了IDO1/TDO2（tryptophan 2,3-dioxygenase 2，色氨酸-2,3-雙加氧酶2）雙靶點抑制劑AT-0174可干擾腫瘤細胞代謝并增強抗腫瘤免疫力。Kaproń等[14]首次報道了一種人DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱα與IDO1雙抑制劑，體外研究顯示其具有良好的癌細胞抑制作用。其四，開發(fā)IDO抑制劑的其他適應證。如Cao等[15]研究顯示，丹參素作為一種IDO1抑制劑具有抗肝纖維化的作用?？傊?，在對IDO靶點及通路的新認識的基礎(chǔ)上，開發(fā)不限于小分子抑制劑或單一靶點的藥物將會極大拓展該領(lǐng)域，這或?qū)⒋俪尚驴鼓[瘤藥物的誕生。