華真，李眾，張學(xué)芬，亓建洪，宋洪強(qiáng)，周路，熊藉培，王凱聲，耿彩云，張藝

（山東第一醫(yī)科大學(xué)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與康復(fù)學(xué)院，山東泰安 271000）

關(guān)節(jié)軟骨損傷是臨床常見疾病，由于其無血管、淋巴等結(jié)構(gòu)，一旦損傷，難以自我修復(fù)。目前，臨床上尚無治療軟骨損傷的金標(biāo)準(zhǔn)［1］。同種異體骨軟骨移植（osteochondral allografts,OCAs）是臨床上治療大面積軟骨損傷常見的治療手段［2］。然而OCAs 術(shù)前通常需要2 周時(shí)間進(jìn)行微生物、病毒檢測(cè)，在此過程中軟骨細(xì)胞存活率將會(huì)發(fā)生滑坡式降低，嚴(yán)重影響OCAs 手術(shù)的臨床療效［3］。因此，需要改進(jìn)存儲(chǔ)方法來維持同種異體骨軟骨組織（allogenic osteochondral tissue,OCT）的細(xì)胞活力，以增加高質(zhì)量OCT 的應(yīng)用并改善治療結(jié)果。

機(jī)械刺激在維持關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)和功能方面至關(guān)重要，適度的機(jī)械刺激可以增加軟骨的厚度［4］，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）成分的合成以及促進(jìn)損傷關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)［5，6］。相反，缺乏足夠的機(jī)械刺激則會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨萎縮［7］。研究發(fā)現(xiàn)，低強(qiáng)度超聲（low intensity ultrasound,LIUS）可以通過抑制分解代謝細(xì)胞因子和上調(diào)合成代謝因子的表達(dá)修復(fù)軟骨損傷和延緩關(guān)節(jié)軟骨的退化［8，9］。然而，在離體組織培養(yǎng)狀態(tài)下，LIUS 刺激能否延緩OCT 軟骨細(xì)胞活性降低，抑制ECM 的降解，延長(zhǎng)保存時(shí)間未見相關(guān)報(bào)道。LIUS 改善軟骨相關(guān)疾病的潛在機(jī)制尚不完全清楚。研究表明LIUS 經(jīng)由細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）信號(hào)通路促進(jìn)修復(fù)蛋白結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)半月板損傷修復(fù)［10］。此外ERK 信號(hào)還參與關(guān)節(jié)軟骨的發(fā)育，正向調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨的厚度［11］。因此，本研究將連續(xù)低強(qiáng)度超聲（continuous low intensity ultrasound,cLIUS）應(yīng)用于體外保存的豬膝關(guān)節(jié)骨軟骨，觀察其是否能夠延長(zhǎng)骨軟骨的保存時(shí)間并對(duì)ERK 蛋白表達(dá)情況進(jìn)行探索，為體外保存OCT 提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 骨軟骨標(biāo)本獲取

6 個(gè)月齡豬，100 kg，碘伏消毒，鋪巾。行膝關(guān)節(jié)正中切口，離斷內(nèi)外側(cè)副韌帶、前后交叉韌帶及髕韌帶，充分暴露膝關(guān)節(jié)面，直徑6.5 mm 的骨軟骨移植器在膝關(guān)節(jié)股骨髁負(fù)重區(qū)取長(zhǎng)度為10.0 mm 的骨軟骨60 枚。

1.2 分組與體外處理

骨軟骨隨機(jī)分為靜態(tài)組和超聲組，每組30 個(gè)。均于DMEM 培養(yǎng)液在4℃醫(yī)用冰箱中保存。靜態(tài)組不做超聲處理。超聲組每天給予20 min 超聲刺激，采用CE-5200A 超聲清洗器，頻率42 kHz，電功率 50 W。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 軟骨細(xì)胞存活率

在保存的第14、28 d，使用震蕩切片機(jī)切成15 μm 厚的軟骨切片；滴加50 mg/L 的FDA 溶液和10 mg/L 的EB 溶液，37℃恒溫孵育15 min，PBS 清洗3遍；在450 nm 波長(zhǎng)激光激發(fā)下熒光顯微鏡觀察軟骨切片（100 倍），視野中呈現(xiàn)綠色的為活細(xì)胞，紅色為死細(xì)胞。ImageJ 軟件對(duì)圖像內(nèi)的綠紅細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞存活率（細(xì)胞存活率（%）=活細(xì)胞數(shù)目/細(xì)胞總數(shù)×100%）。

1.3.2 組織學(xué)觀察

HE 染色：4% 多聚甲醛固定骨軟骨24 h，流水沖洗后置于10% 的EDTA 脫鈣液中，針輕刺骨組織可輕易穿透，表明脫鈣完成；酒精梯度脫水，二甲苯固定，石蠟包埋，切5 μm 厚的石蠟切片，脫蠟，梯度酒精水化后染色，梯度脫水透明，封片并鏡檢。

番紅O 染色：石蠟切片脫蠟，梯度酒精水化，染色水洗，復(fù)染水洗，梯度酒精脫水透明，封片，40倍鏡下拍照。ImageJ 軟件分析番紅O 染色的積分光密度值（integrated option density,IOD）。

甲苯胺藍(lán)染色：石蠟切片脫蠟，梯度酒精水化，染色水洗，梯度酒精透明，封片鏡檢。檢測(cè)分析甲苯胺藍(lán)染色的IOD 值。

1.3.3 生物力學(xué)檢測(cè)

取軟骨部分置于壓力臺(tái)上，調(diào)節(jié)壓力臺(tái)無限靠近軟骨但不觸及，設(shè)置預(yù)壓縮力為5.0 N，以0.1 mm/s的速度對(duì)樣本進(jìn)行壓縮檢測(cè)，計(jì)算樣本在壓縮量15%時(shí)的楊氏模量。

1.3.4 Western blot 檢測(cè)ERK 蛋白

待測(cè)樣本去除軟骨下骨，液氮中研磨，加入蛋白裂解液于冰上進(jìn)行裂解，收集裂解液，離心后取上清，測(cè)定樣品蛋白濃度后加入上樣緩沖液煮沸備用；樣品10%SDS-PAGE 凝膠中電泳，隨后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上；5% 脫脂牛奶封閉1h，抗體ERK（ab201015,Abcam,Cambridge,UK）和內(nèi)參GAPDH（ab8245,Abcam,Cambridge,UK）孵育6 h 后，TBST 清洗3 遍，對(duì)應(yīng)二抗孵育2 h，顯影。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 軟骨細(xì)胞存活率

FDA/EB 染色法檢測(cè)軟骨細(xì)胞存活染色見圖1a～1d，綠色代表活的軟骨細(xì)胞，紅色或橙色代表死的軟骨細(xì)胞。兩組軟骨細(xì)胞存活率結(jié)果見表1。第14 d，超聲組活細(xì)胞數(shù)目較多，軟骨細(xì)胞存活率顯著高于靜態(tài)組（P＜0.05)；隨著時(shí)間推移，兩組軟骨細(xì)胞存活率均顯著降低（P＜0.05）；第28 d，超聲組軟骨細(xì)胞存活率高于靜態(tài)組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 連續(xù)低強(qiáng)度超聲對(duì)骨軟骨體外保存的影響形態(tài)觀察。1a～1d:軟骨細(xì)胞存活染色示超聲處理和不處理骨軟骨14、28 d時(shí)軟骨細(xì)胞存活情況；1e～1h:HE 染色示超聲處理和不處理骨軟骨14、28 d 組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化情況；1i～1l:番紅O 染色示超聲處理和不處理骨軟骨14、28 d 時(shí)組織結(jié)構(gòu)和基質(zhì)中蛋白多糖的含量和分布；1m～1p:甲苯胺藍(lán)染色示超聲處理和不處理骨軟骨14、28 d 時(shí)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和基質(zhì)中蛋白多糖的含量和分布。

表1 兩種處理骨軟骨標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果（±s）與比較

表1 兩種處理骨軟骨標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果（±s）與比較

指標(biāo)軟骨細(xì)胞存活率(%)P 值＜0.001 0.156番紅O 染色(IOD 值)＜0.001 0.053甲苯胺藍(lán)染色(IOD 值)＜0.001 0.272楊氏模量(MPa)＜0.001 0.054時(shí)間點(diǎn)14 d 28 d P 值14 d 28 d P 值14 d 28 d P 值14 d 28 d P 值ERK 蛋白水平(相對(duì)值)超聲組（n=30）75.5±1.8 54.7±3.0＜0.001 224.7±4.1 131.4±3.6＜0.001 223.7±6.0 126.4±3.1＜0.001 8.7±0.3 6.4±0.2＜0.001 0.9±0.1靜態(tài)組（n=30）65.6±1.5 52.0±3.0＜0.001 166.5±3.7 125.9±4.0＜0.001 166.7±5.0 124.7±0.8＜0.001 7.0±0.0 6.2±0.1＜0.001 0.5±0.2 0.019

2.2 組織學(xué)觀察

組織學(xué)HE 染色見圖1e～1h。第14 d，與靜態(tài)組相比，超聲組保存的骨軟骨細(xì)胞排列整齊，層次清晰，淺層細(xì)胞多呈扁平樣，體積較小，深層細(xì)胞體積較大，位于陷窩內(nèi)，整體基質(zhì)含量豐富；隨著時(shí)間推移，兩組整體基質(zhì)著色均變淺，淺層細(xì)胞排列紊亂，蛋白多糖含量下降；第28 d，靜態(tài)組和超聲組保存的骨軟骨染色均變淺，淺層細(xì)胞排列紊亂，但組織結(jié)構(gòu)依舊保持完整狀態(tài)。

番紅O 染色結(jié)果見圖1i-1l 和表1。第14 d，與靜態(tài)組相比，超聲組保存骨軟骨全層著色好且均勻，蛋白多糖含量高且分布均勻，IOD 值顯著升高（P＜0.05）；隨著時(shí)間推移，兩組基質(zhì)著色均變淺，淺層著色變淺程度明顯，蛋白多糖含量下降，IOD 值均顯著降低（P＜0.05）；第28 d，兩組保存的骨軟骨顏色略淺染，蛋白多糖流失較多，超聲組IOD 值高于靜態(tài)組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果見圖1m～1p 和表1。第14 d，與靜態(tài)組相比，超聲組保存的骨軟骨層次分明，細(xì)胞排列整齊，基質(zhì)著色較深，蛋白多糖含量豐富，IOD值顯著升高（P＜0.05）；隨著時(shí)間推移，兩組基質(zhì)染色均變淺，淺層蛋白多糖流失較多，IOD 值均顯著降低（P＜0.05）；第28 d，兩組保存的骨軟骨基質(zhì)均淡染，顏色變淺，淺層細(xì)胞排列紊亂，超聲組IOD 值高于靜態(tài)組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 生物力學(xué)檢測(cè)

楊氏模量檢測(cè)結(jié)果見表1。第14 d，超聲組的楊氏模量顯著高于靜態(tài)組（P＜0.05)。隨著時(shí)間推移，兩組骨軟骨的楊氏模量均顯著降低（P＜0.05)；第28 d，超聲組楊氏模量高于靜態(tài)組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 Western blot 檢測(cè)

Western blot 檢測(cè)ERK 蛋白表達(dá)情況見表1。超聲刺激2 h 后，超聲組ERK 蛋白表達(dá)水平顯著高于靜態(tài)組（P＜0.05）。

3 討論

生理狀態(tài)下，生物力學(xué)刺激對(duì)軟骨細(xì)胞的發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和功能至關(guān)重要，軟骨細(xì)胞感知機(jī)械應(yīng)力并轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子的激活，最終影響軟骨細(xì)胞的代謝活動(dòng)。既往研究多集中于力學(xué)刺激對(duì)軟骨細(xì)胞代謝的影響［12，13］，對(duì)體外保存OCT 施加力學(xué)刺激以延長(zhǎng)保存時(shí)間相關(guān)研究在國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。前期研究發(fā)現(xiàn)滾動(dòng)-滑動(dòng)機(jī)械刺激抑制豬骨軟骨凋亡相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，延緩軟骨細(xì)胞活性降低，抑制ECM 成分分解和力學(xué)性能的下降，延長(zhǎng)豬骨軟骨的體外保存時(shí)間［14，15］。這提示適當(dāng)?shù)牧W(xué)刺激可以抑制OCT 的活性降低，延長(zhǎng)其體外保存時(shí)間。LIUS 作為力學(xué)刺激的一種，可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖或ECM 合成緩解骨性關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展［16，17］，但其對(duì)OCT 的體外保存效果仍不清楚。本研究中，首次將cLIUS 應(yīng)用于體外保存豬骨軟骨，在保存14 d 內(nèi)保持軟骨細(xì)胞存活率高于70%，并維持豬骨軟骨良好的組織學(xué)和生物力學(xué)特性。

軟骨細(xì)胞的活性對(duì)于維持OCT 的生物化學(xué)和生物力學(xué)特性至關(guān)重要。維持軟骨細(xì)胞存活率超過70% 是保證OCAs 手術(shù)成功的必要條件［18］。本研究結(jié)果顯示，cLIUS 處理后的豬骨軟骨14 d 細(xì)胞存活率顯著高于靜態(tài)組，并達(dá)到了OCAs 細(xì)胞存活率要求。但在第28 d，兩組軟骨細(xì)胞存活率均＜70%，這提示cLIUS 可以有效延緩軟骨細(xì)胞活性降低，但在骨軟骨長(zhǎng)期保存效果方面還需要進(jìn)一步探究。組織學(xué)染色和楊氏模量結(jié)果顯示，第14 d，超聲組蛋白多糖含量和生物力學(xué)性能均優(yōu)于靜態(tài)組，但在第28 d，兩組指標(biāo)均顯著下降，這提示在14 d 內(nèi)cLIUS 可以有效抑制ECM 的降解，維持豬骨軟骨的生物力學(xué)性能。

ERK 蛋白幾乎存在于包括骨和軟骨在內(nèi)的所有組織中，是調(diào)節(jié)細(xì)胞外信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵［19］。近期研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制ERK 信號(hào)通路，增加了一氧化氮誘導(dǎo)的兔軟骨細(xì)胞凋亡［20］，這提示ERK 信號(hào)通路的潛在抗凋亡作用，增強(qiáng)ERK 信號(hào)通路的表達(dá)或許能抑制軟骨細(xì)胞凋亡，為骨軟骨相關(guān)疾病帶來積極結(jié)果。此外，ERK1/2 被認(rèn)為是生物力學(xué)環(huán)境中的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，作為整合素-ERK 信號(hào)通路的下游效應(yīng)分子，在成骨細(xì)胞中，機(jī)械應(yīng)力刺激通過整合素β1 激活ERK 信號(hào)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和重塑［21］。本研究中，cLIUS的應(yīng)用增加了ERK 蛋白的表達(dá)水平，這與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致［22，23］。然而，在包括骨性關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的一些病理模型中，ERK 蛋白的上調(diào)似乎引導(dǎo)了不利的結(jié)果［24，25］。但總的來說，本研究表明，cLIUS 刺激可能部分通過上調(diào)ERK 蛋白表達(dá)，延緩細(xì)胞存活率下降，提高體外豬骨軟骨保存時(shí)間。

本研究仍有一些需要解決的問題：（1）cLIUS 延長(zhǎng)骨軟骨保存時(shí)間的具體分子機(jī)制還需要進(jìn)行深入分析及探索；（2）cLIUS 的力學(xué)和生物學(xué)效應(yīng)與其聲學(xué)參數(shù)（強(qiáng)度、頻率、占空比等）密切相關(guān)，考慮到不同組織和細(xì)胞的特性，探究最佳的聲學(xué)參數(shù)對(duì)骨軟骨的保存效果至關(guān)重要。

本研究表明cLIUS 的應(yīng)用或許是提高體外保存OCT 的有效方法，cLIUS 可以在14 d 內(nèi)維持軟骨細(xì)胞的活性＞70%，延緩ECM 成分降解，提高骨軟骨的體外保存效果，其機(jī)制可能與上調(diào)ERK 蛋白表達(dá)有關(guān)，具體調(diào)控機(jī)理仍需進(jìn)一步研究探索。