劉順民, 呂佳, 杜丹超, 蒲占湑, 張利平, 朱莉, 黃振東, 陳國慶, 鹿連明

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 浙江省柑橘研究所, 浙江 臺州 318020)

中國是全世界最大的柑橘生產(chǎn)國, 種植面積達(dá)27 701.533 hm2, 產(chǎn)量達(dá)4 365.57 萬t[1]。柑橘產(chǎn)業(yè)是浙江省農(nóng)業(yè)主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一, 柑橘種植品種豐富, 栽培歷史悠久[2]; 近年來, 隨著浙江柑橘產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展壯大的同時, 也面臨著諸多不利發(fā)展因素的制約, 柑橘黃龍病是威脅柑橘產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的首要因素[3]。1956 年柑橘黃龍病首次在廣東潮汕地區(qū)被報道發(fā)生[4], 隨后在亞洲、非洲、大洋洲和美洲陸續(xù)有相關(guān)報道, 截至目前該病已經(jīng)擴(kuò)散蔓延至全世界40 多個國家。

柑橘黃龍病菌是一種僅寄生于韌皮部組織內(nèi)的革蘭氏陰性細(xì)菌, 目前還不能通過人工培養(yǎng)[5]。1995 年由學(xué)者GARNIER 等[6]提議統(tǒng)一命名為柑橘黃龍病, 之后又根據(jù)細(xì)菌學(xué)名的國際命名法將黃龍病菌分為亞洲柑橘黃龍病菌 (CandidatusLiberibacter asiatum )、非 洲 柑 橘 黃 龍 病 菌(CandidatusLiberibacter africanum) 和美洲柑橘黃龍病菌 (CandidatusLiberibacter americanum)[7-12]。研究表明, 柑橘黃龍病菌形態(tài)學(xué)上存在長條形和圓形兩種類型, 兩者致病性無較大差異, 寄主主要是柑橘屬及其蕓香科柑橘亞科近緣屬植物。除柑橘屬植物外, 枳、金柑、黃皮、九里香、澳指檬、木蘋果、酒餅簕等近緣屬植物上均有檢出黃龍病菌的報道[13-14], 并能通過人為接種方式感染長春花、菟絲子、煙草和番茄等非蕓香科植物[15-18]。不同的是, 黃龍病亞洲種和黃龍病美洲種都屬于耐熱型,在27 ～32 ℃發(fā)病癥狀明顯, 其田間傳播有相同且唯一的昆蟲媒介: 柑橘木虱。而黃龍病非洲種屬于熱敏型, 一般在22 ～24 ℃癥狀明顯, 在高于27 ℃時癥狀逐漸消失, 且媒介昆蟲為非洲木虱[19]。在中國, 柑橘黃龍病是毀滅性病害之一, 也是國內(nèi)檢驗(yàn)檢疫性病害之一。在柑橘各個生長期都能感染黃龍病, 感病性難易不均, 發(fā)病后可造成樹冠稀疏,植株矮化。最典型的癥狀為葉片斑駁型黃化, 在秋梢上表現(xiàn)最為明顯, 果實(shí)上表現(xiàn)為畸形變小且轉(zhuǎn)色不均的 “紅鼻子果”, 造成果實(shí)商品率降低, 嚴(yán)重時可導(dǎo)致整棵樹黃化枯死, 帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[20-21]。

20 世紀(jì)80 年代初年首次在浙江溫州平陽縣發(fā)現(xiàn)柑橘黃龍病, 之后調(diào)查發(fā)現(xiàn)柑橘黃龍病零星分布在浙江省溫州市南部地區(qū), 且伴隨有柑橘木虱的發(fā)生[22-23]。全球氣候變暖, 為柑橘木虱向北遷移活動提供了有利的氣候條件, 加上當(dāng)下苗木市場管理混亂和基層檢測能力不足等人為因素, 導(dǎo)致柑橘黃龍病病害分布呈逐漸向北擴(kuò)大的趨勢。在21 世紀(jì)初黃龍病疫情普查中, 研究人員在除了溫州市之外的臺州、麗水兩市也發(fā)現(xiàn)了柑橘黃龍病, 并呈現(xiàn)迅速爆發(fā)的趨勢。其傳播媒介柑橘木虱的活動范圍現(xiàn)已遍布溫州、臺州、麗水、寧波等地[24], 基于當(dāng)下柑橘黃龍疫區(qū)逐漸向北擴(kuò)展和柑橘木虱向北遷移的現(xiàn)狀, 故開展了此次針對浙江省衢州市和金華市兩地區(qū)柑橘黃龍病及柑橘木虱發(fā)生情況調(diào)查, 通過TaqMan 探針法和實(shí)時熒光定量PCR (real-time PCR) 方法對柑橘樣品中的柑橘黃龍病菌進(jìn)行檢測, 以掌握兩地黃龍病發(fā)生情況, 為兩地及周邊地區(qū)針對柑橘黃龍病及柑橘木虱防控提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2022 年9 月采集于金華市地區(qū)下轄的蘭溪市、婺城區(qū)、金東區(qū)、武義縣及永康市境內(nèi)30 個柑橘果園, 通過癥狀識別的方法對柑橘黃龍病進(jìn)行初步調(diào)查, 每個果園內(nèi)采集3 ～5 株表現(xiàn)為疑似黃龍病的柑橘樹, 按每株采集5 ～10 片老熟黃化葉片作為一個樣品, 共計210 個樣品按照來源分類整理。

1.2 試劑與引物

植物基因組DNA 提取試劑盒購自杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司; Real-time PCR 試劑Premix EXTaq(Probe qPCR) 購自寶生物工程 (大連)有限公司 (TaKaRa)。

Real-time PCR 引 物 為 HLBas: 5′-TCGAGC GCGTATGCAATACG-3′ 和 HLBr: 5′-GCGTTATCC CGTAGAAAAAGGTAG-3′, 探 針 為 HLBP: 5′-AGACGGGTGAGTAACGCG-3′ ( 5′ FAM 標(biāo) 記, 3′BHQ-1 標(biāo)記), 16S rDNA 序列下游引物OI2C: 5′-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-3′, 以上引物和探針均由TaKaRa 公司合成。

1.3 樣品DNA 提取

每個樣品稱取0.1 g 葉脈組織剪碎置于2 mL無菌離心管中, 放入5 mm 研磨珠, 隨后將離心管置于-40 ℃冷凍研磨機(jī)內(nèi)研磨成粉末, 研磨頻率80 Hz, 研磨時間為200 s, 中斷10 s, 重復(fù)運(yùn)行3次。使用杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司植物基因組DNA 提取試劑盒進(jìn)行DNA 提取, 具體操作如下: 充分研磨后加入500 μL、65 ℃預(yù)熱的Buffer PL, 充分混勻后置于65 ℃水浴鍋內(nèi)10 min, 期間每隔2 ～3 min 搖晃離心管以幫助DNA 釋放; 加入350 μL Buffer K, 蓋上管蓋, 用力搖晃15 s, 渦旋振蕩30 s。13 000 r·min-1離心5 min; 離心后將上清液倒入核酸純化柱 (核酸純化柱置于2 mL 離心管中) 中, 蓋上管蓋, 12 000 r·min-1離心30 s; 棄2 mL 離心管中的濾液, 將核酸純化柱置于2 mL 離心管中, 在核酸純化柱中加入500 μL Buffer WA (Buffer WA 中已經(jīng)加入無水乙醇), 蓋上管蓋, 12 000 r·min-1離心30 s; 棄2 mL 離心管中的濾液, 將核酸純化柱置于2 mL 離心管中, 在核酸純化柱中加入600 μL Buffer WB (Buffer WB中已經(jīng)加入無水乙醇), 蓋上管蓋, 12 000 r·min-1離心30 s; 棄2 mL 離心管中的濾液, 將核酸純化柱置于2 mL 離心管中, 蓋上管蓋, 14 000 r·min-1離心1 min; 棄2 mL 離心管, 將核酸純化柱置于一個潔凈的1.5 mL 離心管中, 在純化柱中加入100 ～200 μL、65 ℃預(yù)熱的Buffer TE, 蓋上管蓋, 室溫靜置2 min, 12 000 r·min-1離心30 s, 棄純化柱, 洗脫的DNA 可儲存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)時熒光定量PCR 檢測

采用TaqMan 探針法進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR 檢測, 特異性引物為HLBas/HLBr, 探針為HLBP,以黃龍病陽性樣品的DNA 為陽性對照, 柑橘無病毒苗木樣品為陰性對照, 以ddH2O 為空白對照。Real-time PCR 檢測反應(yīng)體系為20 μL, 包含2×Premix ExTaq10 μL, 250 nmol·L-1的上下游引物各1 μL, 150 nmol·L-1探針1 μL, 待測樣品DNA 1 μL, 無菌雙蒸水6 μL; 反應(yīng)在Bio-Rad CFX96 PCR 儀上進(jìn)行, 擴(kuò)增程序如下: 95 ℃預(yù)變性2 min, 95 ℃ 10 s, 58 ℃ 30 s, 40 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后, 根據(jù)實(shí)時熒光定量PCR 所檢測樣品的Ct值, 分析樣品是否感染有柑橘黃龍病菌。

1.5 黃龍病菌的PCR 片段克隆與序列分析

黃龍病菌16S rDNA 序列的特異性引物為HLBas/OI2C, 上 游 引 物 HLBas: 5′-TCGAGCGC GTATGCAATACG-3′, 下游引 物OI2C: 5′-GCCTCG CGACTTCGCAACCCAT-3′, 以 黃 龍 病 陽 性 樣 品DNA 為模板, 用上述引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 獲得的目的片段經(jīng)過電泳, 用凝膠回收試劑盒 (TaKaRa,日本) 回收純化后, 將目的片段與pMD19-T 載體(TaKaRa, 日本) 連接, 通過熱轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Mach1-T1 Phage Resistant 菌株感受態(tài)細(xì)胞。通過挑取單菌落經(jīng)PCR 篩選后, 送上海生物工程有限公司測序分析。

1.6 柑橘黃龍病媒介昆蟲發(fā)生情況調(diào)查

蘭溪市、婺城區(qū)、金東區(qū)、永康市和武義縣是金華市下轄主要柑橘種植區(qū)縣, 調(diào)查這5 個縣市區(qū)內(nèi)柑橘果園柑橘木虱發(fā)生情況并記錄果園的管理水平、柑橘木虱發(fā)生率 (發(fā)生率為有木虱發(fā)生的果園數(shù)除以調(diào)查的總果園數(shù))、成蟲蟲口密度 (成蟲蟲口密度為成蟲個數(shù)除以調(diào)查總株數(shù)) 和有蟲株率 (有蟲株率為有木虱發(fā)生的株數(shù)除以調(diào)查的總株數(shù))。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘黃龍病菌的檢測

本次在金華市5 個縣市區(qū)的16 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)街道共采集210 份樣品, 檢測出13 份樣品攜帶黃龍病菌,黃龍病菌檢出率達(dá)6.2%, 詳情見表1。其中永康市唐先鎮(zhèn)樣品檢出率最高, 達(dá)20.0%, 此外武義縣白洋街道, 婺城區(qū)洋埠鎮(zhèn)、羅埠鎮(zhèn), 永康市花街鎮(zhèn)樣品檢出率均超過10.0%, 以上街道、鄉(xiāng)鎮(zhèn)均屬于柑橘黃龍病發(fā)生較為嚴(yán)重的區(qū)域。

表1 黃龍病菌實(shí)時熒光定量PCR 檢測結(jié)果

2.2 柑橘黃龍病菌測序分析比對

以HLBas、OI2C 為上下游引物, 分別用金華市蘭溪市、婺城區(qū)、武義縣和永康市4 個柑橘黃龍病陽性樣品DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增出1 171 bp 目的條帶, 如圖1 所示。通過對擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收與克隆轉(zhuǎn)化, 挑選出陽性克隆子, 將陽性克隆子送上海生物工程有限公司測序分析, 將所得序列在NCBI 中與基因庫所有序列進(jìn)行比對分析, 經(jīng)BLAST 結(jié)果表明, 所得序列均為亞洲柑橘黃龍病菌, 相似性均在99.5%以上。

圖1 HLBas/OI2C 引物PCR 擴(kuò)增電泳圖

2.3 金華市各縣區(qū)柑橘黃龍病媒介昆蟲發(fā)生情況

從表2 可以看出, 此次調(diào)查金華市下轄的蘭溪市、婺城區(qū)、金東區(qū)、武義縣及永康市均有柑橘木虱的發(fā)生, 從調(diào)查數(shù)據(jù)可得出, 以上幾個縣市柑橘木虱發(fā)生情況不容樂觀, 特別是永康市境內(nèi)柑橘木虱發(fā)生率最高, 達(dá)到83.3%。蘭溪市柑橘木虱發(fā)生密度最大, 柑橘木虱成蟲口密度為21.0 頭·株-1, 有蟲株率為41.9%。

表2 金華市各縣區(qū)柑橘木虱發(fā)生情況

2.4 不同管理水平下柑橘黃龍病媒介昆蟲發(fā)生情況

調(diào)查發(fā)現(xiàn), 在管理果園和半失管 (失管) 果園均有柑橘木虱的發(fā)生分布, 在調(diào)查的30 個果園中, 有7 個果園為半失管 (失管) 狀態(tài), 在半失管 (失管) 果園內(nèi)柑橘木虱發(fā)生各項(xiàng)指標(biāo)均高于管理果園內(nèi)柑橘木虱的發(fā)生情況, 詳見表3。通過SPSS 軟件分析, 柑橘木虱發(fā)生危害情況與果園管理情況呈顯著相關(guān)性, 相關(guān)系數(shù)為0.99。

表3 不同管理情況下柑橘木虱發(fā)生情況

2.5 黃龍病與柑橘木虱發(fā)生的區(qū)域分析

金華市位于浙江省中西部, 為浙江省主要柑橘種植區(qū)之一, 從本次柑橘黃龍病檢測和柑橘木虱發(fā)生分布調(diào)查結(jié)果來看, 金華市下轄的蘭溪市、婺城區(qū)、金東區(qū)、武義縣及永康市均有柑橘木虱的發(fā)生 (圖2)。同時在以上地區(qū)均檢測到柑橘黃龍病的發(fā)生, 說明以上幾個縣市區(qū)為柑橘黃龍病和柑橘木虱發(fā)生重疊區(qū)域。相關(guān)部門應(yīng)該加強(qiáng)與金華市蘭溪市和婺城區(qū)相鄰的周邊地區(qū)柑橘黃龍病和柑橘木虱的監(jiān)測, 防止柑橘黃龍病病情外溢至衢州市境內(nèi)。

3 結(jié)論與討論

柑橘黃龍病是危害柑橘的主要病害之一, 對柑橘產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重性威脅, 該病的傳播媒介昆蟲是柑橘木虱, 柑橘木虱在取食柑橘黃龍病病株后可終生帶毒, 且傳毒效率高[25]。本次研究通過TaqMan 探針法和實(shí)時熒光定量PCR 法檢測金華市柑橘黃龍病發(fā)生情況。從檢測結(jié)果上看, 柑橘黃龍病在金華市蘭溪市、婺城區(qū)、武義縣和永康市均有不同程度發(fā)生, 而在金東區(qū)未檢測到柑橘黃龍病; 從柑橘木虱的發(fā)生調(diào)查中可看出, 柑橘木虱在金華市蘭溪市、婺城區(qū)、金東區(qū)、武義縣、永康市均有不同程度的發(fā)生, 特別是金華市永康市柑橘木虱發(fā)生率達(dá)到83.3%, 且所調(diào)查的縣市區(qū)柑橘木虱發(fā)生率均在50%以上, 屬于柑橘木虱發(fā)生嚴(yán)重區(qū)域。

根據(jù)上述結(jié)果筆者認(rèn)為, 金華市柑橘黃龍病檢出率高可能與以下幾點(diǎn)有關(guān): 首先金華市地處麗水市、臺州市這類柑橘黃龍病疫區(qū)周邊, 加上金華市境內(nèi)柑橘苗木市場混亂無秩序, 導(dǎo)致未經(jīng)過檢驗(yàn)檢疫的柑橘苗木、接穗從疫區(qū)內(nèi)流入, 特別是近幾年由于苗木市場需求大, 大量引進(jìn)雜柑類品種, 這類雜柑帶病嚴(yán)重, 加快了柑橘黃龍病在金華市內(nèi)的傳播速度。其次是大部分種植戶對柑橘黃龍病的認(rèn)識和防范意識不足, 對果園缺乏科學(xué)有效的管理, 在面對柑橘黃龍病侵染的病株時不能進(jìn)行有效判斷和識別, 無法及時挖除病株, 導(dǎo)致黃龍病得以快速傳播。最后是隨著全球氣候變暖, 冬季平均氣溫上升顯著以及金華市內(nèi)柑橘苗木基地不同柑橘品種間放梢時間不同等環(huán)境條件給柑橘木虱提供了生存和繁殖空間, 進(jìn)一步為柑橘木虱大范圍侵染提供了有利條件。從調(diào)查結(jié)果來看, 在金華地區(qū)有柑橘黃龍病發(fā)生的地方幾乎都有柑橘木虱的發(fā)生, 當(dāng)同時滿足毒源、媒介昆蟲這兩個條件時, 就應(yīng)該引起當(dāng)?shù)叵嚓P(guān)部門的重視, 制定相關(guān)的防控措施來遏制柑橘黃龍病的傳播。

鑒于金華市柑橘黃龍病發(fā)生情況不容樂觀, 特別是此次調(diào)查發(fā)現(xiàn), 在緊鄰衢州市的金華市蘭溪市和金華市婺城區(qū)都有柑橘黃龍病和柑橘木虱發(fā)生,容易造成病情外溢, 應(yīng)加大柑橘黃龍病的防控力度, 尤其是對全市各個柑橘主要產(chǎn)區(qū)柑橘黃龍病發(fā)生情況進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測。同時針對柑橘木虱發(fā)生的特點(diǎn), 加強(qiáng)栽培管理, 科學(xué)合理促進(jìn)嫩梢增厚老熟,縮短易受木虱侵害的嫩梢期, 并且集中在發(fā)梢期加強(qiáng)藥劑防治, 完善統(tǒng)防統(tǒng)治的防控體系。在病區(qū)與非病區(qū)種植杉木、玉米等高稈植物, 阻礙風(fēng)的流動性, 從而起到一定阻隔作用, 對木虱會有良好的控制效果, 建立防護(hù)林案例在福建永春地區(qū)防控黃龍病已取得顯著成效。

調(diào)查中還發(fā)現(xiàn), 在失管或半失管的果園內(nèi), 柑橘樹勢弱, 抽梢次數(shù)參差不一, 這類果園內(nèi)柑橘木虱發(fā)生率高于管理果園內(nèi)柑橘木虱發(fā)生率。這說明在有人為干預(yù)管理的情況下, 果園內(nèi)柑橘木虱發(fā)生危害情況得到一定控制, 但無法杜絕果園內(nèi)柑橘木虱的發(fā)生, 出現(xiàn)該情況可能是由于距離半失管或失管果園過近, 或是在防治柑橘木虱的時候沒有進(jìn)行統(tǒng)防統(tǒng)治, 柑橘木虱往返遷飛, 無法真正做到柑橘木虱的防控管理。相關(guān)部門應(yīng)該做好統(tǒng)籌工作, 將一些失管果園進(jìn)行集中處理, 才能更好地清除蟲源, 切斷柑橘黃龍病傳播鏈條。

柑橘黃龍病嚴(yán)重危害柑橘產(chǎn)業(yè), 如何建立長效的柑橘黃龍病防控機(jī)制是當(dāng)下的主要內(nèi)容之一, 除加強(qiáng)規(guī)范柑橘苗木市場和防控柑橘木虱之外, 地方政府、農(nóng)技部門應(yīng)提高重視大力宣傳, 加大資金投入和相關(guān)人才培養(yǎng), 同時轉(zhuǎn)變種植戶的固有種植觀念和管理水平, 樹立 “統(tǒng)防統(tǒng)治” 觀念, 才能將黃龍病防控有效推進(jìn)。