劉珊 李志賞 邢晶晶 王冬梅

(衡水市人民醫(yī)院血液科,河北 衡水 053000)

真性紅細(xì)胞增多癥(PV)是一組異質(zhì)性、惡性造血干細(xì)胞克隆性疾病,發(fā)病率為每年2.3～2.8/萬人〔1〕。PV特征在于紅系造血干/祖細(xì)胞異?？寺≡鲋?臨床特征主要為血紅蛋白水平升高,疲勞、脾大等,易并發(fā)血栓或出血,骨髓纖維化和急性白血病轉(zhuǎn)化〔2〕。細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子(SOCS)3是促紅細(xì)胞生成素受體(EPOR)和細(xì)胞因子受體相關(guān)Janus 激酶(JAK)2 激酶信號通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子,SOCS3基因功能改變影響細(xì)胞因子受體功能,減弱對JAK/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)信號通路的抑制作用,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展〔3〕?；蚣谆且环N表觀遺傳機制,通過阻止轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合或促進(jìn)甲基結(jié)合蛋白的結(jié)合調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄,抑制或上調(diào)基因表達(dá),現(xiàn)有研究顯示SOCS3甲基化與較低的SOCS3表達(dá)及骨髓增殖性腫瘤(MPN)發(fā)病之間存在關(guān)聯(lián)〔4〕。SOCS3甲基化是否影響羥基脲、干擾素治療PV的效果及預(yù)后尚不清楚。本研究擬檢測PV患者治療前后SOCS3甲基化狀態(tài),分析其與PV羥基脲、干擾素治療反應(yīng)及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇2017年3月至2019年4月衡水市人民醫(yī)院血液科收治的109例老年P(guān)V患者(PV組),年齡63～78歲,平均(73.12±7.35)歲。白細(xì)胞計數(shù)(7～25)×109/L,平均(15.35±6.19)×109/L;血小板計數(shù)(352～504)×109/L,平均(472.35±20.19)×109/L;脾大56例,血栓栓塞63例,JAK2 V617F突變陽性91例。納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)、免疫表型、融合基因、染色體等檢查確診PV,符合2016年世界衛(wèi)生組織髓系腫瘤和急性白血病分類指南中PV的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔5〕;②接受羥基脲聯(lián)合干擾素治療;③卡氏功能狀態(tài)(KPS)評分60分以上;④年齡60周歲以上,知曉本研究并自愿配合,簽署同意書。排除合并其他惡性腫瘤患者。另選擇30例于醫(yī)院門診體檢的健康志愿者為對照組,均經(jīng)體檢中心系統(tǒng)檢查排除血液腫瘤及其他系統(tǒng)性疾病,男19例,女11例,年齡62～72歲,平均(72.98±6.85)歲。兩組性別和年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2臨床治療和療效判斷 所有老年P(guān)V患者住院確診后給予羥基脲片(齊魯制藥有限公司,規(guī)格:500 mg/片)20 mg/(kg·d),分1～2次口服,定期檢測血常規(guī),待血細(xì)胞接近正常時,聯(lián)合應(yīng)用注射用重組人干擾素a-2b(上海萬興生物制藥有限公司,規(guī)格600萬IU)300萬 IU皮下注射,3次/w,根據(jù)患者外周血細(xì)胞計數(shù)調(diào)整干擾素及羥基脲劑量,使外周血三系細(xì)胞水平均穩(wěn)定于大致正?；蜉p度異常范圍內(nèi),連續(xù)治療3個月。治療3個月后進(jìn)行療效評估〔6〕:完全血液學(xué)緩解(CHR),血細(xì)胞比容<45%、白細(xì)胞<10×109/L、血小板≤400×109/L。達(dá)到CHR并且無重度癥狀定義為疾病充分控制,其他為疾病未充分控制。根據(jù)療效將患者分為控制組(48例)和未控制組(61例)。

1.3甲基化特異性實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qMSP)檢測血清SOCS3基因甲基化表達(dá) 所有PV老年患者治療前及對照組體檢當(dāng)日采集靜脈血3 ml,取血清樣本,采用Wizard?SV Genomic DNA Purification Kit組織DNA提取試劑盒(美國Promega生物公司)提取DNA,選取OD260∶OD280 1.8～2.0樣本(0.5 μg),采用MethylCodeTM亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒(美國Invitrogen公司)進(jìn)行DNA硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化,將提取的 DNA 中所有未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,甲基化胞嘧啶不發(fā)生變化。以亞硫酸氫鹽修飾的DNA為模板,采用qMSP進(jìn)行擴(kuò)增,引物序列(上海捷瑞公司合成):SOCS3,上游:5′-CAGCTCCAAGAGCGAGTACCA-3′,下游,5′-AGAAGCCGCTC-TCCTGCAG-3′,GADPH(內(nèi)參):5′-AATGGAAATCCCATCACCATCT-3′,下游:5′-CGCCCCACTTGATT-TTGG-3′。 反應(yīng)體系,5 μl 2×SYBR Green Master Mix、0.25 μl 引物、4 μl雙蒸水(ddH2O)和 0.5 μl DNA。MSP條件:95 ℃ 下初始變性 10 min、95 ℃ 下變性 20 s、59 ℃ 下退火 30 s,72 ℃ 下延伸 30 s,共45個循環(huán)。PCR擴(kuò)增后,LightCycler?480熒光定量PCR儀(德國Roche)檢測甲基化水平,采用甲基化參考的百分比量化甲基化水平,甲基化參考的百分比=2-(Ct 樣本-Ct內(nèi)參) ×100%。

1.4隨訪 老年P(guān)V患者出院后均定期門診復(fù)查,不適隨診,門診復(fù)查內(nèi)容包括血常規(guī)、血生化、凝血四項、骨髓細(xì)胞學(xué)檢查等。由血液科隨訪人員進(jìn)行定期電話隨訪,每個月隨訪一次,隨訪時間截至2021年6月。綜合門診復(fù)查和隨訪結(jié)果統(tǒng)計無骨髓纖維化、白血病轉(zhuǎn)化生存時間,無骨髓纖維化生存時間定義為PV確診至骨髓纖維化發(fā)生、白血病轉(zhuǎn)化或隨訪截止時間。骨髓纖維化、白血病轉(zhuǎn)化參考2016年世界衛(wèi)生組織髓系腫瘤和急性白血病分類指南中標(biāo)準(zhǔn)〔5〕診斷。

2 結(jié) 果

2.1PV組和對照組血清SOCS3基因甲基化表達(dá)差異 PV組血清SOCS3基因甲基化表達(dá)(5.23±1.02)顯著高于對照組(1.35±0.49;t=20.165,P<0.05)。

2.2不同臨床特征PV患者血清SOCS3基因甲基化表達(dá)差異 白細(xì)胞計數(shù)>10×109/L、血小板計數(shù)>450×109/L、血栓栓塞PV患者血清SOCS3基因甲基化表達(dá)顯著高于白細(xì)胞計數(shù)≤10×109/L、血小板計數(shù)≤450×109/L、無血栓栓塞PV患者(P<0.05),性別、脾大、JAK2 V617F突變陽性PV患者血清SOCS3基因甲基化表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

2.3不同治療反應(yīng)性血清SOCS3基因甲基化表達(dá)差異 控制組血清SOCS3基因甲基化表達(dá)(4.49±0.22)顯著低于未控制組(5.81±0.43;t=19.355,P<0.05)。

2.4不同SOCS3基因甲基化表達(dá)PV老年患者無骨髓纖維化生存分析 中位隨訪32(14～51)個月,隨訪期間失訪6例,隨訪期間無死亡及發(fā)生白血病轉(zhuǎn)化病例,10例發(fā)生骨髓纖維化。根據(jù)SOCS3基因高甲基化表達(dá)均值,將PV老年患者分為SOCS3基因高甲基化組(>5.23,53例)、SOCS3基因低甲基化組(≤5.23,50例)。繪制Kaplan-Meier生存曲線,經(jīng)分析顯示SOCS3基因高甲基化組無骨髓纖維化生存率(83.02%)顯著低于SOCS3基因低甲基化組(98.00%,Log-Rankχ2=6.664,P<0.05),見圖1。

表1 不同臨床特征SOCS3基因甲基化表達(dá)差異

2.5影響PV老年患者預(yù)后的Cox回歸分析 以老年P(guān)V患者隨訪期間是否發(fā)生骨髓纖維化為因變量(賦值:1=是,0=否),納入性別(0=女,1=男)、白細(xì)胞計數(shù)、血小板計數(shù)(0=≤450×109/L,1=>450×109/L)、脾大(1=是,0=否)、血栓栓塞、JAK2 V617F突變(1=是,0=否)、SOCS3基因甲基化表達(dá)為自變量。單因素Cox比例風(fēng)險回歸分析結(jié)果白細(xì)胞計數(shù)、血栓栓塞、SOCS3基因甲基化表達(dá)是影響PV患者發(fā)生骨髓纖維化的因素(P<0.01)。多因素Cox比例風(fēng)險回歸分析顯示血栓栓塞、SOCS3基因高甲基化是影響PV患者發(fā)生骨髓纖維化的因素危險因素(P<0.05),見表2。

圖1 不同SOCS3基因甲基化表達(dá)PV患者無骨髓纖維化生存曲線

表2 影響PV患者預(yù)后的單因素及多因素COX回歸分析

3 討 論

羥基脲是高危原發(fā)性血小板增多癥和PV患者的一線治療用藥,通過抑制細(xì)胞核及線粒體DNA復(fù)制,誘導(dǎo)細(xì)胞和線粒體障礙、外周血間充質(zhì)干細(xì)胞衰老,抑制 JAK2V617F陽性人紅白血病細(xì)胞增殖〔7〕。但是羥基脲骨髓抑制作用強,患者耐受性差,停藥后易復(fù)發(fā)。干擾素可直接抑制造血干細(xì)胞增殖、破壞血小板和紅細(xì)胞,減少外周血紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板數(shù)量,降低血栓及出血風(fēng)險〔8〕,羥基脲聯(lián)合干擾素逐漸成為近幾年MPN治療的主流方法之一。PV患者經(jīng)臨床治療后能否達(dá)完全控制對患者生存質(zhì)量和預(yù)后均有一定的影響,部分患者經(jīng)6個月以上的羥基脲聯(lián)合干擾素治療后雖達(dá)到了CHR,但是疾病相關(guān)癥狀仍然存在,這與羥基脲和干擾素對疾病相關(guān)細(xì)胞因子異常作用有限有關(guān)〔9〕。

基因甲基化是一種表觀遺傳機制,通過對DNA直接化學(xué)修飾建立新的甲基化模式,參與DNA 復(fù)制,胚胎發(fā)育,細(xì)胞有絲分裂等過程〔10〕。DNA甲基化還可募集基因調(diào)控相關(guān)蛋白,促使轉(zhuǎn)錄因子與 DNA 結(jié)合調(diào)節(jié)基因表達(dá),在細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、DNA 損傷修復(fù)、遺傳印記、惡性腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮不可替代的作用〔11〕?，F(xiàn)有研究顯示部分基因甲基化與JAK2蛋白第617位的纈氨酸被苯丙氨酸代替(JAK2 V617F)突變MPN細(xì)胞增殖〔12〕有關(guān)。SOCS3是JAK/STAT 信號通路研究最徹底的抑制劑,JAK/STAT信號通路是細(xì)胞因子信號從細(xì)胞表面到細(xì)胞核信號傳遞的主要途徑,廣泛存在于各種組織和細(xì)胞中,參與細(xì)胞存活、增殖、遷移和入侵等多種生物過程,其過度激活與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。SOCS3通過將其 SH2 結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞因子受體或激活的JAK 中的磷酸酪氨酸殘基結(jié)合來抑制JAK激酶的活性及其下游STAT蛋白的磷酸化,阻斷JAK/STAT信號通路的激活,被認(rèn)為是一種重要的腫瘤抑制因子,SOCS3表達(dá)異?；蚬δ苷系K與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)〔13〕。現(xiàn)有研究顯示,SOCS3 甲基化導(dǎo)致 SOCS3 低表達(dá),導(dǎo)致JAK/STAT3信號通路持續(xù)激活和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)增加,影響機體抗腫瘤免疫作用,導(dǎo)致小兒急性淋巴細(xì)胞白血病進(jìn)展〔14〕。在MPN患者中,26.3%的PV、9.5%的原發(fā)性血小板增多癥,20%的原發(fā)性骨髓纖維化病例可檢測到SOCS3基因啟動子高甲基化〔15〕。

本研究說明,SOCS3基因甲基化可能引起PV骨髓三系(紅系、粒系、巨核系)細(xì)胞過度增生,增加血栓栓塞風(fēng)險。JAK2 V617F突變被認(rèn)為是MPN最常見的驅(qū)動因素,約95%的PV老年患者均可檢測到JAK2 V617F基因突變〔16〕。本研究說明,SOCS3基因甲基化對PV患者JAK2 V617F基因突變的影響較小,也可能與本研究招募樣本例數(shù)偏少有關(guān)。F?dermayr等〔17〕通過甲基化特異性 PCR檢測原發(fā)性血小板增多癥患者SOCS3基因甲基化程度,發(fā)現(xiàn)JAK2 野生型和突變患者間SOCS3基因甲基化并無差異性。

本文提示,SOCS3基因甲基化可能影響PV患者羥基脲聯(lián)合干擾素治療效果及預(yù)后。Zhang等〔18〕發(fā)現(xiàn)SOCS3在肝細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào),SOCS3基因甲基化水平上調(diào),SOCS3基因甲基化與肝細(xì)胞癌生存率低下有關(guān)。江傲霜等〔19〕檢測83例急性淋巴細(xì)胞白血病患兒SOCS3基因甲基化水平,發(fā)現(xiàn)初診組及復(fù)發(fā)組患兒SOCS3基因甲基化水平明顯高于完全緩解組,SOCS3甲基化高水平組累積復(fù)發(fā)率明顯高于低表達(dá)水平組。SOCS3啟動子區(qū)CpG島作為轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點,在SOCS3的轉(zhuǎn)錄激活中起著重要作用,SOCS3啟動子區(qū)CpG島異常高甲基化導(dǎo)致SOCS3基因失活和表達(dá)下調(diào),引起JAK/STAT信號通路持續(xù)激活〔20〕,進(jìn)一步促使抗凋亡基因過表達(dá)和腫瘤細(xì)胞增殖,最終導(dǎo)致對抗腫瘤治療反應(yīng)性差和骨髓纖維化轉(zhuǎn)化。

綜上,PV老年患者SOCS3基因甲基化水平增高,SOCS3基因高甲基化與羥基脲聯(lián)合干擾素治療反應(yīng)性差及骨髓纖維化轉(zhuǎn)化有關(guān)。檢測SOCS3基因甲基化有助于評估PV患者治療反應(yīng)性和預(yù)后。本研究局限性在于樣本量偏少,隨訪時間過短,SOCS3基因甲基化與PV老年患者長期生存的關(guān)系尚待進(jìn)一步驗證。