■ 任蒙蒙 董 偉 湛夢(mèng)穎 汪仕奎 邢麗維

（帝斯曼（中國(guó)）動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研發(fā)有限公司，河北霸州 065799）

在現(xiàn)代畜牧業(yè)中，抗生素因安全問(wèn)題已經(jīng)被限制作為飼料添加劑使用，抗生素替代物成為動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究的重點(diǎn)。市場(chǎng)上具有抑菌效果的產(chǎn)品種類(lèi)繁多，作用機(jī)理和化學(xué)特性各不相同，如何科學(xué)有效地評(píng)估相關(guān)產(chǎn)品的實(shí)際效果給行業(yè)帶來(lái)困擾[1-2]。目前，評(píng)估體外抑菌方法主要擴(kuò)散法（瓊脂平板擴(kuò)散法和E-test法）、梯度稀釋法（微量、大量肉湯稀釋和瓊脂稀釋?zhuān)?、時(shí)間殺傷試驗(yàn)、薄層色譜生物自顯影法、生物發(fā)光和流式細(xì)胞熒光法等[3]。首先，這些方法中所涉及的培養(yǎng)基均為標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，而抑菌產(chǎn)品在飼料中的實(shí)際效果會(huì)受到多種因素的影響，比如飼料成分、pH。因此，基于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的評(píng)估方法無(wú)法準(zhǔn)確模擬實(shí)際生產(chǎn)效果。其次，這些經(jīng)典方法也具有各自的局限性。比如擴(kuò)散法的抑菌原理是滲透擴(kuò)散產(chǎn)生濃度梯度，適用于易溶于水的抑菌物質(zhì)的測(cè)定，對(duì)于水溶性低的植物精油，可用二甲基亞砜進(jìn)行助溶[4-5]，然而以二甲基亞砜為溶劑時(shí),還需要注意其本身的抗菌作用[6]，而且添加助溶劑與實(shí)際使用場(chǎng)景有一定差別。瓊脂稀釋法操作繁瑣，不適合實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)開(kāi)展，只能作為回顧性監(jiān)測(cè)[7]。再次，因成本限制一般企業(yè)不具有使用薄層色譜生物顯影和流式細(xì)胞熒光法評(píng)估抑菌劑性能的能力。由此可見(jiàn)，基于自身飼料配方組成、抑菌劑的特性、設(shè)備情況和操作的便利性等因素綜合考慮開(kāi)發(fā)出的評(píng)估方法，才能滿(mǎn)足大多數(shù)全價(jià)飼料企業(yè)的現(xiàn)實(shí)需求。

作為一種安全有效的抗生素類(lèi)添加劑，苯甲酸在畜禽生產(chǎn)中得到廣泛的應(yīng)用[8]。然而，苯甲酸微溶于水，不能使用基于擴(kuò)散的牛津杯法等來(lái)評(píng)估其抑菌特性。類(lèi)似于苯甲酸，低溶解度抑菌物質(zhì)還有很多，比如姜黃素、大蒜素、白藜蘆醇等[9-11]。本試驗(yàn)以苯甲酸為主要研究對(duì)象，研究一種基于全價(jià)飼料、具有直觀、高靈敏、操作簡(jiǎn)潔的評(píng)估方法，以促進(jìn)抑菌劑的科學(xué)合理使用，合理配置資源，降低飼料成本。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

氯化鈉購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；苯甲酸（含量98%）購(gòu)于Sigma；青霉素鈉（160萬(wàn)單位）購(gòu)于商丘市成達(dá)動(dòng)物藥品廠；胰蛋白大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基、溶菌肉湯（LB）瓊脂培養(yǎng)基均購(gòu)于北京陸橋技術(shù)股份有限公司；保育料、雞全價(jià)料、乳豬教槽料均由帝斯曼（中國(guó)）動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研發(fā)有限公司生產(chǎn)（不含有抗生素和苯甲酸）；大腸桿菌K88+（CVCC198）購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

ZQWY-200 臥式全溫振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）；GI54DWS高壓蒸汽滅菌鍋[致微（廈門(mén)）儀器有限公司]、GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、BSC-1300 Ⅱ A2 生物安全柜（蘇凈安泰）、Mf3菌落統(tǒng)計(jì)/顯微細(xì)胞儀（杭州迅數(shù)科技有限公司）、OLS200振蕩水浴鍋（格蘭特）、MS3002S型電子天平[梅特勒托利多科技（中國(guó)）有限公司]、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)[尤尼柯（上海）儀器有限公司]。

1.2 制備飼料培養(yǎng)基

將飼料粉碎后，過(guò)0.25 mm篩，取10 g加入90 mL超純水10倍稀釋飼料，再添加不同類(lèi)型抑菌劑（可耐高溫），充分混勻，然后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌（115 ℃、20 min），當(dāng)添加不耐高溫的抑菌劑時(shí)，如抗生素，要在飼料稀釋液滅菌后冷卻至50 ℃以下時(shí)再添加，制備飼料培養(yǎng)基。

1.3 菌液制備及接種

將大腸桿菌K88+單菌落用胰蛋白大豆肉湯（TSB）液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)3 h左右，取2 mL 加到比色皿中測(cè)定 OD值，OD600為0.5～1.0時(shí)，取100 μL菌液加入到飼料培養(yǎng)基中，接種后，飼料培養(yǎng)基中大腸桿菌的含量約為105CFU/mL。

1.4 不同時(shí)間點(diǎn)取樣及培養(yǎng)

如圖1所示，分別于接種前、接種后0 h和16 h取樣。取100 μL 飼料培養(yǎng)基，加入到900 μL 生理鹽水中，混勻備用。每一個(gè)處理組，分別取10、20 μL 和30 μL 混懸液滴加到LB 瓊脂培養(yǎng)基中。37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，用菌落計(jì)數(shù)儀進(jìn)行觀察并拍照。根據(jù)LB培養(yǎng)基上液滴處菌落生長(zhǎng)狀況評(píng)估抑菌劑的抑菌效果，與不含抑菌劑的對(duì)照組相比，菌落數(shù)減少即有抑菌作用，菌落數(shù)越少抑菌作用越強(qiáng)。

圖1 檢測(cè)流程

1.5 不同類(lèi)型飼料培養(yǎng)基組成

在保育料、雞全價(jià)料、教槽料飼料稀釋液中分別添加0、0.03%、0.30%的苯甲酸（具體組成見(jiàn)表1），接種大腸桿菌培養(yǎng)后，觀察大腸桿菌在不同類(lèi)型飼料培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)差別。

表1 不同飼料培養(yǎng)基組成

1.6 保育料中添加苯甲酸和青霉素鈉的抑菌效果對(duì)比

在保育料培養(yǎng)基中添加不同濃度的苯甲酸或青霉素鈉（具體組成見(jiàn)表2），接種大腸桿菌培養(yǎng)后，通過(guò)與無(wú)抑菌劑空白組對(duì)比，觀察不同濃度的抑菌劑的抑菌效果。

表2 不同含量苯甲酸和青霉素鈉在保育料中飼料培養(yǎng)基組成

2 結(jié)果與討論

2.1 方法的優(yōu)勢(shì)

如圖1 所示，本試驗(yàn)檢測(cè)周期為3d，操作步驟簡(jiǎn)單，不需要大型儀器，成本較低。本方法將培養(yǎng)皿分為三個(gè)區(qū)域，每一個(gè)區(qū)域內(nèi)為一個(gè)處理組，在每個(gè)區(qū)域內(nèi)滴入含不同體積（10、20 μL 和30 μL） 稀釋液，形成小、中和大三個(gè)圓點(diǎn)，如圖2 所示，從而可以在同一培養(yǎng)皿上觀察不同抑菌劑的生長(zhǎng)情況。

使用菌落法考察不同苯甲酸抑菌能力的大小時(shí)，將培養(yǎng)好的抑菌后菌懸液進(jìn)行不同濃度梯度的稀釋?zhuān)恳粋€(gè)稀釋度需要多個(gè)獨(dú)立的培養(yǎng)皿作為平行[12]。相比而言，本方法減少了稀釋梯度，節(jié)省了培養(yǎng)皿的使用量，減少涂布和計(jì)數(shù)時(shí)間，本方法可批量操作。使用肉湯稀釋法時(shí)，加入抑菌劑培養(yǎng)24 h后，觀察試管或96孔板底部，渾濁帶有沉淀說(shuō)明有細(xì)菌生長(zhǎng)，澄清透明說(shuō)明相應(yīng)藥物濃度有抑菌作用[13-14]。陳聰[15]和張昊雪[4]分別通過(guò)指示劑刃天青和TTC(2,3,5-三苯基氯化四氮唑)顏色的變化來(lái)表示細(xì)菌的生長(zhǎng)，但是均無(wú)法直接對(duì)比澄清透明或無(wú)顏色變化的管（孔）之間細(xì)菌含量差異。如圖3所示，本方法中處理組B2、C2、E2和F2在接種后培養(yǎng)16 h均比初始接種時(shí)的菌落數(shù)減少，說(shuō)明在此濃度下均有抑菌作用，同時(shí)可根據(jù)菌落數(shù)的多少對(duì)比不同抑菌劑在此濃度下的抑菌性能差異。

圖3 保育料中添加苯甲酸和青霉素鈉的抑菌效果

抑菌培養(yǎng)24 h 后，古麗巴哈爾·托乎提[16]用一次性無(wú)菌接種環(huán)從試管取出1 環(huán)液體劃線(xiàn)平板，唐亮[17]分別取各孔培養(yǎng)物20 μL，點(diǎn)種于培養(yǎng)基上，徐欣欣[14]從無(wú)細(xì)菌沉淀產(chǎn)生的孔中吸取10 μL 內(nèi)容物滴至培養(yǎng)基，以是否生長(zhǎng)菌落來(lái)判定抗菌物質(zhì)的最小殺菌濃度（MBC）。類(lèi)似地，本方法分別于接種前、接種后0 h和接種后16 h，取稀釋液10、20 μL和30 μL滴加到培養(yǎng)基上，不僅能根據(jù)無(wú)菌落生長(zhǎng)判定殺菌濃度，同時(shí)可縱向?qū)Ρ韧灰志鷦╇S時(shí)間菌落數(shù)的變化，判定抑菌劑在此濃度下的抑菌性能，橫向?qū)Ρ韧灰志鷷r(shí)間下不同抑菌劑的抑菌效果。

苯甲酸溶解度較低，使用擴(kuò)散法測(cè)定，牛津杯內(nèi)或?yàn)V紙上會(huì)以晶體的形式析出，不能準(zhǔn)確評(píng)估其抑菌效果。本方法有效避免擴(kuò)散法對(duì)難溶物質(zhì)測(cè)定的局限性。此外，本方法直接觀察菌落數(shù)量，從而克服了使用比濁法受顏色干擾的問(wèn)題[18]，為姜黃素等抑菌效果評(píng)估提供了方法。

2.2 不同全價(jià)飼料對(duì)抑菌效果的影響

本試驗(yàn)利用飼料培養(yǎng)基更接近實(shí)際，更能體現(xiàn)抑菌劑在生產(chǎn)中的實(shí)際效果。本試驗(yàn)所用的全價(jià)料均未添加苯甲酸和任何抗生素。由于苯甲酸在飼料中的添加量為3～5 kg/t[19]，所使用的培養(yǎng)基中選擇苯甲酸添加濃度為0.30%。

如圖2 所示，分別以保育料、雞全價(jià)料和教槽料為培養(yǎng)基，在接種前，保育料、雞全價(jià)料和教槽料中均沒(méi)有菌落形成，說(shuō)明該培養(yǎng)基因滅菌處理后為無(wú)菌狀態(tài)。接種后0 h，所有處理組飼料均有菌落形成，且溶液邊緣處菌落形成圓環(huán)，處理組間無(wú)差異，說(shuō)明接種量一致。接種后16 h，保育料組和雞全價(jià)料組在相同處理?xiàng)l件下，培養(yǎng)皿上菌落數(shù)及生長(zhǎng)形態(tài)大體一致，且A1、D1 組菌落數(shù)明顯多于接種后0 h，說(shuō)明大腸桿菌在飼料液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好；在相同苯甲酸濃度下，而教槽料組的菌落數(shù)明顯少于保育料組和雞全價(jià)料組，說(shuō)明教槽料中本身存在其他因素直接或者間接抑制了大腸桿菌的生長(zhǎng)。

張博[20]表明酸化劑在家禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用效果受基礎(chǔ)日糧類(lèi)型和日糧組成的影響。本試驗(yàn)中不同類(lèi)型全價(jià)飼料添加同一濃度的苯甲酸，菌落數(shù)有差異，苯甲酸添加量為0和0.03%時(shí)，教槽料組中菌落數(shù)少于保育料組和雞全價(jià)料組，苯甲酸添加量為0.30%時(shí)，教槽料組和保育料組的菌落數(shù)少于雞全價(jià)料組，說(shuō)明不同類(lèi)型全價(jià)料對(duì)抑菌劑的抑菌效果存在影響，可根據(jù)不同類(lèi)型全價(jià)飼料合理選擇抑菌劑的添加量以節(jié)省成本。

2.3 保育料中添加苯甲酸和青霉素鈉的抑菌效果

由圖3可知，以保育料為培養(yǎng)基時(shí)，接種前所有處理組均沒(méi)有菌落形成。接種后0 h所有處理組均有菌落形成，且溶液邊緣處菌落形成圓環(huán)，處理組間無(wú)差異。接種后16 h，苯甲酸組中，C2組菌落數(shù)（苯甲酸0.1%）少于B2組（苯甲酸0.08%），二者均少于A2組（對(duì)照）；青霉素組中，F(xiàn)2組（青霉素鈉0.003%）菌落數(shù)少于E2組（青霉素鈉0.003 5%），二者均少于A2組（對(duì)照），D2組（青霉素鈉0.002 5%）菌落生長(zhǎng)情況與A2 組（對(duì)照）一致。B2組（苯甲酸0.08%）與E2組（青霉素鈉0.003%）菌落數(shù)相似、C2組（苯甲酸0.1%）與F2組（青霉素鈉0.003 5%）菌落數(shù)相似，說(shuō)明在苯甲酸和青霉素鈉在保育料中抑菌效果：C2組=F2組＞B2組=E2組＞D2組。苯甲酸和青霉素鈉濃度分別增加時(shí)，菌落數(shù)隨之減少，當(dāng)苯甲酸和青霉素鈉濃度分別變化0.02%和0.000 5%時(shí)，抑菌16 h后菌落數(shù)有明顯的差異，說(shuō)明本方法較靈敏。

酸化劑作用并不是劑量依賴(lài)性[20]，所以選擇酸化劑的最適添加量很關(guān)鍵。同時(shí)，在使用每種酸化劑之前，需要具體考慮其抑制作用及效果[21]。由于本方法抑菌劑添加量在相對(duì)窄的范圍，也能評(píng)估其抑菌效果的差別，在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)需要評(píng)估抑菌產(chǎn)品的最適添加量，以節(jié)約成本。如圖3所示，當(dāng)抑菌16 h時(shí)，試驗(yàn)組的菌落數(shù)少于對(duì)照組A2，即有抑菌效果，根據(jù)試驗(yàn)組菌落數(shù)的疏密即可對(duì)比抑菌劑的抑菌效果強(qiáng)弱。

3 結(jié)論

本研究利用全價(jià)料做細(xì)菌培養(yǎng)基、構(gòu)建肉眼可見(jiàn)的微量接種矩陣，建立了一種簡(jiǎn)潔、快速、靈敏度高的體外評(píng)估方法，可評(píng)估不同類(lèi)型抑菌劑在不同類(lèi)型飼料中的最適添加量。運(yùn)用此方法試驗(yàn)得出：同一濃度苯甲酸以教槽料為培養(yǎng)基時(shí)，對(duì)大腸桿菌K88+的抑菌效果優(yōu)于保育料和雞全價(jià)料；在保育料中添加0.08%苯甲酸，可明顯觀察到對(duì)大腸桿菌K88+有抑制作用。