劉順民, 杜丹超, 蒲占湑, 朱莉, 張利平, 呂佳, 黃振東, 陳國慶, 鹿連明

(浙江省農(nóng)業(yè)科學院 浙江省柑橘研究所, 浙江 臺州 318020)

柑橘黃化脈明病是由柑橘黃化脈明病毒(citrus yellow vein clearing virus, CYVCV) 引起的一種柑橘病毒病害, 是α 線性病毒科印度柑橘病毒屬的成員之一, 基因組為正義單鏈RNA 病毒,由7 529 個核苷酸組成, 包含6 個開放閱讀框 (圖1), 編碼6 種分子量大小分別為187.0、25.0、12.0、6.4、34.0 和 23.0 ku 的 蛋 白 質(zhì)[1-2]。CYVCV 能夠危害絕大多數(shù)柑橘種類, 受害植株的葉片卷曲黃化, 葉脈發(fā)黃變成透明化, 以檸檬和酸橙最為敏感[3-7], 葡萄柚、琯溪蜜柚和部分甜橙、寬皮柑橘品種感病后僅春梢嫩葉表現(xiàn)出輕微脈明,枝梢老熟后癥狀消失[8], 枸櫞、墨西哥萊檬、椪柑感病后癥狀不明顯[9]。研究[10]還顯示, CYVCV在不同寄主上引起的癥狀差異與植株中的病毒含量無顯著關(guān)聯(lián)。CYVCV 除了可侵染柑橘屬的大多數(shù)種外, 還可以侵染豇豆、菜豆、辣椒、藜麥等草本植物[4-5,9]。近年來在錦葵、龍葵、野芥、葡萄和田野毛茛上也檢測出了CYVCV[6,11]。前期研究[5]發(fā)現(xiàn),可通過豆蚜和繡線菊蚜在菜豆之間, 以及從檸檬到菜豆間進行傳播; 近期研究[11-12]發(fā)現(xiàn), CYVCV 可通過柑橘粉虱、繡線菊蚜和棉蚜在柑橘品種之間傳播。截至目前未找到該病毒可通過種子傳毒的證據(jù)[13]。

柑橘黃脈病最早于1988 年在巴基斯坦的檸檬和酸橙上被發(fā)現(xiàn)[14-15]。隨后在土耳其和印度也有報道[16-18]。2009 年在中國云南瑞麗[9]的檸檬上發(fā)現(xiàn)后, 已陸續(xù)在四川、重慶、江西、湖南、浙江等多個柑橘主產(chǎn)省區(qū)檢測出[2,7,19-20]。當下國內(nèi)外并無針對CYVCV 的特效藥和抗CYVCV 的柑橘品種,為了強化對該病的檢驗檢疫, 嚴防該病在國內(nèi)柑橘產(chǎn)區(qū)傳播, 迫切需要快速評價田間柑橘CYVCV 侵染情況, 對柑橘安全生產(chǎn)具有重要的指導意義。

現(xiàn)已有一些對CYVCV 的診斷方法, 20 世紀90 年代初, 有學者用檸檬和酸橙來當作CYVCV 的指示植物[14]; 另外在土耳其首次報道錦葵、龍葵、野芥和田毛茛也可作為CYVCV 的指示植物[5];2003 年, Ahlawat 等[16]從感病的菜豆中分離純化CYVCV, 制備了多克隆抗體, 建立了DAS-ELISA檢測 體系; 2012 年, Loconsole 等[1]利用電鏡首次觀察到CYVCV 的病毒粒子, 將純化的CYVCV 粒子注射兔子獲得多克隆血清, 利用Western-blot 區(qū)分了CYVCV 和印度柑橘環(huán)斑病毒 (India citrus ringspot virus, ICRSV), 對CYVCV-Y1 全基因序列測定, 設(shè)計出一對特異性檢測引物, 但靈敏度有待進一 步 優(yōu) 化 提 高。2015 年, 賓 羽 等[21]通 過 對CYVCV 的多克隆一抗及羊抗兔二抗的最佳稀釋度進行優(yōu)化, 建立了CYVCV 的DTBIA 檢測方法, 既保持了ELISA 的靈敏度和特異性, 還簡化了操作,延長了樣品保存時間。同年, 劉宏科等[22]利用CYVCV 的外殼蛋白設(shè)計特異性引物, 建立了簡單、快速、特異性強且靈敏度高的RT-LAMP CYVCV檢測體系。2016 年, 周彥等[23]根據(jù)CYVCV RNA結(jié)合蛋白基因的保守序列設(shè)計2 對特異引物, 建立了巢式RT-PCR 檢測體系, 與常規(guī)RT-PCR 相比,靈敏度提高了100 倍。2017 年, 宋震等[24]選擇CYVCV 比較保守的外殼蛋白基因為靶標設(shè)計引物,建立染料類實時熒光定量PCR 檢測方法, 較RTPCR 提高了100 倍。2021 年, 馬志敏等[25]利用逆轉(zhuǎn)錄重組聚合酶擴增技術(shù) (reverse transcriptionrecombinase polymerase amplification, RT-RPA), 結(jié)合側(cè)向流層析試紙條, 建立了一種快速、裸眼可視的新檢測方法, 該方法靈敏度與RT-PCR 檢測方法相近。目前, 常規(guī)PCR 擴增技術(shù)應(yīng)用于CYVCV 的診斷鑒定是基于對其基因組序列設(shè)計引物而進行的, 不同基因片段設(shè)計出的引物其檢測特異性和靈敏度也各不相同。本文旨在根據(jù)CYVCV 基因組序列設(shè)計篩選特異性引物對, 通過優(yōu)化PCR 條件,建立特異性強、靈敏度高的CYVCV 一步法RTPCR 鑒定診斷技術(shù), 提高檢測效率, 對及時防控該病在柑橘產(chǎn)區(qū)的傳播具有重要的生產(chǎn)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

感染了柑橘黃化脈明病毒的紅美人柑橘材料和無感病的柑橘實生苗均由柑橘研究所保存。田間檢測樣品于2022 年在浙江省內(nèi)各橘園隨機采集。

1.2 一步法RT-PCR 檢測體系的建立

根據(jù)超純總RNA 提取試劑盒 (SIMGEN, 杭州) 操作說明書提取100 mg 的紅美人柑橘葉片總RNA, 并用30 μL DEPC 水溶解, 使用NANODROP ONE 微量分光光度計RNA 讀數(shù)系統(tǒng) (Thermo scientific, 美國) 檢測RNA 濃度為638 ng·μL-1,將D280/D260比值為2.10 的總RNA 作為一步法RTPCR 的模板。

通過NCBI 數(shù)據(jù)庫下載柑橘黃化脈明病毒全基因組 序 列, 分 別 選 取 黃 脈 病 毒TGB1、TGB2、TGB3、CP和 23K基 因 為 靶 標, 使 用 Primer Explorer 5.0 設(shè)計的特異性引物 (表1), 利用SuperRT One Step RT-PCR Kit 試劑盒 (諾唯贊, 中國), 根據(jù)每對引物的Tm 值進行優(yōu)化。

表1 一步法RT-PCR 引物

1.3 RT-PCR 檢測性能測定

1.3.1 引物特異性檢測與篩選

將柑橘黃脈病樹葉片組織提取的總RNA 作為陽性模板, 健康實生苗柑橘葉片組織提取的總RNA 作為陰性對照, 采用諾唯贊公司提供的SuperRT One Step RT-PCR Kit 試劑盒, 反應(yīng)體系為One Step Enzyme Mix (Dye Plus) 25 μL、One Step Enzyme Mix 2.5 μL、Primer Forward (10 μmol·L-1) 2 μL、Primer Reverse (10 μmol·L-1) 2 μL、模板RNA 2 μL、RNase-free Water 加至總體系50 μL。PCR 擴增程序為: 50 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min, 94 ℃裂解變性3 min, 隨后的34 個循環(huán)包括94 ℃變性30 s, 退火溫度30 s, 72 ℃延伸按照0.5 ～1.0 min·kb-1設(shè)置; 72 ℃終延伸 10 min, 4 ℃保存。供試的7 對引物中若上下游引物退火溫度值差別較大,在采用上述PCR 擴增程序時發(fā)現(xiàn)不能有效擴增,采用Touch Down 兩步法PCR, 該方法程序為50 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min, 94 ℃裂解變性3 min, 隨后的10個循環(huán)包括94 ℃變性30 s, 引物1 (退火溫度較低) 30 s, 72 ℃延伸按照0.5 ～1.0 min·kb-1設(shè)置; 緊接著24 個循環(huán)包括94 ℃變性30 s, 引物2(退火溫度較高) 30 s, 72 ℃延伸按照0.5 ～1.0 min·kb-1設(shè)置; 最后72 ℃終延伸10 min, 4 ℃保存。通過上述各引物對及反應(yīng)程序進行PCR 擴增,根據(jù)特異性擴增DNA 條帶的有無進行分析。

1.3.2 引物靈敏度檢測

將濃度為638 ng·μL-1的總RNA 原液按照20、400、8 000、40 000、80 000 和160 000 倍進行稀釋, 分別對上述每對引物進行一步法RT-PCR檢測, 比較各引物的靈敏度。

1.4 一步法RT-PCR 擴增產(chǎn)物的克隆和測序

將一步法RT-PCR 擴增獲得的目的片段經(jīng)過電泳, 用凝膠回收試劑盒 (TaKaRa, 日本) 回收純化后, 將目的片段與pMD19-T 載體 (TaKaRa,日本) 連接, 通過熱轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Mach1-T1 Phage Resistant 菌株 感 受 態(tài) 細 胞。通 過 挑 取 單菌落經(jīng)PCR 篩選后, 送上海生物工程有限公司測序鑒定。

1.5 一步法RT-PCR 檢測體系應(yīng)用

在不同地區(qū)隨機采集柑橘葉片樣品, 用建立的一步法RT-PCR 檢測技術(shù)進行快速檢測, 并評價田間CYVCV 感染情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR 反應(yīng)體系優(yōu)化與引物篩選

利用上述引物和反應(yīng)體系對CYVCV 陽性樣品和陰性樣品進行一步法RT-PCR 擴增, 擴增結(jié)果如圖2 所示, 引物TGB-F/R 擴增目的條帶不明顯,且出現(xiàn)了非特異性擴增條帶。TGB1-F/R、CP-F/R、TGB2-F/R、TGB3-F/R、23K-F/R 和Fn/En 這6 對引物具有較強的特異性。

圖2 CYVCV 各引物RT-PCR 擴增圖

2.2 一步法RT-PCR 檢測引物靈敏度比較

為比較上述7 對引物通過一步法RT-PCR 檢測CYVCV 的靈敏度, 將638 ng·μL-1的總RNA 原液依次 按 照20、400、8 000、40 000、80 000 和160 000 倍進行稀釋, 結(jié)果如圖3 ～9 所示, TGB1-F/R 引物靈敏度最佳, 能夠檢測出CYVCV 的總RNA 最大稀釋倍數(shù)為160 000 倍, 在本次檢測中該引物通過一步法RT-PCR 能從濃度為0.004 ng·μL-1總RNA 中檢測出CYVCV。其次靈敏度較高的引物為23K-F/R 和Fn/Rn, 能檢測出CYVCV 的總RNA 最大稀釋倍數(shù)為80 000 倍。引物TGB2-F/R、CP-F/R、三基因盒TGB-F/R 和TGB3-F/R 在本次試驗中能檢測出的總RNA 最大稀釋倍數(shù)分別為8 000、8 000、8 000 和20 倍, 從試驗結(jié)果可看出TGB3-F/R 引物靈敏度最差, 三基因盒TGB-F/R 引物特異性最差。

圖3 不同核酸稀釋倍數(shù)下TGB1-F/R 引物擴增結(jié)果

圖4 不同核酸稀釋倍數(shù)下TGB2-F/R 引物擴增結(jié)果

圖6 不同核酸稀釋倍數(shù)下三基因盒TGB-F/R 引物擴增結(jié)果

圖7 不同核酸稀釋倍數(shù)下23K-F/R 引物擴增結(jié)果

圖8 不同核酸稀釋倍數(shù)下CP-F/R 引物擴增結(jié)果

圖9 不同核酸稀釋倍數(shù)下Fn/Rn 引物擴增結(jié)果

2.3 一步法RT-PCR 擴增產(chǎn)物的克隆與測序分析

一步法RT-PCR 擴增獲得的DNA 片段經(jīng)電泳后回收, 連接到pMD19-T 載體上后熱轉(zhuǎn)化到Mach1-T1 Phage Resistant 菌株感受態(tài)細胞, 經(jīng)菌落PCR 檢測后將陽性克隆送測序, 測序結(jié)果在NCBI 上進行同源性比對。結(jié)果如表2 顯示, CYVCV 的TGB1 基因特異性片段與重慶分離物 (KP313240.1) 同源性高達99%,TGB2 基因特異性片段與重慶分離物(KX156736.1) 同源性高達99%,TGB3 基因特異性片段與江西分離物 (MF563877.1) 同源性高達99%,CP基因特異性片段與重慶分離物(KP313240.1) 同源性高達99%, 23K基因特異性片段與重慶分離物 (KX156736.1) 同源性高達99%。

表2 CYVCV 各基因片段克隆測序結(jié)果

2.4 一步法RT-PCR 檢測體系應(yīng)用評價

隨機在臺州市、寧波市和麗水市共采集607 個柑橘葉片樣品, 結(jié)合已知陰性參照和陽性參照, 應(yīng)用上述檢測體系進行檢測, 結(jié)果如表3 所示, 共檢出CYVCV 的陽性樣品61 個, 檢出率為10.05%,表明該檢測體系具有較強的穩(wěn)定性和實用性, 可運用于實驗室大規(guī)模樣品檢測。

表3 CYVCV 一步法RT-PCR 檢測結(jié)果

3 結(jié)論與討論

CYVCV 是近些年報道的危害較為嚴重的一種柑橘病毒病害, 主要依靠苗木和嫁接枝條進行遠距離傳播, 為防止該病進一步在浙江省內(nèi)乃至全國范圍內(nèi)大面積擴散傳播, 加強苗木檢疫是關(guān)鍵措施。當前針對CYVCV 檢測手段有很多種, 考慮到田間檢測的快速性、高效性和成本控制等諸多因素, 一步法RT-PCR 檢測由于操作簡便、成本較低和反應(yīng)過程無須開蓋等優(yōu)點是目前較為合適的CYVCV 檢測方法之一。本試驗通過設(shè)計、篩選引物, 建立的CYVCV 一步法RT-PCR 檢測體系具有特異性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好的特點, 可應(yīng)用于實驗室大規(guī)模檢測。但是該方法仍受諸多因素影響, 在反應(yīng)體系中上下游引物退火溫度差別較大, 常規(guī)PCR 程序擴增效果不佳 (結(jié)果未列出), 為獲得最適宜的擴增效果, 可采用Touch Down 兩步法進行擴增,本試驗中所提及的TGB2-F/R 和三基因盒TGB-F/R引物對均采用上述方法進行擴增。目前, 國內(nèi)外對柑橘黃脈病的PCR 檢測技術(shù)大多只停留在實驗室階段, 在提取總RNA 時, 對多糖多酚、蛋白酶抑制劑的處理較為繁瑣, 且在檢測過程中要加入各反應(yīng)試劑, 從而人為導入加樣誤差或污染, 不適用于快速、大規(guī)模檢測應(yīng)用, 本試驗篩選出檢測靈敏度高、特異性強的引物, 結(jié)合總RNA 純化試劑盒及反應(yīng)試劑預(yù)混液試劑盒, 在保證檢測結(jié)果可靠的前提下, 將全部檢測時間壓縮至2.5 h, 這有利于實驗室檢測程序的快速化和高效化。

近幾年由于紅美人等雜柑有著較高的經(jīng)濟效益, 在全國各大柑橘產(chǎn)區(qū)的推廣種植面積越來越大。由于國內(nèi)柑橘苗木培育、販賣、運輸?shù)冗^程缺乏相關(guān)監(jiān)管制度, 以及基層農(nóng)技人員缺乏相應(yīng)的檢測技術(shù), 導致柑橘病毒病未經(jīng)檢測監(jiān)管便流通于市場, 遠距離傳播。因此, 相關(guān)部門應(yīng)注意, 提前制定相應(yīng)的措施, 防止柑橘黃脈病大規(guī)模傳播造成經(jīng)濟損失。