羅登旭 蔡大川 李佩波

(1重慶市黔江區(qū)中醫(yī)院內(nèi)二科,重慶 409000;2重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院感染科;3重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心)

急性肝損傷是臨床常見的一種疾病,已嚴重影響患者生活質(zhì)量,研究表明炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等是造成急性肝損傷的重要因素〔1,2〕。電針是一種對機體刺激較小的治療方法,可調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)及保護臟器〔3,4〕。但電針對四氯化碳(CCl4)誘導的急性肝損傷的作用機制尚未完全闡明。烏司他丁是一種蛋白酶抑制劑,并可抑制炎癥因子的生成,還可在急性肺損傷等疾病中發(fā)揮重要作用〔5,6〕。但電針聯(lián)合烏司他丁對CCl4誘導大鼠急性肝損傷的保護作用尚未闡明。Toll樣受體(TLR)4/核因子(NF)-κB信號通路可調(diào)控多種炎性介質(zhì)的釋放從而參與多種炎癥性疾病的發(fā)生及發(fā)展過程〔7,8〕。本研究采用CCl4誘導大鼠急性肝損傷模型,探討電針聯(lián)合烏司他丁對CCl4誘導大鼠急性肝損傷的保護作用及對TLR4/NF-κB信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 健康清潔級雄性SD大鼠,體質(zhì)量195～245 g,購自重慶市中藥研究院實驗動物研究所,動物許可證號:SCXK(渝)2017-0003。烏司他丁購自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司;四氯化碳(CCl4)購自上海億欣生物科技有限公司;谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)檢測試劑盒購自上海復星長征醫(yī)學科學有限公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;白細胞介素(IL)-12、IL-6檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗鼠TLR4、p65、p-p65抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2治療方法 60只大鼠隨機選取12只作為正常組,其余50只進行CCl4灌胃處理造模,每組均灌胃0.2 ml CCl4〔9〕,作為模型組。正常組自由飲水與進食。選取造模成功的大鼠隨機分為模型組、電針組、烏司他丁組、聯(lián)合組,每組各12只。其中電針組:將大鼠固定在木板上,在雙側(cè)足三里穴連接電針儀,頻率1 Hz/s,強度2～4 mA,留針15 min,1次/d,連續(xù)治療14 d。烏司他丁組:大鼠腹腔注射烏司他丁注射液〔50 000 U/(k·d)〕,1次/d,連續(xù)治療14 d。聯(lián)合組:大鼠同時給予電針與烏司他丁治療,連續(xù)治療14 d。

1.3采集樣本 第14天將各組大鼠禁食24 h,在大鼠眼球取血,4 ℃、3 000 r/min離心10 min,-20 ℃冰箱內(nèi)保存離心分離的血清。采用脫頸法處死大鼠,取出肝臟組織,置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。

1.4檢測血清ALT、AST、IL-6、IL-12、腫瘤壞死因子(TNF)-α水平與計算肝指數(shù) 取出凍存血清,應(yīng)用全自動生化分析儀檢測血清ALT、AST的水平,嚴格按照試劑盒說明書進行操作。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清IL-12、IL-6、TNF-α水平。肝指數(shù)(%)=肝臟濕質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量×100%。

1.5檢測肝組織中SOD、MDA水平 取凍存肝組織,加入RIPA裂解液裂解,4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min,吸取上清,SOD水平通過黃嘌呤氧化酶法檢測,MDA水平通過硫代巴比妥酸法檢測。

1.6Western印跡檢測肝組織B細胞淋巴瘤(Bcl)-2相關(guān)X蛋白(Bax)、Bcl-2、TLR4、p-p65、p65蛋白表達 取出凍存肝組織,用RIPA裂解細胞提取蛋白。通過BCA法測濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將蛋白分離,轉(zhuǎn)膜、封閉,添加Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、TLR4(1∶800)、p-p65(1∶800)、p65(1∶800)與內(nèi)參GAPDH(1∶1 000)的一抗稀釋液,4 ℃、24 h,添加二抗稀釋液(1∶2 000),加入增強型化學發(fā)光試劑電化學發(fā)光(ECL)顯色,通過ImageJ軟件計算蛋白表達量。

1.7統(tǒng)計學處理 采用SPSS26.0軟件進行t檢驗、方差分析,應(yīng)用LSD-t檢驗組間兩兩差異。

2 結(jié) 果

2.1各組肝指數(shù)及血清ALT、AST水平 與正常組比較,模型組肝指數(shù)顯著降低,血清ALT、AST水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,電針組、烏司他丁組、聯(lián)合組肝指數(shù)顯著升高,血清ALT、AST水平顯著降低(均P<0.05),且聯(lián)合組血清ALT、AST水平顯著低于電針組、烏司他丁組(P<0.05),見表1。

2.2各組肝組織SOD、MDA水平 與正常組比較,模型組SOD水平顯著降低,MDA水平顯著升高(均P<0.05);與模型組比較,電針組、烏司他丁組、聯(lián)合組SOD水平顯著升高,MDA水平顯著降低(均P<0.05),聯(lián)合組SOD水平顯著高于電針組、烏司他丁組(P<0.05),而MDA水平顯著低于電針組、烏司他丁組(P<0.05),見表1。

2.3各組血清中炎癥因子水平 與正常組比較,模型組IL-6、IL-12、TNF-α水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,電針組、烏司他丁組、聯(lián)合組IL-6、IL-12、TNF-α水平顯著降低(P<0.05),且聯(lián)合組IL-6、IL-12、TNF-α水平顯著低于電針組、烏司他丁組(P<0.05),見表1。

2.4各組肝組織中凋亡相關(guān)蛋白 Bax、Bcl-2水平 與正常組比較,模型組Bax顯著升高,Bcl-2顯著降低(均P<0.05);與模型組比較,電針組、烏司他丁組、聯(lián)合組Bax顯著降低,Bcl-2顯著升高(均P<0.05),且聯(lián)合組Bax顯著低于電針組、烏司他丁組,Bcl-2顯著高于電針組、烏司他丁組(均P<0.05),見圖1、表2。

表1 各組肝指數(shù)及血清ALT、AST及肝組織、SOD、MDA、血清炎癥因子水平

圖1 Western印跡檢測各組肝組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達水平

表2 各組肝組織中凋亡相關(guān)蛋白 Bax、Bcl-2表達水平

2.5各組肝組織中TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白 與正常組比較,模型組TLR4、p-p65蛋白水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,電針組、烏司他丁組、聯(lián)合組TLR4、p-p65蛋白水平顯著降低(P<0.05),且聯(lián)合組TLR4、p-p65蛋白水平顯著低于電針組、烏司他丁組(P<0.05),見圖2、表3。

圖2 Western印跡檢測各組肝組織中TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達水平

表3 各組肝組織中凋亡相關(guān)蛋白 Bax、Bcl-2表達水平

3 討 論

CCl4可引起急性肝損傷,其主要是通過誘導炎癥、氧化應(yīng)激及凋亡等從而發(fā)揮作用,ALT屬于肝細胞內(nèi)的氨基轉(zhuǎn)移酶,AST主要存在于心、肝等重要臟器中,研究表明ALT、AST水平升高與肝損傷程度呈正相關(guān)〔10〕。本研究結(jié)果提示,電針與烏司他丁聯(lián)合治療可有效降低ALT、AST的水平及改善大鼠肝指數(shù)從而對肝組織發(fā)揮保護作用。

電針可有效促進血液循環(huán)及改善機體新陳代謝,還可調(diào)整機體臟器內(nèi)酶系、電解質(zhì)等從而減輕肝臟等臟器損傷〔11〕。烏司他丁可抑制多種蛋白酶及清除氧自由基、炎癥因子的釋放,并可抑制相關(guān)信號通路的活化從而減輕肺組織損傷〔12〕。SOD、MDA屬于氧化應(yīng)激重要指標,并可作為評估肝氧化損傷的重要指標,其中MDA屬于脂質(zhì)過氧化物,并可加重肝臟脂質(zhì)過氧化損傷,SOD屬于抗氧化酶類,并可清除氧自由基〔13〕。本研究結(jié)果提示,電針與烏司他丁聯(lián)合治療可提高SOD水平及降低MDA水平而抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng),并可增強機體抗氧化能力。TNF-α、IL-6、IL-12是常見的促炎因子,可提高炎癥水平進而產(chǎn)生機體損傷〔14,15〕。本研究結(jié)果提示,電針與烏司他丁聯(lián)合治療可顯著抑制炎癥因子的分泌從而減輕CCl4誘導大鼠急性肝組織炎癥損傷。

Bax和Bcl-2是蛋白凋亡相關(guān)蛋白,它們與線粒體途徑調(diào)控細胞凋亡有關(guān)〔16〕。本研究結(jié)果提示,電針與烏司他丁聯(lián)合治療可能通過抑制細胞凋亡從而保護肝組織。TLR4、p-p65、p65是TLR4/NF-κB信號通路的主要蛋白,其激活后可促進炎癥反應(yīng)從而造成肝損傷或肺損傷〔17,18〕。本研究結(jié)果提示,電針與烏司他丁聯(lián)合治療可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路的活化從而減輕CCl4誘導大鼠急性肝損傷。

綜上,電針聯(lián)合烏司他丁可抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及凋亡從而減輕CCl4誘導大鼠急性肝損傷,其機制可能跟抑制TLR4/NF-κB通路有關(guān),可為急性肝損傷的治療提供新方向。