李風(fēng)波，孫曉雷，馬信龍

（天津市天津醫(yī)院骨科，天津 300211）

人體雖然動(dòng)脈血pH 值接近中性，但局部組織會(huì)因灌注減少或糖酵解增加，出現(xiàn)局部酸中毒［1］。骨組織在生理或病理狀態(tài)下同樣會(huì)出現(xiàn)局部缺氧，H+增多，局部pH 值下降，從而影響骨代謝［2］。人體細(xì)胞膜存在可以感知細(xì)胞外H+特異性受體，能夠在酸性環(huán)境中被激活，影響胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路，使細(xì)胞功能發(fā)生相應(yīng)改變［3］。質(zhì)子感知受體廣泛參與人體多系統(tǒng)調(diào)節(jié)［4］。研究發(fā)現(xiàn)骨內(nèi)酸性環(huán)境通過質(zhì)子感知受體來影響骨代謝動(dòng)態(tài)平衡，尤其是卵巢癌G 蛋白偶聯(lián)受體1 廣泛在骨細(xì)胞上表達(dá)，并參與調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞骨吸收和成骨細(xì)胞骨形成等［5，6］。因此，了解質(zhì)子感知受體在骨組織中的功能及相關(guān)機(jī)制對(duì)治療相關(guān)骨病有重要意義。本文就近年來質(zhì)子感知受體在骨代謝中的相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

1 質(zhì)子感知受體的分類及相關(guān)作用機(jī)制

G 蛋白偶聯(lián)受體是細(xì)胞膜表面可以與G 蛋白耦聯(lián)的受體，含有7 個(gè)跨膜區(qū)，是人體發(fā)現(xiàn)最大的蛋白質(zhì)超家族，可以調(diào)節(jié)多種生物學(xué)反應(yīng)［7］。目前GPCRs 亞家族中發(fā)現(xiàn)有4 種質(zhì)子感知受體，包括卵巢癌G 蛋白偶聯(lián)受體1（ovarian cancer G protein-coupled receptor 1,OGR1）、G 蛋白偶聯(lián)受體4（G proteincoupled receptor 4,GPR4）、誘導(dǎo)細(xì)胞停滯于G2/M 期的G 蛋白偶聯(lián)受體（G2 accumulation,G2A）和T 細(xì)胞死亡偶聯(lián)基因8（T-cell death associated gene 8，TDAG8）。他們存在于細(xì)胞膜的表面，能夠被細(xì)胞外酸激活，進(jìn)而與G 蛋白偶聯(lián)影響細(xì)胞內(nèi)下游相關(guān)信號(hào)通路，改變細(xì)胞的功能［8～10］。

這4 種質(zhì)子感知受體都可以感知細(xì)胞外質(zhì)子的濃度變化，但相關(guān)機(jī)制不完全相同。在pH 值比較低的情況下，OGR1 受到細(xì)胞外質(zhì)子刺激后與Gq/11 蛋白偶聯(lián)，激活磷脂酶C（PLC）/Ca2+信號(hào)通路，引起細(xì)胞生物學(xué)變化［11］。而GPR4 和TDAG8 感知質(zhì)子后與Gs 蛋白偶聯(lián)，激活腺苷酸環(huán)化酶/cAMP 信號(hào)通路發(fā)揮作用［12，13］。TDAG8 感知質(zhì)子后與G12/13 蛋白偶聯(lián)，還可激活Rho 信號(hào)通路，導(dǎo)致相關(guān)生物學(xué)變化［14］。OGR1 和G2A 可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)肌醇磷酸（inositol phosphate,IP）增加，并且與質(zhì)子濃度成正相關(guān)，G2A 還可以增加細(xì)胞內(nèi)cAMP 以及激活zif269 啟動(dòng)子［15］。研究報(bào)道在不同pH 值下以cAMP 和IP 為指標(biāo)，對(duì)4 種質(zhì)子感知受體對(duì)質(zhì)子敏感程度進(jìn)行研究，得出GPR4 和TADG8 對(duì)質(zhì)子最為敏感，G2A 最弱，OGR1 中等［16］。OGR1 在pH 值7.8 環(huán)境下是沒有活性的，但在pH 值6.8 環(huán)境下可完全激活肌醇磷酸［17］。質(zhì)子感知受體通過胞外結(jié)構(gòu)域中的組氨酸殘基來識(shí)別質(zhì)子，并與細(xì)胞內(nèi)的其他因子相互作用，在細(xì)胞的不同階段發(fā)揮著不同的作用［18］。質(zhì)子感知受體在堿性環(huán)境中組氨酸殘基間氫鍵比較穩(wěn)定，而在酸性環(huán)境下組氨酸殘基被破壞處于不穩(wěn)定狀態(tài)，轉(zhuǎn)化為活性構(gòu)象，從而啟動(dòng)下游一系列信號(hào)變化。質(zhì)子感知受體廣泛存在于人體各組織中，在不同組織不同pH值調(diào)節(jié)下發(fā)生不同的反應(yīng)［19］。下面詳細(xì)介紹質(zhì)子感知受體在骨組織的作用。

2 質(zhì)子感知受體與骨代謝的聯(lián)系

骨代謝穩(wěn)定主要依靠成骨細(xì)胞骨形成以及破骨細(xì)胞骨吸收兩者之間平衡來維持，一旦兩者之間失衡，會(huì)導(dǎo)致各種骨病如骨質(zhì)疏松、骨硬化癥等骨病［20，21］。骨代謝受到局部pH 值影響很大，眾所周知骨骼中含有大量的堿性礦物如羥基磷灰石，但酸堿失衡后，骨組織中的堿性物質(zhì)可用于中和酸性物質(zhì)。pH 值對(duì)骨細(xì)胞影響也極為敏感，酸中毒可抑制成骨細(xì)胞的礦化，激活破骨細(xì)胞吸收骨和其他礦化組織。細(xì)胞外酸中毒可能由激素、生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子等刺激細(xì)胞引起細(xì)胞代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)導(dǎo)致局部酸化［1，22］。酸中毒對(duì)骨骼的危害早已為人所知，特別是質(zhì)子感知受體GPCR 家族，如OGR1，對(duì)細(xì)胞外酸反應(yīng)敏感并能調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞骨形成吸收等細(xì)胞功能［23］。所以，研究質(zhì)子感知受體和骨代謝之間的關(guān)系，有助于進(jìn)一步闡明細(xì)胞外酸化作用于機(jī)體骨代謝的機(jī)制，這可能對(duì)臨床治療骨質(zhì)疏松癥等代謝骨病提供一種新的思維策略及治療靶點(diǎn)。

2.1 質(zhì)子感知受體與破骨細(xì)胞

酸中毒對(duì)骨組織危害早已眾所周知但被認(rèn)為是由骨礦物質(zhì)物理化學(xué)溶解引起的，是骨組織充當(dāng)“離子交換”以被動(dòng)方式緩沖酸中毒。然而細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，質(zhì)子對(duì)培養(yǎng)的大鼠破骨細(xì)胞有直接的刺激作用。代謝性酸中毒可直接誘導(dǎo)破骨細(xì)胞骨吸收并抑制成骨細(xì)胞骨形成［24，25］。

Pereverzev 等［26］首次報(bào)道了 RANKL 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞獲得的破骨細(xì)胞中表達(dá)OGR1。細(xì)胞外酸化作用于OGR1 通過破骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)破骨細(xì)胞遷移、分化和骨吸收活性至關(guān)重要。破骨細(xì)胞OGR1 感知細(xì)胞外質(zhì)子后，可激活蛋白激酶C（PKC），影響促凋亡蛋白或抗凋亡蛋白的磷酸化狀態(tài)，或經(jīng)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1 和2（ERK1/2）信號(hào)傳導(dǎo)，延長(zhǎng)破骨細(xì)胞存活時(shí)間，并且破骨細(xì)胞存活具有pH 值依賴性。Krieger 等［27］采用顯微CT 掃描和組織形態(tài)學(xué)測(cè)量8 周雄性O(shè)GR1 基因敲除小鼠和野生型小鼠，發(fā)現(xiàn)OGR1 基因敲除小鼠脛骨和椎體骨小梁的皮質(zhì)骨體積明顯增加；OGR1 基因敲除小鼠中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞表達(dá)均增加，骨轉(zhuǎn)換增加，但骨形成增加大于骨吸收。最終質(zhì)子受體OGR1 缺乏的小鼠骨密度增加。為進(jìn)一步驗(yàn)證酸中毒對(duì)破骨細(xì)胞OGR1 影響是否對(duì)骨吸收至關(guān)重要，后續(xù)采用特異性破骨細(xì)胞OGR1 敲除的小鼠培養(yǎng)3 個(gè)月，顯微CT 顯示OGR1 基因敲除小鼠脛骨和股骨骨密度增加；脛骨抗酒石酸酸性磷酸酶染色顯示OGR1 基因敲除小鼠脛骨破骨細(xì)胞數(shù)目減少。與野生型小鼠相比，體外培養(yǎng)敲除OGR1 基因小鼠破骨細(xì)胞表現(xiàn)為骨陷窩形成、破骨細(xì)胞特異性染色和破骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)減少，這與破骨細(xì)胞影響細(xì)胞NFATc1 核轉(zhuǎn)位有關(guān)。

高尿鈣癥是代謝性酸中毒的常見特征，并且對(duì)骨代謝產(chǎn)生影響，但具體機(jī)制不明確。為研究質(zhì)子感知受體在其中作用，采用敲除OGR1 基因小鼠，研究證實(shí)在酸性環(huán)境下OGR1 可改變Na+/H+-交換異構(gòu)體3在腎臟中重新分布，從而導(dǎo)致尿鈣增多［28］。Yang等［29］采用破骨細(xì)胞缺乏csf-1 基因的大鼠，通過注射CSF-1 恢復(fù)破骨細(xì)胞群，在CSF-1 治療2 d 后，開始在長(zhǎng)骨中出現(xiàn)TRAP 陽(yáng)性破骨細(xì)胞，并在4 d 達(dá)到峰值。 通過高密度微陣列進(jìn)行測(cè)量顯示在CSF-1治療的2 d 內(nèi)，OGR1 mRNA 表達(dá)上升了近7 倍，然后在接下來的4 d 內(nèi)略有下降。在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，OGR1 的特異性抑制可以明顯抑制破骨細(xì)胞分化。研究表明OGR1 在體內(nèi)和體外破骨細(xì)胞生成過程中早期表達(dá)，并在破骨細(xì)胞分化中發(fā)揮作用。有研究采用特異性抑制劑CUCL2 抑制OGR1 作用，利用TRAP 特異性染色、Ca2+熒光標(biāo)記、Hoechst 33342 核染色、免疫熒光及PCR 等監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外酸化通過質(zhì)子感知受體OGR1 通過蛋白激酶C 信號(hào)通路可提高破骨細(xì)胞的存活率［26］。除了質(zhì)子感知受體OGR1 外，質(zhì)子感知受體TDAG8 也能通過Rho信號(hào)通路來增強(qiáng)破骨細(xì)胞骨吸收活性，當(dāng)敲除TDAG8 基因小鼠骨密度明顯增加［30］。還發(fā)現(xiàn)TDAG8參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠模型中的疾病進(jìn)展，TDAG8缺失可減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠疾病進(jìn)展和疼痛癥狀，并證實(shí)TDAG8 確實(shí)可以抑制巨噬細(xì)胞和衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞來減弱類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疼痛［31］。

2.2 質(zhì)子感知受體與成骨細(xì)胞

質(zhì)子感知受體除了在破骨細(xì)胞中表達(dá)，同樣也表達(dá)于成骨細(xì)胞上。大鼠組織切片免疫組織化證實(shí)了成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中存在OGR1。Tomura 等［32］研究發(fā)現(xiàn)人類成骨細(xì)胞系NHOst 表達(dá)OGR1，并發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外酸性刺激OGR1 與Gq/11 蛋白偶聯(lián)后，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平和磷酸肌醇短暫增加，誘導(dǎo)環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）表達(dá)增加，進(jìn)一步產(chǎn)生前列腺素E2（PGE2），之后激活成骨細(xì)胞表達(dá)RANKL，RANKL 是破骨細(xì)胞分化重要因子，可促進(jìn)破骨細(xì)胞分化形成。當(dāng)使用OGR1 特異性抑制劑siRNA 阻斷后，可抑制酸誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞COX-2 增加。Kadowaki 等［33］推測(cè)成骨細(xì)胞可能釋放某種OGR1 激動(dòng)因子并激活破骨細(xì)胞表達(dá)OGR1。研究篩選了多種細(xì)胞上清液和器官提取物，發(fā)現(xiàn)ST-2 成骨細(xì)胞上清液和豬胰腺組織提取物對(duì)OGR1 有較強(qiáng)激動(dòng)作用。最終純化鑒定出活性金屬（Fe、Zn、Co、Mn 和Ni） 是OGR1 一種新型激動(dòng)劑，可在中性環(huán)境下單獨(dú)激活OGR1。這些OGR1 激動(dòng)金屬通過OGR1 在原代破骨細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Gq 偶聯(lián)的肌醇磷酸信號(hào)發(fā)揮作用。 并且這些OGR1 激動(dòng)金屬通過與質(zhì)子作用的相同殘基激活OGR1。OGR1 中第2 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域中的L74P 可能導(dǎo)致受體構(gòu)象發(fā)生改變的部位，從而干擾質(zhì)子或金屬離子與組氨酸殘基的相互作用，影響與G蛋白偶聯(lián)，改變細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制［34］。Krieger等［5］研究這些結(jié)果表明，G 蛋白信號(hào)16 在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞OGR1 對(duì)代謝性酸中毒的反應(yīng)和后續(xù)刺激破骨細(xì)胞骨吸收中也起到重要作用。除了OGR1 質(zhì)子感知受體外，成骨細(xì)胞中檢測(cè)到質(zhì)子感知受體GPR4 和GPR65 表達(dá)，在酸性培養(yǎng)條件下，GPR4 和GPR65可增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，并能通過促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌RANKL 來發(fā)揮作用［35，36］。

3 總結(jié)與展望

全身及局部代謝性酸中毒與骨代謝關(guān)系密切相關(guān)，但常常易被忽視。雖然研究已證實(shí)細(xì)胞外酸中毒可以通過質(zhì)子感知受體抑制成骨細(xì)胞分化和生長(zhǎng)，同時(shí)促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成和骨吸收活性。但成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞感知細(xì)胞外酸變化的機(jī)制可能很復(fù)雜，在本綜述中，作者討論了質(zhì)子感知受體對(duì)成骨和破骨細(xì)胞的影響及其機(jī)制，尤其是質(zhì)子感知受體OGR1。越來越多的證據(jù)證實(shí)OGR1 在骨組織生理和病理狀態(tài)中的重要作用；但其具體機(jī)制仍不完全明確，進(jìn)一步研究質(zhì)子感知受體在骨代謝中的調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)于開發(fā)治療骨代謝疾病藥物提供了新的治療靶點(diǎn)和新思路。