高方茂 張杰榮 熊時(shí)喜 田曉林 林超

(三亞市中醫(yī)院骨一科,海南 三亞 572000)

骨質(zhì)疏松患者主要表現(xiàn)為骨組織低骨量和微結(jié)構(gòu)退化,導(dǎo)致骨骼脆性增加,骨折風(fēng)險(xiǎn)提升,占用了大量醫(yī)療資源〔1,2〕。骨形成和骨吸收失衡是骨質(zhì)疏松的主要病理基礎(chǔ),骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞參與骨缺損的修復(fù)過程〔3〕。深入探究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的調(diào)控機(jī)制,有助于為骨質(zhì)疏松預(yù)防和治療提供新思路。微小RNA(miR)轉(zhuǎn)錄后可通過靶基因的相互作用調(diào)控骨質(zhì)疏松進(jìn)展〔4〕。近年來研究顯示,骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型或患者中miRNAs差異表達(dá)發(fā)揮重要調(diào)控作用,其中miR-141可能通過一些靶基因調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬來影響骨質(zhì)疏松的發(fā)生與發(fā)展〔5〕;但miR-141具體作用的靶基因目前仍未明確,且對(duì)成骨分化和骨形成的影響未見相關(guān)報(bào)道。本研究旨在探討miR-141在老年骨質(zhì)疏松中的表達(dá)特點(diǎn)及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 選取2020年12月至2022年5月三亞市中醫(yī)院收治的老年骨質(zhì)疏松患者80例為骨質(zhì)疏松組。入選標(biāo)準(zhǔn):①年齡≥60歲,診斷符合中國人原發(fā)性骨質(zhì)疏松診斷標(biāo)準(zhǔn)(試行);②理解和溝通能力正常,自愿參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn):合并糖尿病、骨壞死、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等其他器質(zhì)性病變者。其中男33例,女47例;年齡60～75歲,平均(65.08±5.73)歲。另收集骨量正常的志愿者45例為對(duì)照組,男19例,女26例;年齡60～73歲,平均(64.82±6.15)歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究由醫(yī)院醫(yī)學(xué)科研倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者均自愿簽署知情同意書。

1.2材料與主要試劑 成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞購于北京沃卡威生物技術(shù)有限公司。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用完全培養(yǎng)基購于無錫欣潤生物科技有限公司;超純總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒均購于上海索寶生物科技有限公司;脂質(zhì)體2000購于北京博潤萊特科技有限公司;成骨誘導(dǎo)液、茜素紅均購于美國Amresco公司;鼠抗人Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Runx)2單克隆抗體、鼠抗人骨鈣素(OCN)單克隆抗體及相應(yīng)的二抗均購于北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)血清miR-141表達(dá)水平 采集兩組清晨空腹靜脈血,超純總RNA提取試劑盒提取血清總RNA,紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。miR-141和內(nèi)參U6的引物序列由上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)合成,miR-141正向引物:5′-GGCGACTCGTTATTGATCGT-3′,反向:5′-CCCTATAGACTCAGCATTAA-3′。U6正向引物:5′-GTCTAATTTAGTCTTGCGTC-3′,反向:5′-CAATACTACACAGCGCGT T-3′。反應(yīng)體系共20 μl,其中總RNA 2 μl、Oligo(dT)18 1 μl、正向和反向引物各1 μl、dNTP 1 μl、雙蒸餾水14 μl。反應(yīng)設(shè)定條件:94 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,60 ℃復(fù)性30 s,共40個(gè)循環(huán),72 ℃延伸30 s。2-△△Ct計(jì)算miR-141表達(dá)水平。

1.4miR-141靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 使用microRNA.org、miRMap、miRwalk 3個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-141靶基因,采用韋恩分析法篩選出3個(gè)數(shù)據(jù)庫共同預(yù)測(cè)的miR-141靶基因〔4〕。KEGG富集分析miR-141靶基因的信號(hào)通路富集情況,通過基因功能注釋和查閱相關(guān)文獻(xiàn)〔5,6〕推測(cè)靶基因的潛在功能,確定miR-141的下游靶點(diǎn)。

1.5人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 使用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞專用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育,待細(xì)胞生長至90%融合時(shí)進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞接種于24孔板中,分為對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng))、miR-141抑制陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染miR-141 inhibitor control)、miR-141抑制組(轉(zhuǎn)染miR-141 inhibitor)、miR-141激動(dòng)陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染 miR-141 mimics control)、miR-141激動(dòng)組(轉(zhuǎn)染 miR-141 mimics),轉(zhuǎn)染基因的設(shè)計(jì)合成由蘇州吉瑪基因有限公司完成,使用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)入人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

1.6各組蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)、蛋白激酶B(AKT)及AKT下游潛在基因表達(dá)檢測(cè) 轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h,qRT-PCR檢測(cè)各組人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中PTEN、AKT、FOXO1、RAF1、TSC1、糖原合酶激酶3β表達(dá)水平。引物序列由上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)合成,PTEN正向引物:5′-GTCTAATTTAGTCTTGCGTC-3′,反向:5′-CAATACTACAGCG-CGTT-3′;AKT正向引物:5′-CCTACAGTCTTACGG TAAACG-3′,反向:5′-CGAACAGTTAACCTTGGTCAG-3′;FOXO1正向引物:5′-GTCTAATTTAGT-CTTGCGTC-3′,反向:5′-GAAACTTACGACGGGAAGAA-3′;RAF1正向引物:5′-CACTTTAACAATAGGCGAGT-3′,反向:5′-GGTCATTACTGGAGTCTTG-3′;TSC1正向引物:5′-CGGATTACTGAGTCGAT TGAG-3′,反向:5′-ATGGTTGAATTAGCGGAATC-3′;糖原合酶激酶3β正向引物:5′-ATAAATAAACGTCTACCAA-3′,反向:5′-TTCGCGATCTAAGACACGCA-3′;內(nèi)參GAPDH正向引物:5′-AAGTTGACACGTAGCACGTG-3′,反向:5′-GTGAGTCGTTCTCCGACCGC-3′。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同1.3。

1.7成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后茜素紅染色 將對(duì)照組、miR-141抑制組、miR-141激動(dòng)組人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于48孔板中,置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后更換為成骨誘導(dǎo)液,繼續(xù)培養(yǎng)21 d,棄去培養(yǎng)基,洗滌后用4%多聚甲醛固定30 min,0.2%茜素紅染色30 min,顯微鏡下觀察拍照。

1.8Western印跡檢測(cè)Runx2、OCN蛋白表達(dá)水平 取對(duì)照組、miR-141抑制組、miR-141激動(dòng)組成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測(cè)定蛋白濃度,行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電轉(zhuǎn)法將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,室溫下封閉40 min,滴加鼠抗人Runx2單克隆抗體、鼠抗人OCN單克隆抗體,均為1∶500稀釋,鼠抗人GAPDH單克隆抗體;4 ℃孵培育過夜,滴加相應(yīng)的二抗,1∶2 000稀釋,電化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯影,使用ImageJ軟件讀取灰度值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清miR-141表達(dá)水平比較 骨質(zhì)疏松組血清miR-141表達(dá)水平(4.29±0.85)高于骨量正常組(1.51±0.57),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.363,P=0.001)。

2.2miR-141的潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過miRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)出miR-141的潛在靶基因15個(gè),分別為Scn1b、Rap1a、lgf2r、Sgk1、Kcnk2、Dmr1、Sv2a、PTEN、Ppara、Snx27、Cltc、Cast、Stc25a20、Trak2、Btg1;對(duì)這些靶基因進(jìn)行KEGG富集分析顯示,上述靶基因富集中于cAMP通路、GnRH通路等。通過基因功能注釋和查閱相關(guān)文獻(xiàn)推測(cè)PTEN基因可能是miR-141的潛在靶點(diǎn)。

2.3miR-141表達(dá)對(duì)PTEN及AKT/糖原合酶激酶3β通路表達(dá)的影響 對(duì)照組、miR-141抑制陰性對(duì)照組、miR-141激動(dòng)陰性對(duì)照組PTEN、AKT、糖原合酶激酶3β差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);miR-141抑制組PTEN水平明顯低于miR-141抑制陰性對(duì)照組和對(duì)照組,AKT、糖原合酶激酶3β水平明顯高于miR-141激動(dòng)陰性對(duì)照組和對(duì)照組(P<0.01);miR-141激動(dòng)組PTEN水平明顯高于miR-141激動(dòng)陰性對(duì)照組和對(duì)照組,AKT、糖原合酶激酶3β水平明顯低于miR-141激動(dòng)陰性對(duì)照組和對(duì)照組(P<0.01)。見表1。

表1 各組PTEN、AKT及AKT下游潛在基因表達(dá)水平比較

2.4miR-141表達(dá)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響 茜素紅染色結(jié)果顯示,miR-141抑制組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中可見大量紅染的鈣結(jié)節(jié),呈密集分布,與對(duì)照組相比紅染的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增多。miR-141激動(dòng)組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中紅染的鈣結(jié)節(jié)較對(duì)照組明顯減少,且分布稀疏。見圖1。

2.5miR-141對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中成骨標(biāo)志物表達(dá)的影響 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第21天,miR-141抑制組Runx2、OCN蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.01);miR-141激動(dòng)組明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。見表2、圖2。

表2 各組Runx2、OCN蛋白表達(dá)水平比較

圖2 Western印跡檢測(cè)各組Runx2、OCN蛋白表達(dá)

3 討 論

老年人因年齡增長,體內(nèi)鈣離子等多種營養(yǎng)元素?zé)o法滿足身體代謝的需要,會(huì)引發(fā)骨質(zhì)疏松〔6〕。骨質(zhì)疏松能夠增加脆性骨折、活動(dòng)障礙的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)〔7〕;老年骨質(zhì)疏松性骨折患者恢復(fù)慢,康復(fù)周期長,且長期臥床制動(dòng)會(huì)進(jìn)一步加劇骨量丟失,再骨折風(fēng)險(xiǎn)明顯增加,加重了家庭和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)、醫(yī)療負(fù)擔(dān)〔8〕。多種因素和多基因共同影響骨質(zhì)疏松的發(fā)生與發(fā)展,臨床特征主要表現(xiàn)為骨量減少和骨強(qiáng)度降低。破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞功能異常導(dǎo)致的骨重建期間骨形成減少、骨吸收增加會(huì)引發(fā)骨質(zhì)疏松〔9〕。目前臨床主要通過藥物抑制骨吸收或促進(jìn)骨形成來增加骨質(zhì)疏松患者的骨量,但效果不夠理想,且存在價(jià)格高昂、長期用藥有下頜骨壞死等并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)的弊端〔10〕。miRNAs在人體不同病變組織中表達(dá)存在差異且發(fā)揮調(diào)控作用;近年來研究發(fā)現(xiàn),miRNAs轉(zhuǎn)錄后靶向作用于骨形成的相關(guān)基因,參與調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化和骨形成〔11〕。如miR-21通過抑制脂肪細(xì)胞分化,促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,加速雌二醇誘導(dǎo)成骨細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)〔12〕。miR-216a-5p通過調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo),影響成骨細(xì)胞分化〔13〕。

本研究結(jié)果提示,miR-141可能與骨量丟失呈正相關(guān)。但miR-141是否直接參與調(diào)控成骨分化和骨形成目前仍未明確。本研究首先通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)出miR-141潛在的下游靶基因15個(gè),通過分析基因功能和查閱相關(guān)文獻(xiàn)推測(cè)PTEN基因可能是miR-141的潛在靶點(diǎn)。進(jìn)一步研究提示,miR-141對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的調(diào)控是通過影響PTEN/AKT/糖原合酶激酶3β表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。PTEN是AKT信號(hào)通路上的靶目標(biāo)基因,PTEN高表達(dá)會(huì)抑制AKT基因活性,AKT下游基因糖原合酶激酶3β表達(dá)也隨之降低,加速骨質(zhì)疏松病情進(jìn)展。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠自我增殖和更新,是成骨細(xì)胞主要來源。Runx2是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的主要調(diào)控因子〔14〕;研究顯示,將小鼠Runx2基因敲除后,軟骨下成骨和膜內(nèi)成骨被完全抑制,未成熟骨細(xì)胞廣泛分布于骨組織中,無骨組織分化及骨保護(hù)素、骨鈣素表達(dá)〔15〕。激素能夠拮抗ST2小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞中Runx2基因表達(dá),導(dǎo)致其下游蛋白OCN、ALP表達(dá)水平下降〔16〕。

綜上,老年骨質(zhì)疏松患者血清miR-141高表達(dá),miR-141可通過PTEN/AKT/糖原合酶激酶3β信號(hào)通路抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化,下調(diào)miR-141表達(dá)可作為老年骨質(zhì)疏松治療的新策略。