馬尚志

（甘肅太子山國家級自然保護(hù)區(qū)管護(hù)中心，甘肅 臨夏 731100）

外生菌根指植物根系與土壤真菌構(gòu)建的互惠共生體，外生菌根在森林生態(tài)系統(tǒng)中廣泛存在[1]，是森林生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分。外生菌根真菌幫助植物吸收氮、磷等養(yǎng)分[2]，促進(jìn)植物生長和改良土壤結(jié)構(gòu)。已知的外生菌根有兩萬多種[3]，我國現(xiàn)存的外生菌根據(jù)報(bào)導(dǎo)有500多種。

落葉松和紅樺樹種具有早期速生、適應(yīng)性強(qiáng)、材質(zhì)優(yōu)良等優(yōu)勢，在我國的荒山綠化、工業(yè)用材等應(yīng)用中具有不可替代的重要作用[4]。針對甘肅太子山林區(qū)紅樺和落葉松外生菌根真菌多樣性的研究極為必要。選取分子生物學(xué)方法，開展甘肅太子山林區(qū)的真菌多樣性的研究，為外生菌根真菌技術(shù)在甘肅太子山林區(qū)紅樺和落葉松的人工造林提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

甘肅太子山林區(qū)位于青藏高原和黃土高原過渡帶，林地面積為8×104hm2，林區(qū)大部分地區(qū)屬于山地，海拔高低不一，有針葉林植被、干草原植被、闊葉落葉林植被等不同類型植被。研究區(qū)域年平均溫度為5℃左右，適宜栽培抗逆性強(qiáng)的樹種。紅樺和落葉松具有極強(qiáng)的耐寒性和耐旱性，具有較強(qiáng)的酸堿適應(yīng)能力，適宜在該地域種植[5]。

1.2 樣品采集

在甘肅太子山林區(qū)的紅樺林和落葉松林進(jìn)行采樣，各選取2 個(gè)樣地，每個(gè)樣地分別隨機(jī)選擇25 株紅樺與25 株落葉松，挖取樣品的根系，研究各樣品的外生菌根真菌的多樣性。利用自封袋密封后帶回至實(shí)驗(yàn)室，在溫度為5℃左右的環(huán)境儲(chǔ)存，共采集紅樺與落葉松的根系樣本共100份。

1.3 樣品處理

將所采集的根系樣品在自來水中浸泡數(shù)小時(shí)后，用孔徑為400 μm 的土樣篩進(jìn)行清洗，將紅樺和落葉松根系上的植物殘?bào)w和土壤顆粒去除[6]。選?。? mm 直徑的根系樣本，剪成長度為1 cm的根段，通過顯微鏡觀察紅樺和落葉松根系的外生菌根的顏色、形狀和大小，確定真菌品種，分析樣品菌套表面特征以及質(zhì)地。選取根段進(jìn)行外生菌根的研究，對于老化的菌根需要及時(shí)去除，記錄樣品外生菌根未侵染的根尖數(shù)量以及外生菌根根尖數(shù)量。將外生菌根根尖依據(jù)形態(tài)特征分類，記錄不同形態(tài)的外生菌根的根尖數(shù)量。

1.4 提取樣品DNA

選取十六烷基三甲基溴化方法，提取樣品外生菌根的DNA[7]。選取高通量組織破碎儀粉碎樣品的外生菌根，設(shè)置破碎儀的振蕩頻率為2 000次/min。樣品粉碎后，放入高速冷凍離心機(jī)中。完成離心處理后，加入400 μL的十六烷基三甲基溴化溶液，繼續(xù)粉碎外生菌根。將離心處理后的樣品，放入溫度為70℃的水浴鍋，水浴60 min 后，加入400 μL 的CIA溶液后，大力振蕩萃取。將通過離心處理獲取的上清液，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)。去除離心管內(nèi)的上清液，剩余樣品進(jìn)行干燥處理，提取樣品的DNA，將所提取的DNA 置于30 μL 的去離子水內(nèi)，作為檢測樣本。

1.5 DNA序列分析

選取華大基因組研究中心有限公司的序列分析試劑盒，對DNA 樣本進(jìn)行測序。將測序獲取的ITS 作為樣品的靶序列，在GenBank 數(shù)據(jù)庫內(nèi)搜索該序列的同源序列，挑選與樣品形態(tài)型序列相近程度最高的參考序列，對外生菌根真菌與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)合，鑒定紅樺和落葉松外生菌根真菌。選?。?6%的序列相似性，設(shè)置為一個(gè)種類。

1.6 數(shù)據(jù)分析

1.6.1 優(yōu)勢度與優(yōu)勢類群

紅樺和落葉松外生菌根的真菌物種優(yōu)勢度，利用重要值表示。重要值由外生菌根真菌的相對頻度和相對多度之和組成，外生菌根真菌重要值越高時(shí)[8]，該物種具有更高的優(yōu)勢度。

外生菌根真菌物種的相對多度的計(jì)算公式如下：

被檢測的外生菌根真菌樣本數(shù)量＜25%時(shí)，設(shè)置該外生菌根真菌為稀有種；被檢測的外生菌根真菌樣本數(shù)量≥25%時(shí)，設(shè)置該外生菌根真菌為常見種；被檢測的外生菌根真菌樣本數(shù)量≥75%時(shí)，設(shè)置該外生菌根真菌為優(yōu)勢種。

1.6.2 外生菌根真菌多樣性

選取α 多樣性檢測方法，檢測紅樺和落葉松外生菌根真菌的多樣性。

外生菌根真菌的Simpson優(yōu)勢度指數(shù)計(jì)算公式如下：

外生菌根真菌的Shannon多樣性指數(shù)計(jì)算公式如下：

外生菌根真菌的Pielou均勻度指數(shù)計(jì)算公式如下：

外生菌根真菌的Jaccad相似性指數(shù)計(jì)算公式如下：

外生菌根真菌的Sorenson相似度指數(shù)計(jì)算公式如下：

式中：Pi與S分別表示菌根的相對重要值以及研究區(qū)域每個(gè)樣地檢測出的菌根菌種類數(shù)；a與b分別表示樣地與樣地檢測的菌根菌種類別數(shù)量；j表示研究區(qū)域的不同樣地檢測的共同菌根菌種類別數(shù)量。

1.6.3 真菌侵染率

真菌侵染率計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

外生菌根真菌多樣性指外生菌根群落中的真菌種類的多少，多樣性是衡量真菌群落規(guī)模的重要指標(biāo)。外生菌根真菌的分布越均勻，真菌種類越多時(shí)，外生菌根的真菌具有更高的多樣性指數(shù)。土壤條件、地理?xiàng)l件等因素對外生菌根真菌的侵染率存在顯著影響。針對紅樺外生菌根真菌多樣性和落葉松外生菌根真菌多樣性，分別進(jìn)行研究。

2.1 紅樺外生菌根真菌多樣性

甘肅太子山林區(qū)紅樺外生菌根真菌重要值排名前五的分別為青霉、擬青霉、毛霉、犁頭霉以及毛殼菌，其重要值分別為15.1%、12.5%、10.5%、8.5%以及5.8%。

紅樺外生菌根真菌多樣性指數(shù)結(jié)果見表1。

表1 紅樺外生菌根真菌多樣性指數(shù)Tab.1 Diversity index of ectomycorrhizal fungi of Betula albo-sinensis

通過表1 試驗(yàn)結(jié)果可以看出，甘肅太子山林區(qū)的2 個(gè)樣地的紅樺外生菌根真菌多樣性的豐富度指數(shù)、Shannon 多樣性指數(shù)等眾多參數(shù)，均存在明顯的差異。樣地2 的各項(xiàng)多樣性指數(shù)均明顯高于樣地1。表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，樣地2的紅樺外生菌根真菌多樣性高于樣地1。樣地1 與樣地2 兩個(gè)樣地的Jaccard指數(shù)為0.29，對比結(jié)果表明，甘肅太子山林區(qū)樣地1與樣地2的紅樺外生菌根真菌存在較低的相似度。進(jìn)一步分析研究區(qū)域的紅樺外生菌根真菌多樣性，30 a 生的中齡紅樺外生菌根真菌的多樣性明顯低于15 s 的幼齡的紅樺外生菌根真菌，表明紅樺的樹齡對外生菌根真菌的多樣性存在一定的影響。樣地2 的外生菌根真菌侵染率高于樣地1 的侵染率，樣地2 中多為幼齡紅樺林，再次驗(yàn)證幼齡紅樺樹種，更容易受到侵染，形成外生菌根。

2.2 落葉松外生菌根真菌多樣性

甘肅太子山林區(qū)落葉松外生菌根真菌重要值排名前五的分別為青霉、莖點(diǎn)霉、輪枝孢、犁頭霉以及指輪枝孢，其重要值分別為14.5%、11.5%、9.8%、8.9%以及6.3%。落葉松外生菌根真菌多樣性指數(shù)結(jié)果見表2。

表2 落葉松外生菌根真菌多樣性指數(shù)Tab.2 Diversity index of ectomycorrhizal fungi of Larix gmelinii

通過表2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，甘肅太子山林區(qū)的兩個(gè)樣地的落葉松外生菌根真菌多樣性的豐富度指數(shù)、Shannon 多樣性指數(shù)等眾多參數(shù)同樣存在明顯的差異。樣地2的各項(xiàng)多樣性指數(shù)均明顯高于樣地1。表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，樣地2的落葉松外生菌根真菌多樣性明顯高于樣地1，同時(shí)分布均勻性高于樣地1。樣地1 與樣地2 的兩個(gè)樣地的Jaccard 指數(shù)為0.37，對比結(jié)果表明，樣地1 與樣地2 的落葉松外生菌根真菌存在較低的相似度。進(jìn)一步分析研究區(qū)域的紅樺外生菌根真菌多樣性，樣地2的落葉松外生菌根真菌多為陽坡，表明陽坡的落地松外生菌根真菌多樣性高于陰坡。表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明落葉松外生菌根真菌的多樣性，受坡向影響。甘肅太子山林區(qū)的落葉松樣地2 的外生菌根真菌侵染率高于樣地1 的侵染率，樣地2的落葉松外生菌根多為陽坡，因此更容易受到侵染，形成外生菌根。

以上試驗(yàn)結(jié)果可以看出，甘肅太子山林區(qū)的紅樺和落葉松外生菌根真菌多樣性指數(shù)較高，表明甘肅太子山林區(qū)的紅樺和落葉松外生菌根真菌資源極為豐富，同時(shí)分布較為均勻。紅樺和落葉松外生菌容易受到土壤條件、季節(jié)等眾多因素影響，本文重點(diǎn)研究了樹齡以及坡向?qū)ν馍婢N類數(shù)量的影響，二者對外生菌根真菌多樣性均存在影響。對比紅樺和落葉松外生菌根的真菌多樣性，甘肅太子山林區(qū)的紅樺外生菌根的真菌多樣性優(yōu)于落葉松的外生菌根的真菌多樣性。環(huán)境對樹種外生菌根的形成有著一定影響，幼齡以及陽坡的樹種，容易被外生菌根侵染，其真菌多樣性更高。

3 結(jié)語

由于外生菌根的子實(shí)體容易受到破壞，同時(shí)外生菌根的真菌存在一定的分散性，所采集的樣品可能并未采集到部分類別的真菌，甘肅太子山林區(qū)的紅樺和落葉松外生菌根真菌的種類可能更加豐富。將對相同林區(qū)不同季節(jié)的外生菌根真菌多樣性進(jìn)行詳細(xì)地調(diào)查與分析。外生菌根真菌多樣性的研究，對于研究區(qū)域的育苗造林、恢復(fù)森林生態(tài)系統(tǒng)以及林區(qū)改造等應(yīng)用，具有重大的研究意義及廣闊的發(fā)展前景。