楊琳 屈曉群 劉敬 潘紅菊

(臨汾市中心醫(yī)院腎內(nèi)科,山西 臨汾 041000)

糖尿病腎病(DN)為臨床較為常見的一種糖尿病并發(fā)癥,多發(fā)腎小管-間質(zhì)纖維化、腎小球基底膜加厚、系膜增生,可造成終末期腎病,嚴(yán)重威脅患者的機(jī)體健康〔1,2〕。研究顯示〔3,4〕,DN多發(fā)生于病程超過10年的糖尿病患者,患病率為40%～50%。DN與其他類型的腎病存有一定的差異,由于其并發(fā)糖脂代謝失衡,在治療上提高了難度,臨床未發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)治療此病的方案,主要是控制血壓、血糖及抑制蛋白的攝入,以控制病癥的發(fā)展速度〔5,6〕。及時(shí)預(yù)估早期DN且制定出個(gè)性化治療方法以延緩病癥的發(fā)展是改善患者預(yù)后的主要方法。尿微量白蛋白排泄率為臨床評估DN的重要標(biāo)準(zhǔn),但極易受感染等因素的影響,且對腎小球及腎小管的受損狀況難以預(yù)估〔7〕。分泌型卷曲相關(guān)蛋白(SFRP)4可經(jīng)特異性結(jié)合細(xì)胞膜表面的卷曲蛋白的有關(guān)受體對腎纖維化的產(chǎn)生與進(jìn)展進(jìn)行有效介導(dǎo)〔8〕。本文分析SFRP4介導(dǎo)的線粒體自噬在DN腎間質(zhì)纖維化中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 雄性SD大鼠由深圳華瑞模式生物科技有限公司提供,7～8 w周齡,體質(zhì)量200～230 g,平均(215.30±10.05)g,動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(粵)2022-0304;大鼠在清潔環(huán)境下給予自由飲水、正常飲食。本試驗(yàn)均由嚴(yán)格按動(dòng)物實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)予以操作,且取得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2建模與分組 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后開始試驗(yàn),檢測尿蛋白和尿糖定性為陰性,大鼠空腹血糖水平均處于正常范圍(3.2～7.0 mmol/L)。大鼠不禁水禁食3 h,給予其50 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射,連續(xù)注射5 d,1次/d。建模后2 w對大鼠空腹血糖水平進(jìn)行測定,以血糖≥16.7 mol/L且尿糖呈陽性視為建模成功,最終有10只大鼠建模完成。另選10只相同鼠齡的正常大鼠作為對照組,腹腔注入同等劑量STZ溶酶無菌檸檬酸鈉緩沖液,連續(xù)5 d,1次/d。

1.3病理組織學(xué)觀察 取大鼠部分腎組織通過10%甲醛予以固定(48 h),梯度酒精脫水后,使用二甲苯30 min透明。用石蠟包埋、切片(4 μm),切片經(jīng)梯度酒精進(jìn)行脫蠟后通過蘇木素染液染色5 min,流水洗滌1 min,直至切片返藍(lán),經(jīng)伊紅染液染色3 min,流水沖洗掉伊紅染液,梯度酒精脫水,二甲苯予以透明,用中性樹膠施以封閉,光學(xué)顯微鏡下對腎組織的病理變化給予觀察。

1.4腎功能相關(guān)指標(biāo) ①收集24 h尿液,選取雙縮脲比色法檢測24 h尿蛋白(UTP)水平;②通過苦味酸法檢測血肌酐(Scr)水平;③使用速率法測定胱抑素(Cys)C、血尿素氮(BUN)水平;④使用溴甲酚綠法檢測β2微球蛋白(β2-MG)表達(dá)。

1.5線粒體氧化應(yīng)激、細(xì)胞活力及炎癥水平檢測 ①稱取大鼠腎臟組織50～100 mg,除去髓質(zhì),固定于4%多聚甲醛,30 min,選用0.1% Triton X-100進(jìn)行滲透(30 min),且在含Tween-20磷酸鹽緩沖鹽水內(nèi)使用5%牛血清白蛋白予以封閉,將組織細(xì)胞使用75 nmol/L 溶酶體綠色熒光探針進(jìn)行染色(北京伊塔生物科技有限公司,貨號(hào):YT07420),以此對溶酶體進(jìn)行觀察,通過250 nmol/L線粒體紅色熒光探針觀察線粒體。使用高分辨共聚焦顯微鏡(Nikon A1R HD25)對線粒體及溶酶體的共定位進(jìn)行觀察,將組織細(xì)胞和線粒體紅色熒光探針5 μmol/L于37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)10 min,并經(jīng)熒光顯微鏡(上海富萊光學(xué)科技有限公司,型號(hào):ECLIPSE MA100)檢測570 nm發(fā)射波長及520 nm激發(fā)下各組的熒光強(qiáng)度。②細(xì)胞活力檢測:處理組織細(xì)胞后,各孔添加CCK-8溶液(10 μl),將酶標(biāo)板于37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)2 h,使用自動(dòng)酶標(biāo)儀(北京東目儀器有限公司,型號(hào):DJ15-M195407-Q3)檢測460 nm波長處的吸光值。③炎癥水平檢測。收集各組眼球血1 ml,于4 ℃下行離心處理(3 500 r/min離心6 min),分離血清,使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對白細(xì)胞介素(IL)-8、IL-6水平進(jìn)行檢測,首先在檢測卡中標(biāo)記清對照組、模型組,將血清標(biāo)本、稀釋緩沖液及測試卡放置于平臺(tái),維持24～26 ℃室溫,按比例1∶20對標(biāo)準(zhǔn)液予以稀釋,添加標(biāo)準(zhǔn)液100 μl于酶標(biāo)板內(nèi),混合均勻,恒溫放約30 min,洗滌酶標(biāo)板,加入50 μl抗體,放置30 min,滴加40 μl終止劑,用多功能酶標(biāo)儀(廠家:北京東目儀器有限公司,型號(hào):DJ15-M195407-Q3)對待測在酶標(biāo)板波長460 nm處測吸光度值,試劑盒由北京義翹神州科技股份有限公司提供,貨號(hào)為:10098-HNCH1、10398-H08H。

1.6腎間質(zhì)纖維化指標(biāo)水檢測 收集大鼠1 ml眼球血,行離心處理(3 500 r/min離心8 min),提取血清,使用ELISA檢測肝細(xì)胞生長因子(HGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、同型半胱氨酸(Hcy)水平,試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供,貨號(hào)為:F15644、F28310、F20071。其上述檢測步驟均由具有豐富經(jīng)驗(yàn)的?？漆t(yī)師按說明書完成。

1.7免疫組化法檢測β-catenin、SFRP4表達(dá) 60 ℃烤片、2 h后,常規(guī)脫蠟、脫水,3% 過氧化氫密封內(nèi)源性過氧化物、曲拉通破膜、檸檬酸緩沖液通過微波爐煮沸直至抗原改善、磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,一抗(β-catenin,1∶100;SFRP4,1∶100),在4 ℃冰箱中濕盒培養(yǎng)過夜,復(fù)溫0.5 h,PBS洗滌3次,37 ℃培養(yǎng)對應(yīng)的二抗60 min,PBS洗滌3次,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯微鏡下進(jìn)行染色,流水洗滌,蘇木素光鏡下進(jìn)行復(fù)染,清水洗滌,常規(guī)脫水透明,曬干,用中性樹脂進(jìn)行封片后,光鏡下檢測蛋白的水平表達(dá)。內(nèi)參為β-actin。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、配對t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1病理組織學(xué)觀察 如圖1所示,對照組腎小球及腎小管組織的形態(tài)正常。DN模型組腎小球系膜產(chǎn)生顯著增生、腎小球基底膜有所增厚,顯著腎纖維化,腎小球的囊腔縮減,且存在毛細(xì)血管積聚。

2.2兩組腎功能相關(guān)指標(biāo)對比 如表1所示,與對照組比較,DN模型組CysC、Scr、BUN、UTP、β2-MG水平均上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3兩組腎間質(zhì)纖維化指標(biāo)水平對比 如表1所示,與對照組對比,DN模型組Hcy、TGF-β1表達(dá)上升,HGF表達(dá)下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.4各組線粒體氧化應(yīng)激、細(xì)胞活力及炎癥水平對比 如表2所示,與對照組比較,DN模型組相對線粒體ROS、IL-8、IL-6表達(dá)升高,細(xì)胞活力降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.5兩組β-catenin、SFRP4表達(dá)水平對比 如表2、圖2所示,與對照組對比,DN模型組β-catenin、SFRP4表達(dá)升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

圖1 兩組腎組織(HE染色,×400)

表1 兩組腎功能相關(guān)指標(biāo)及腎間質(zhì)纖維化指標(biāo)對比

表2 兩組線粒體氧化應(yīng)激、細(xì)胞活力、β-catenin、SFRP4表達(dá)及炎癥水平對比

圖2 Western印跡檢測兩組β-catenin、SFRP4蛋白表達(dá)

3 討 論

隨著病情的進(jìn)展,DN可引起患者產(chǎn)生終末期腎衰竭,甚至發(fā)生死亡。且因DN患病率高,治療時(shí)間較長且預(yù)后療效較差等特征,給臨床治療帶來了較大的困難〔9～11〕。

由于腎臟中含有較為豐富的線粒體,故而線粒體的正常功能對保證腎功能良好發(fā)揮了較為重要的作用〔12〕。在正常狀況下,機(jī)體會(huì)選擇性的消退被損害及功能失衡的線粒體,從而保證細(xì)胞的平穩(wěn)性,因此,長期受高糖的刺激會(huì)導(dǎo)致線粒體極易受損,使得活性氧提升,線粒體膜電位降低,致使線粒體功能異常,大量功能失衡的線粒體會(huì)在細(xì)胞中聚積,造成細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境失衡,致使細(xì)胞發(fā)生反應(yīng),如纖連蛋白及細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)Ⅳ型膠原蛋白的積聚,從而造成腎纖維化,纖維化為DN的重要病理改變之一〔13,14〕。線粒體自噬可通過消除功能失衡及被損害的線粒體,為線粒體質(zhì)量把控的主要途徑〔15〕。故而提升線粒體自噬可及時(shí)性的除去受損的線粒體以保持細(xì)胞的平衡及線粒體功能異常,進(jìn)而減少細(xì)胞外基質(zhì)的積聚,以改善DN大鼠病癥。線粒體功能異常在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、炎癥水平及細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮著重要的作用,這與DN的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

SFRP為近來新研究發(fā)現(xiàn)的分子量為40 kD的一種可溶性脂肪細(xì)胞因子,可參與調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路,而Wnt信號(hào)通路被證實(shí)可誘導(dǎo)DN的發(fā)生,抑制Wnt信號(hào)通路表達(dá)可作為潛在治療DN的重要靶點(diǎn)〔16,17〕。研究發(fā)現(xiàn)〔18〕,SFRP1參與早期DN的患病過程。研究顯示〔19〕,SFRP5與糖尿病腎病的病癥嚴(yán)重程度的發(fā)展有著緊密聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)〔20〕,SFRP4參與骨代謝、惡性腫瘤、胰島素抵抗、糖尿病等。本文發(fā)現(xiàn),SFRP4通過介導(dǎo)線粒體自噬,可有效減緩DN的進(jìn)展,改善腎功能指標(biāo),抑制腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展,控制血糖,以減輕DN的嚴(yán)重程度,與其他相關(guān)學(xué)者研究較相似〔21～23〕;表明SFRP4下降可有效抑制DN大鼠腎組織中線粒體自噬能力過度,這一病理變化可能與改善線粒體功能異常過程有關(guān)。以后可進(jìn)一步探究SFRP4如何對線粒體自噬進(jìn)行有效調(diào)節(jié),旨在確定SFRP4在DN進(jìn)展中的臨床意義及潛在作用機(jī)制。