■ 周雷進雨 馬精陽 袁月明 李錦生 馮偉志 周麗娜

（吉林農(nóng)業(yè)大學工程技術學院，吉林長春 130118）

干酪乳桿菌作為一種重要的乳酸菌，已被廣泛應用于食品、醫(yī)療、微生物制劑和畜牧業(yè)等領域[1-2]。真空冷凍干燥是目前制備高品質(zhì)乳酸菌制劑的重要方法之一，與傳統(tǒng)干燥技術相比，具有便于運輸、貯藏期長等特點[3]。但在凍干過程中，由于多種因素的變化，會導致細胞活力下降，甚至會造成菌體的死亡[4]。在凍干前添加保護劑，可以減少凍干過程中所帶來的損害，使其盡可能保持原有的理化性質(zhì)和生物活性[5-9]。

干酪乳桿菌能夠促進免疫反應，有利于宿主健康，研究表明，將干酪乳桿菌應用到養(yǎng)殖業(yè)中，能夠有效地改善動物的健康以及生長性能，這對綠色生態(tài)養(yǎng)殖具有重要的意義[10-11]。復合凍干保護劑能夠有效地提高菌種在運輸過程中的存活率，因此，在實際生產(chǎn)中具有較好的應用前景。

為了提高凍干后菌種的存活率，本研究通過采用單因素試驗設計篩選出各種類別凍干保護劑中對菌種存活率有顯著影響的材料，進一步通過響應面法對篩選出的保護劑材料進行復配優(yōu)化，并以菌株的存活率為響應指標，探究一種干酪乳桿菌復合凍干保護劑的制備工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）粉劑由中國科學院微生物研究所提供，由吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院實驗室分離保藏。

1.1.2 試劑

山梨醇、甘露醇、甘油、硫代硫酸鈉，購自浙江一諾生物科技有限公司；蔗糖、明膠、磷酸鈉、谷氨酸，購自遼寧眾發(fā)生物科技有限公司；海藻糖、乳糖，購自山東優(yōu)索化工科技有限公司；維生素E，購自安徽酷爾生物工程有限公司；蛋白胨，購自上海博微生物科技有限公司；山梨醇、甘露醇、甘油、硫代硫酸鈉、蔗糖、明膠、磷酸鈉、谷氨酸、海藻糖、乳糖、維生素E、蛋白胨均為分析純，凈含量均為500 g。

1.1.3 儀器設備

GR85DR 型高壓蒸汽滅菌鍋（北京盛科信德科技有限公司）；超凈工作臺（冠森生物科技有限公司）；Centrifuge5702 型離心機（上海普瑾醫(yī)療科技有限公司）；CryoCubeF570型超低溫冰箱（購自上海蓓米爾生物科技有限公司）；電子天平（上海長耀儀器有限公司）；低溫保存箱（購自青島海爾集團）；LRH-150型恒溫生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

活菌計數(shù)→離心5 min（3 000 r/min）→與凍干保護劑混合（單一、復合）→分裝→預冷凍24 h→超低溫冷凍1 h→冷凍干燥24 h→復水→活菌計數(shù)→菌種保護率[12]。

1.2.2 菌種活化

無菌條件下，取出菌種凍干粉，室溫解凍5 min后，按照2%的接種量接種到MRS 液體培養(yǎng)基中，并將其搖勻。在37 ℃恒溫條件下經(jīng)過48 h 培養(yǎng)后得到一代菌，再經(jīng)過48 h 培養(yǎng)后，得到二代菌，用于試驗[13-14]。

1.2.3 預冷及凍干

將所制備的樣品進行預冷凍24 h，預冷凍環(huán)境為-20 ℃[15]，預冷凍完成后放入-80 ℃環(huán)境中冷凍1 h[16]，最后進行冷凍干燥操作，冷凍干燥環(huán)境條件為真空度3.08 Pa，溫度-85 ℃，冷凍干燥時間為24 h[17-18]。

1.2.4 單一種類保護劑材料的制備和選擇

采用單因素試驗考察不同類型保護劑對凍干后干酪乳桿菌菌種存活率的影響，控制預冷和凍干的試驗條件不變，以冷凍后菌種存活率為指標，對冷凍保護劑、抗氧化劑、酸堿調(diào)整劑和填充劑進行篩選，篩選出各類保護劑中凍干后菌種存活率最高的材料。將冷凍保護劑（蔗糖、海藻糖、甘油）、抗氧化劑（硫代硫酸鈉、維生素E、蛋白胨）、酸堿調(diào)整劑（磷酸、氨基酸、山梨醇）、填充劑（甘露醇、乳糖、明膠）中的每種材料分別同純化水混合成單一成分保護劑，其中冷凍保護劑和填充劑以10%的濃度進行混合[19]，抗氧化劑和酸堿調(diào)整劑以1%的濃度進行混合[20]，混合完成后與菌體完全接觸并搖勻，進行預冷凍和冷凍干燥。每組材料進行3次重復試驗，最后取平均值。

1.2.5 復合保護劑的響應面法優(yōu)化

如表1 所示，以單因素試驗篩選出來的海藻糖、硫代硫酸鈉、甘露醇、山梨醇為原料，以冷凍后菌種的存活率為指標，使用三水平四因素的響應面試驗來進行復配優(yōu)化，以此來確定復合保護劑的最佳配比。

表1 復合凍干保護劑各因素的水平選擇

1.2.6 活菌計數(shù)

在無菌條件下，將0.1 g 凍干粉溶于0.9 mL 的無菌水中，充分混合后備用，用無菌水將所得的菌懸液進行梯度稀釋，將菌液用涂布棒均勻涂布到固體培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)48 h 后，取出并計數(shù)[21]。冷凍前的菌種數(shù)量為 5.1×109CFU/mL。

1.2.7 菌種存活率

式中：m——冷凍干燥后測得的活菌數(shù)量（CFU/mL）；

m0——冷凍干燥前測得的活菌數(shù)量（CFU/mL）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，利用Design-Expert 13.0 軟件進行響應面試驗設計，并分析試驗結果，P＜0.01 表示差異極顯著，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 單一保護劑的確定

為了提高菌種在凍干過程中的存活率，以A（海藻糖）、B（甘油）、C（蔗糖）這3種材料為冷凍保護劑的試劑分別進行試驗，結果如圖1所示，海藻糖對菌種的保護效果最優(yōu)，顯著高于甘油和蔗糖（P＜0.05），蔗糖對菌種的保護效果最差，測得海藻糖組的菌種存活率為70.6%，甘油組和蔗糖組的菌種存活率分別為54.9%和39.2%。因此，選擇海藻糖作為冷凍保護劑材料。

圖1 冷凍保護劑對菌種存活率的影響

為了提高菌種在凍干過程中的存活率，以A（硫代硫酸鈉）、B（蛋白胨）、C（維生素E）這3 種材料為抗氧化劑的試劑分別進行試驗，結果如圖2 所示，硫代硫酸鈉對菌種的保護效果最好，顯著優(yōu)于維生素E 和蛋白胨（P＜0.05），維生素E 對菌種的保護效果最差，測得硫代硫酸鈉組的菌種存活率為52.9%，蛋白胨組和維生素E 組的菌種存活率分別為31.3%和25.5%。因此，選擇硫代硫酸鈉作為抗氧化劑材料。

圖2 抗氧化劑對菌種存活率的影響

為了提高菌種在凍干過程中的存活率，以A（甘露醇）、B（明膠）、C（乳糖）這3種材料為填充劑的試劑分別進行試驗，結果如圖3 所示，甘露醇對菌種的保護效果最佳，顯著高于乳糖和明膠（P＜0.05），乳糖對菌種的保護效果最差，測得甘露醇組的菌種存活率為45.1%，明膠組和乳糖組的菌種存活率分別為29.4%和11.8%。因此，選擇甘露醇作為填充劑材料。

圖3 填充劑對菌種存活率的影響

為了提高菌種在凍干過程中的存活率，以A（山梨醇）、B（磷酸）、C（谷氨酸）這3種材料為酸堿調(diào)整劑的試劑分別進行試驗，結果如圖4 所示，山梨醇對菌種的保護效果最優(yōu)，顯著高于磷酸和谷氨酸（P＜0.05），谷氨酸對菌種的保護效果最差，測得山梨醇組的菌種存活率為58.8%，磷酸組和谷氨酸組的菌種存活率分別為37.2%和9.8%。因此，選擇山梨醇為酸堿調(diào)整劑材料。

圖4 酸堿調(diào)整劑對菌種存活率的影響

如表3 所示，本研究構建的回歸模型極顯著（P＜0.01），說明模型的可靠度較高，可以利用該模型指導干酪乳桿菌復合凍干保護劑工藝優(yōu)化。通過方差分析可以得出，4 個因素對冷凍后的活菌數(shù)的影響主次順序為：A＞D＞B＞C；即海藻糖＞山梨醇＞硫代硫酸鈉＞甘露醇。通過比較P值，可以得出B、C、AB、AC、AD、BC、BD、CD、D2對冷凍后活菌數(shù)影響不顯著（P＞0.05），同時也說明4個因素之間沒有交互作用；A對冷凍后的活菌數(shù)影響極顯著（P＜0.01）。說明在冷凍干燥過程中，冷凍保護劑對菌種提供的保護效果最明顯。

2.2 復合保護劑的確定

為了進一步探究復合凍干保護劑對干酪乳桿菌菌種存活率的影響，以單因素試驗篩選出的海藻糖、硫代硫酸鈉、甘露醇、山梨醇為供試材料，利用Box-Behnken 模塊進行響應面試驗，探究不同濃度的復合保護劑對菌種存活率的影響，結果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗結果

軟件Design-Expert 13.0所得的擬合回歸方程：

Y=42-6.58×A-1.58×B+1.17×C+5.33×D+0.5×AB-1.5×AC+0.75×AD-2.25×BC+4×BD+0.25×CD-15.5×A2-6.75×B2-6.62×C2+0.625×D2

擬合回歸方程的方差分析見表3。

表3 擬合回歸方程的方差分析

2.3 各因素交互作用的分析

通常情況下，響應面的等高線越接近于橢圓，則說明各因素間的交互作用越明顯；且當響應曲面越陡時，也能說明各因素間的交互作用越強。

由圖5 可知，各因素交互作用的等高線沒有表現(xiàn)為明顯的橢圓形，同時響應曲面也呈現(xiàn)為相對平緩，說明各因素間的交互作用并不顯著，同上述的回歸分析結果相一致。

圖5 各因素交互作用的等高線和響應面

2.4 復合保護劑最佳配比的效果驗證

根據(jù)上述模型可以得出復合凍干保護劑的最佳配比為海藻糖15%、甘露醇15%、山梨醇3%、硫代硫酸鈉2%，以菌種存活率為指標，利用該配比與5.1×109CFU/mL 濃度的菌種進行混合試驗。試驗結果如表4所示。

表4 復合保護劑最佳配比的結果驗證

由表4 可知，利用該配比制作的復合保護劑進行試驗，經(jīng)過576 h 的冷凍后，測得的菌種存活率為90%，在冷凍時間為576～672 h，菌種的存活率有所下降，降低了2%，冷凍672 h 后測得的菌種存活率為88%，說明該復合凍干保護劑能夠達到比較理想的保護效果。

3 討論

冷凍干燥是制備乳酸菌制劑的重要環(huán)節(jié)，在凍干前添加保護劑能夠有效保持菌種在凍干過程中的穩(wěn)定性，提高菌種存活率。不同保護劑的保護機制不同，單一保護劑一般不能達到良好效果。本研究在進行復合凍干保護劑復配優(yōu)化時，考慮到干酪乳桿菌在冷凍干燥過程可能受到多種因素影響，因此選擇冷凍保護劑、抗氧化劑、酸堿調(diào)整劑和填充劑進行加強或協(xié)同作用。復合凍干保護劑對菌種具有良好的保護效果，能夠有效的降低干酪乳桿菌在凍干過程中由工藝造成的失活或死亡，從而提高菌種的存活率，且保護效果作用時間較長，能夠有效解決實際生產(chǎn)中長期儲存困難的問題。

本研究所選擇的各類試劑對凍干后干酪乳桿菌均具有一定的保護效果，在冷凍保護劑中海藻糖對菌種的保護作用最佳，且在復配優(yōu)化試驗中，海藻糖對凍干后的菌種存活率影響最顯著。海藻糖屬于非還原性糖，具有特殊的雙糖分子結構，當細胞處于冷凍干燥條件時，其能夠在細胞表面形成保護膜，可以較好地維持細胞膜的穩(wěn)定性，從而能夠減少菌種細胞的死亡，提高菌種的存活率[22-24]。在抗氧化劑中硫代硫酸鈉對菌種的保護作用最佳，硫代硫酸鈉的抗氧化效果是通過自身氧化來提供的，當試管環(huán)境中的氧和凍干品內(nèi)部的氧被消耗掉后，凍干品所接觸到的氧含量也會降低，使得氧化反應也會減少，從而達到抗氧化效果[25]。在填充劑中甘露醇對菌種的保護作用最佳，甘露醇具有難被空氣氧化、易溶于水的特性，在冷凍干燥過程中，甘露醇在慢速凍結時會結晶，從而為活性組分提供支撐結構，不僅能夠保護細胞，還不會與活性組分發(fā)生反應，從而能夠提高菌種的存活率[26-27]。在酸堿調(diào)整劑中山梨醇對菌種的保護作用最佳，山梨醇是多元醇類，其不僅能夠調(diào)節(jié)酸堿度，還能夠為活性組分提供支撐結構，對菌體起到了雙重保護的作用[28]。

利用制備的復合凍干保護劑對干酪乳桿菌進行凍干后的菌種存活率達到了90%，與單一類別保護劑作用效果相比較，復合凍干保護劑的保護效果均優(yōu)于各類單一類別保護劑。說明復合凍干保護劑能夠有效降低細胞流動性，維持細胞膜的穩(wěn)定性和保護細胞內(nèi)代謝酶活性等[29-31]。通過驗證試驗可以得出經(jīng)過672 h 冷凍干燥后，菌種存活率為88%，說明該配比的復合凍干保護劑對干酪乳桿菌具有良好的長期保護效果。

4 結論

本研究通過單因素試驗設計，從12 種材料中篩選出對菌種存活率有顯著影響的海藻糖、硫代硫酸鈉、甘露醇、山梨醇這4 種試劑，這4 種試劑對菌種的保護效果最明顯。在單因素試驗的基礎上，通過復配優(yōu)化試驗對干酪乳桿菌復合凍干保護劑的配比進行優(yōu)化，試驗結果表明，最佳配比組合為A2B2C2D3，即海藻糖15%、甘露醇15%、山梨醇 3%、硫代硫酸鈉2%，在該配比下，冷凍后活菌數(shù)量為4.6×109CFU/mL，菌種存活率為90%。經(jīng)過672 h 的混合試驗驗證，得到的菌種存活率為88%。