盧靖 張冬梅 唐曉雷 蘭天野 吳子菁 王健

(長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 1中醫(yī)藥研究中心,吉林 長春 130117;2科研辦公室;3腦病科;4長春中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院)

腦出血(ICH)是一系列具有高死亡率、高發(fā)病率和高復(fù)發(fā)率的破壞性腦血管疾病。國醫(yī)大師任繼學教授根據(jù)“離經(jīng)之血便是瘀血”的理論,提出破血化瘀法治療ICH的治療原則〔1〕。前期研究表明,以抵當湯(DDT)為主的破血化瘀治療方案可有效改善ICH患者的臨床癥狀,提高患者的日?；顒幽芰Α?〕,但其作用機制尚未明確。線粒體損傷是ICH誘發(fā)繼發(fā)性腦損傷的關(guān)鍵因素〔3〕。線粒體自噬能夠消除受損的線粒體蛋白或部分線粒體網(wǎng)絡(luò),并通過生物發(fā)生添加蛋白質(zhì)和脂質(zhì)來更新成分,共同導(dǎo)致線粒體周轉(zhuǎn),維持線粒體穩(wěn)態(tài)〔4〕。本研究從線粒體自噬的角度考察DDT對ICH大鼠和氯化鈷(CoCl2)誘導(dǎo)PC12細胞損傷模型的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1動物及藥品 成年雄性SD大鼠(體質(zhì)量250～300 g)購于長春億斯公司。DDT方藥購買于長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,由長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院實驗中心中藥制劑室制備。將中藥浸泡于8倍體積的純水中,大火煮沸轉(zhuǎn)小火煎煮1 h,倒出煎煮液。重復(fù)煎煮3次,并將3次煎煮液混合,離心后取上清應(yīng)用凍干機進行凍干,得到粉末備用。

1.2主要試劑 凋亡試劑盒(556421)購自BD公司;Tunel染色試劑盒(C1088)、線粒體膜電位(MMP)試劑盒(C2006)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(S0087)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒(S0058)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(S0131S)、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(S0051)購于碧云天生物技術(shù)公司;RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購于Gibco公司;Parkin(ab77924)、PTEN誘導(dǎo)激酶(Pink)1(ab186303)、微管相關(guān)蛋白輕鏈(LC)3Ⅱ(ab48394)、P62(ab155686)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)(ab8245)抗體購于Abcam公司。

1.3ICH模型建立及分組 動物的手術(shù)程序和護理均按照長春中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會的指南進行。將ICH造模組用異氟烷麻醉并放置在立體定位框架中。在前囟右側(cè)3 mm和前囟后0.4 mm鉆孔,并通過26號針在5 min內(nèi)在6.5 mm深度處注入50 μl自體血。假手術(shù)(Sham)組操作與ICH造模組一致,但不注入自體血。用骨蠟封住洞口縫合傷口。實驗中保持大鼠體溫為37 ℃,且醒來后可自由進行攝食和飲水。分組:①神經(jīng)功能評分和凋亡實驗中,將大鼠隨機分為Sham組、ICH組、腦血康(NXK組,0.64 mg/100 g,1次/d)、ICH+DDT低劑量(LD組,0.13 g/100 g,1次/d)、ICH+DDT中劑量(MD組,0.26 g/100 g,1次/d)、ICH+DDT高劑量(HD組,0.52 g/100 g,1次/d);②氧化損傷相關(guān)生物酶檢測實驗中,分為Sham組、ICH組、LD組、MD組、HD組;③Western印跡和免疫組化檢測自噬相關(guān)蛋白表達實驗中,分為Sham組、ICH組、LD組、MD組、HD組、線粒體自噬誘導(dǎo)劑CCCP陽性對照(CCCP組,4 mg/kg,1次/d)。

1.4神經(jīng)功能評分 使用Longa神經(jīng)學評分評估各組神經(jīng)損傷嚴重程度:0級,無神經(jīng)功能缺損;1級,左前爪不能完全伸展;2級,向左盤旋;3級,向左墜落;4級,不能自主行走。分數(shù)越高,傷害越嚴重。評分由兩名人員按照雙盲原則進行評估。

1.5PC12細胞培養(yǎng)及分組 PC12細胞系腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株購自ATCC細胞庫。PC12培養(yǎng)基RPMI1640中加入5%胎牛血清、10%馬血清1%雙抗。在進行實驗前,預(yù)先應(yīng)用50 ng/ml神經(jīng)生長因子(NGF)誘導(dǎo)PC12細胞48 h,使其分化為神經(jīng)性細胞。150 μmol/L的CoCl2誘導(dǎo)PC12細胞24 h作為造模條件。分組:①細胞凋亡實驗中將細胞分為空白組、CoCl2組、CoCl2+DDT低劑量組(50 μg/ml)、CoCl2+DDT中劑量組(100 μg/ml)、CoCl2+DDT高劑量組(200 μg/ml)、CoCl2+NXK組(50 μg/ml);②MMP實驗中將細胞分為空白組、CoCl2組、CoCl2+DDT低、中、高劑量組。

1.6膜聯(lián)蛋白Ⅴ異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ)/碘化丙啶(PI)染色 根據(jù)制造商的說明,使用Annexin Ⅴ/PI染色分析細胞凋亡。消化的PC12細胞,1 500 r/min離心5 min收集細胞。去除上清液后,將細胞重懸于50 μl結(jié)合緩沖液,在緩沖液中加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC染料避光孵育15 min,然后加入5 μl PI室溫避光5 min。加入400 μl結(jié)合緩沖液后,使用流式細胞儀分析每10 000個細胞中凋亡細胞的百分比。

1.7MMP檢測 根據(jù)制造商的說明書,通過JC-1 熒光探針測量MMP。細胞在6孔板(1×105個/孔)中培養(yǎng),用不同濃度DDT處理48 h。將細胞用JC-1探針在37 ℃避光染色30 min,并在熒光顯微鏡下觀察分析。

1.8氧化應(yīng)激關(guān)鍵因子檢測 將各組細胞用RIPA緩沖液裂解。根據(jù)制造商的說明,通過試劑盒測定SOD、CAT活性及GSH-Px、MDA含量。

1.9Western印跡檢測 在冰上將細胞或腦組織在RIPA緩沖液裂解30 min,并用二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)測定試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度并在100 ℃下煮沸5 min后制備熱休克蛋白。待測樣品蛋白(50 μg)經(jīng)過12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用5%脫脂牛奶常溫封閉1 h后,4 ℃孵育一抗(Parkin、Pink1、LC3Ⅱ、P62)過夜。在室溫下與抗體同源二抗孵育1 h后,GAPDH用作對照內(nèi)參,使用化學發(fā)光成像系統(tǒng)觀察和分析蛋白質(zhì)條帶。

1.10Tunel染色檢測腦組織神經(jīng)細胞凋亡 應(yīng)用4%多聚甲醛固定腦組織,分別進行石蠟包埋和切片后,根據(jù)試劑盒說明進行Tunel染色。在5個隨機選擇的顯微鏡視野中以放大200倍進行拍照。

1.11免疫組化檢測 取經(jīng)脫蠟-抗體復(fù)原的腦組織切片進行免疫組織化學染色。應(yīng)用5%脫脂奶粉在室溫下孵育20 min封閉,分別加入LC3Ⅱ(1∶100)、P62(1∶100)一抗4 ℃孵育過夜。次日應(yīng)用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后滴加二抗,37 ℃孵育30 min,加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液5 min,蒸餾水清洗后在蘇木素中復(fù)染2 min,脫水后拍照。

1.12統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism6軟件進行非配對t檢驗或one-way ANOVA分析。

2 結(jié) 果

2.1DDT對ICH神經(jīng)功能評分的影響 與Sham組比較,ICH組左側(cè)肢體活動不利,呈明顯的偏癱狀態(tài),且以前肢為重,在行走過程中會表現(xiàn)出逆時針旋轉(zhuǎn)的追尾行為。與ICH組比較,DDT各劑量組和NXK組在給藥第1天和第3天后,行為學癥狀明顯改善,在第7天時癥狀基本消失(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。見表1。

表1 各組不同時間神經(jīng)功能缺損評分比較(分,

2.2DDT對ICH病灶組織氧化損傷的影響 與Sham組比較,ICH組SOD、CAT、GSH-px水平明顯降低,MDA水平明顯升高(P<0.01,P<0.001)。與ICH組比較,LD、MD及HD組SOD、GSH-px水平明顯升高,MDA水平明顯降低(P<0.05,P<0.01);MD及HD組CAT水平明顯升高(P<0.05)。由此證明,DDT對ICH病灶組織的氧化損傷具有保護作用。見表2。

表2 各組腦組織氧化損傷相關(guān)生物酶變化

2.3DDT對ICH病灶組織細胞凋亡的影響 ICH組綠色熒光表達明顯增高,表明ICH組凋亡細胞顯著增加;與ICH組比較,NXK組及LD、MD、HD組綠色熒光表達降低,表明DDT能抑制ICH病灶組織細胞凋亡,并且HD組與NXK組抑制作用相當,說明其對腦組織神經(jīng)細胞凋亡的影響呈濃度正相關(guān)。見圖1。

2.4DDT對COCl2誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡和MMP的影響 流式細胞術(shù)結(jié)果表明,與空白組〔(10.40±0.58)%〕比較,CoCl2組細胞凋亡率〔(30.77±1.22)%〕顯著升高(P<0.001)。與CoCl2組比較,CoCl2+NXK組細胞凋亡率〔(22.52±2.45)%〕顯著降低(P<0.01);CoCl2+DDT不同劑量組細胞凋亡率〔(22.92±2.31)%、(21.50±2.31)%、(17.45±0.85)%〕顯著降低(P<0.01,P<0.001),且呈劑量依賴性。應(yīng)用JC-1熒光探針檢測MMP變化,與空白組比較,CoCl2組綠光顯著增強,紅光顯著降低,說明MMP明顯降低,DDT治療后綠光顯著降低,紅光顯著增強,說明DDT能夠恢復(fù)CoCl2對PC12細胞MMP的損傷作用。由此說明,DDT能夠降低細胞凋亡,并對神經(jīng)細胞線粒體功能具有恢復(fù)作用。見圖2、圖3。

圖1 Tunel染色檢測各組病灶組織細胞凋亡(×200)

圖2 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡

圖3 JC-1探針熒光檢測各組MMP(×200)

2.5DDT對ICH病灶組織線粒體自噬相關(guān)蛋白表達的影響 Western印跡顯示,與Sham組比較,ICH組LC3Ⅱ蛋白表達顯著增加,P62表達顯著下降(P<0.05),這可能是由于線粒體自噬在ICH發(fā)生后機體啟動反應(yīng)以清除受損細胞的一個保護機制作用(P<0.001)。與ICH組比較,LD組顯著增加Pink1和LC3Ⅱ表達;MD組顯著增加LC3Ⅱ表達;HD組顯著增加Parkin、Pink1和LC3Ⅱ表達,顯著抑制P62表達(P<0.05,P<0.01)。與ICH組比較,CCCP能明顯促進線粒體自噬相關(guān)蛋白Pink1、LC3Ⅱ表達,明顯抑制P62表達(P<0.05,P<0.01),發(fā)揮激活線粒體自噬的作用。見圖4、表3。

表3 各組病灶組織自噬相關(guān)蛋白表達比較

1～6:Sham組、ICH組、LD組、MD組、HD組、CCCP組圖4 Western印跡檢測各組病灶組織自噬相關(guān)蛋白表達

2.6免疫組化法檢測DDT對ICH病灶組織LC3Ⅱ和P62蛋白表達的影響 免疫組化結(jié)果表明,DDT能夠促進LC3Ⅱ蛋白表達,抑制P62蛋白表達,其作用趨勢與線粒體自噬激活劑CCCP一致,說明DDT干預(yù)ICH疾病過程與線粒體自噬機制相關(guān)。見圖5。

圖5 免疫組化法檢測各組病灶組織LC3Ⅱ和P62蛋白表達(×200)

3 討 論

破血化瘀法治療ICH的治療策略,即應(yīng)用重劑活血藥使瘀血得以破除,其主要應(yīng)用《傷寒論》中的DDT,并且經(jīng)過反復(fù)臨床實踐,證實本法安全可靠〔1〕。多項臨床研究表明〔2,5〕,破血化瘀法能促進血腫吸收及改善神經(jīng)功能缺損,可降低ICH急性期病死率,提高日常生活能力,降低致殘程度,使破血化瘀法治療ICH方案得到推廣應(yīng)用,這其中應(yīng)用最廣的即為DDT。本實驗發(fā)現(xiàn),DDT能夠明顯抑制細胞凋亡,對MMP具有明顯的恢復(fù)作用,同時還能夠抑制ICH大鼠血腫周圍細胞的氧化酶活性,促進抗氧化酶活性。

線粒體在ICH后的早期腦損傷期間發(fā)揮了關(guān)鍵作用,通過急性腦缺血導(dǎo)致活性氧(ROS)過量產(chǎn)生〔6〕。證據(jù)表明,自噬發(fā)生在ICH誘導(dǎo)的早期腦損傷中〔7〕。本研究證明,神經(jīng)細胞在ICH疾病過程中受到嚴重損傷且神經(jīng)細胞的凋亡與線粒體受損存在緊密聯(lián)系。由于ROS在自噬中起重要作用,受損的線粒體可產(chǎn)生超過抗氧化系統(tǒng)能力的ROS,引起線粒體蛋白、脂質(zhì)和mtDNA的氧化修飾,導(dǎo)致線粒體功能障礙〔8〕。因此,通過檢測幾種維持氧化還原平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶,本實驗結(jié)果說明,ICH后血腫周圍腦組織發(fā)生氧化還原失衡。ROS水平升高會直接激活自噬反應(yīng),在自噬刺激下,LC3-I轉(zhuǎn)化為磷脂酰乙醇胺結(jié)合的LC3Ⅱ形式〔9〕。與本實驗結(jié)果一致,并且利用DDT進行干預(yù)后,能進一步促進LC3Ⅱ表達,證明ICH損傷后神經(jīng)元存在自噬反應(yīng)。

受損和多余的線粒體被選擇性降解以維持線粒體穩(wěn)態(tài)〔10〕。其中研究較多的途徑之一是Pink1/Parkin途徑〔11〕。已知線粒體損傷會引的線粒體膜電位降低,隨后導(dǎo)致Pink1在線粒體外膜上表達,Pink1表達穩(wěn)定時,Pink-Parkin依賴性線粒體自噬反應(yīng)被激活〔12～14〕。Pink1磷酸化激活Parkin,使線粒體蛋白多泛素化,導(dǎo)致其與自噬受體的泛素結(jié)合域結(jié)合并形成自噬體。然后自噬體與溶酶體融合,導(dǎo)致線粒體降解〔15～17〕。本實驗結(jié)果證明,DDT具有促進自噬的作用,且DDT能促進線粒體自噬關(guān)鍵蛋白Parkin和Pink1表達,證明DDT是通過調(diào)控線粒體自噬發(fā)揮保護神經(jīng)細胞的作用。