王慧楠，魏曉彤，石雙慧，王夢(mèng)琳，馬思媛，胡宇峰，姜明瑞，張婧秋，王英姿

千金子制霜前后提取物通過(guò)調(diào)控脂筏介導(dǎo)Caco-2細(xì)胞中TLR4信號(hào)通路的作用機(jī)制研究

王慧楠，魏曉彤，石雙慧，王夢(mèng)琳，馬思媛，胡宇峰，姜明瑞，張婧秋，王英姿*

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488

探究千金子制霜前后提取物通過(guò)調(diào)控脂筏介導(dǎo)Caco-2細(xì)胞中Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）信號(hào)通路的作用機(jī)制。將Caco-2細(xì)胞分為千金子生品低、中、高劑量（50、200、800 μg/mL）組及千金子霜品低、中、高劑量（50、200、800 μg/mL）組和對(duì)照組，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Caco-2細(xì)胞膜脂筏豐度；采用激光共聚焦實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Caco-2細(xì)胞中TLR4與脂筏的共定位；利用Western blotting檢測(cè)Caco-2細(xì)胞中TLR4、核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）、p-NF-κB p65和NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3）的蛋白表達(dá)；ELISA檢測(cè)Caco-2細(xì)胞上清液中白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量；Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染后檢測(cè)IL-1β和TNF-α的含量變化。與對(duì)照組比較，千金子生品提取物可以顯著增加Caco-2細(xì)胞膜脂筏的豐度（＜0.01），促進(jìn)TLR4向脂筏的募集（＜0.01），提高TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65和NLRP3的蛋白表達(dá)以及誘導(dǎo)IL-1β和TNF-α的釋放（＜0.05、0.01、0.001）。相同劑量下，與千金子生品提取物相比，千金子霜品提取物對(duì)Caco-2細(xì)胞膜脂筏豐度、TLR4向脂筏募集、TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路傳導(dǎo)和促炎因子分泌的影響均明顯減弱（＜0.05、0.01、0.001）。體外si轉(zhuǎn)染試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染后TNF-α和IL-1β的含量顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）。千金子制霜減毒的作用機(jī)制可能與通過(guò)調(diào)控脂筏豐度干擾TLR4向脂筏募集，最終影響脂筏中包含的TLR4信號(hào)蛋白的傳導(dǎo)有關(guān)。

千金子；制霜減毒；脂筏；Toll樣受體4；Caco-2細(xì)胞；千金子甾醇

千金子為大戟科植物續(xù)隨子L.的干燥成熟種子，具有瀉下逐水、破血消癥之效，可用于水腫、二便不通、痰飲、積滯脹滿(mǎn)、血瘀經(jīng)閉，歷代多采用去油制霜法炮制以降低毒性、緩和瀉下作用[1-2]。脂筏是細(xì)胞膜內(nèi)富含脂質(zhì)以及蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)微結(jié)構(gòu)域，主要由膽固醇、鞘磷脂和脂筏連接信號(hào)蛋白構(gòu)成，在物質(zhì)運(yùn)輸和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演著重要的角色[3-4]。研究表明，膽固醇外流是調(diào)控脂筏的主要途徑，膽固醇從胞內(nèi)流出的變化會(huì)極大地改變脂筏的豐度，影響脂筏中包含的Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）下游的信號(hào)通路傳導(dǎo)[5]。課題組前期研究結(jié)果顯示，千金子制霜后可能通過(guò)肝X受體α（liver X receptor α，LXRα）-腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）途徑調(diào)控人結(jié)直腸腺癌Caco-2細(xì)胞膽固醇外流[6]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，千金子制霜后對(duì)TLR4/核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）/NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3）通路傳導(dǎo)及促炎因子分泌的上調(diào)作用弱于生品[7]，提示千金子制霜減毒的作用機(jī)制可能與通過(guò)LXRα-ABCA1途徑調(diào)節(jié)膽固醇外流，以及干預(yù)TLR4/NF-κB/NLRP3信號(hào)通路有關(guān)，但膽固醇外流調(diào)控的細(xì)胞微區(qū)脂筏是否參與千金子制霜減毒的過(guò)程，以及其與TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路之間的關(guān)聯(lián)性有必要深入研究。因此，鑒于膜脂成分膽固醇、動(dòng)態(tài)微結(jié)構(gòu)域脂筏與TLR4下游信號(hào)通路之間的密切聯(lián)系，本研究擬采用流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光、Western blotting、ELISA、基因沉默等技術(shù)，系統(tǒng)探討千金子制霜前后提取物通過(guò)調(diào)控脂筏豐度對(duì)Caco-2細(xì)胞中TLR4通路傳導(dǎo)的影響差異，以期從分子水平解析千金子制霜減毒的作用機(jī)制，為其臨床安全有效應(yīng)用奠定科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材

千金子飲片（批號(hào)1203070692）購(gòu)自安徽亳州，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為大戟科續(xù)隨子L.的干燥成熟種子；千金子霜由同一批千金子飲片按《中國(guó)藥典》2020年版制霜法（通則0213）制得，經(jīng)測(cè)千金子脂肪油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為48.61%，千金子霜脂肪油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19.21%。

1.2 細(xì)胞

Caco-2細(xì)胞（批號(hào)BNCC350769）購(gòu)自北納生物BNCC。

1.3 藥品與試劑

PBS溶液（批號(hào)C10010500BT）、DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)C11995500BT）、0.25%胰酶-EDTA（批號(hào)25200-056）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；重組霍亂毒素亞基B（CT-B）、AlexaFluor?488偶聯(lián)物（批號(hào)C22841）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（批號(hào)EMC102a）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）試劑盒（批號(hào)EMC001b）購(gòu)自北京欣博盛生物科技有限公司；Lipo8000?轉(zhuǎn)染試劑（批號(hào)C0533FT）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DAPI染色液（批號(hào)r20276-10mL）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；TLR4單抗（批號(hào)66350-1-Ig）、NF-κB p65單抗（批號(hào)66535-1-Ig）購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；p-NF-κB p65抗體（批號(hào)ab76302）、NLRP3單抗（批號(hào)ab263899）、Alexa Fluor?594 IgG抗體（批號(hào)ab150080）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；β-actin單抗（批號(hào)AH11286487）、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（批號(hào)BJ08079044）、TLR4多抗（批號(hào)bs-20379R）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器

Heracell? VIOS 160i型CO2培養(yǎng)箱、Attune NxT型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；SpectraMax i3x型酶標(biāo)儀（美國(guó)MD公司）；Tanon 1600型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；Countstar?RigelS5型智能圖像流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司）；TCS SP8 STED型激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；Direct-Q3型超純水儀（德國(guó)Millipore公司）。

2 方法

2.1 千金子生品與千金子霜品提取物的制備

稱(chēng)取50 g千金子生品，加入300 mL 95%乙醇加熱回流提取3次，每次提取2 h，合并3次提取液，減壓回收乙醇，再用等體積石油醚萃取3次，減壓回收，即得千金子生品提取物；稱(chēng)取50 g千金子霜品，重復(fù)上述操作，即得千金子霜品提取物，4 ℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)稀釋?zhuān)罱K得到生藥質(zhì)量濃度為3.17 g/mL的千金子生品和千金子霜品提取物。經(jīng)HPLC檢測(cè)千金子生品和千金子霜品提取物中千金子甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（3.81±0.03）、（2.03±0.01）mg/g。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Caco-2細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)傳代。根據(jù)課題組前期千金子制霜前后提取物對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率影響的結(jié)果[6]，本研究選擇50、200、800 μg/mL作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Caco-2細(xì)胞膜脂筏豐度

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，設(shè)置千金子生品（50、200、800 μg/mL）組，千金子霜品（50、200、800 μg/mL）組和對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，孵育48 h后，收集細(xì)胞，4 ℃、1000 r/min離心5 min，棄上清，用AlexaFluor?488標(biāo)記的CT-B染色液（1 μg/mL）冰上避光染色10 min，4 ℃、1000 r/min離心4 min，棄上清，加入400 μL PBS分散細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光，對(duì)細(xì)胞膜上的脂筏進(jìn)行定量分析。

2.4 激光共聚焦實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Caco-2細(xì)胞中TLR4與脂筏的共定位

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔接種于共聚焦小皿中，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，設(shè)置千金子生品（800 μg/mL）組、千金子霜品（800 μg/mL）組和對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，孵育48 h后，用AlexaFluor?488標(biāo)記的CT-B染色液（1 μg/mL）冰上避光染色10 min，隨后加入4%多聚甲醛冰上固定15 min，加入5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h；然后滴加TLR4抗體（1∶200），4 ℃孵育過(guò)夜，再滴加Alexa Fluor?594標(biāo)記的二抗（1∶1000），避光孵育1 h后，加入DAPI溶液避光染色5～10 min；隨后滴加少量甘油，使用激光共聚焦顯微鏡拍照獲取圖像，其中AlexaFluor?488標(biāo)記為綠色熒光，Alexa Fluor?594標(biāo)記為紅色熒光，DAPI標(biāo)記為藍(lán)色熒光；使用Image J軟件中的Coloc2插件進(jìn)行TLR4與脂筏的共定位分析。

2.5 Western blotting檢測(cè)Caco-2細(xì)胞中TLR4、NLRP3、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，設(shè)置千金子生品（50、200、800 μg/mL）組，千金子霜品（50、200、800 μg/mL）組和對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，孵育48 h后，吸棄上清，加入細(xì)胞裂解液裂解，收集細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，BCA法進(jìn)行蛋白定量。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，室溫封閉；TBST洗滌后，加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗滌后，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌后，采用凝膠成像系統(tǒng)顯色，使用Image J軟件分析Caco-2細(xì)胞中TLR4、NLRP3、NF-κB p65、p-NF-κB p65的蛋白表達(dá)。

2.6 ELISA檢測(cè)Caco-2細(xì)胞上清液中IL-1β和TNF-α水平

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，設(shè)置千金子生品（50、200、800 μg/mL）組，千金子霜品（50、200、800 μg/mL）組和對(duì)照組，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，孵育48 h后，收集細(xì)胞上清液，4 ℃、3000 r/min離心25 min，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1β和TNF-α水平。

2.7 TLR4轉(zhuǎn)染后檢測(cè)Caco-2細(xì)胞上清液中IL-1β和TNF-α水平

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，實(shí)驗(yàn)所用的siRNA（上游引物5’-CCAAGUAGUCUAGCUUUCUUAdTd-3’，下游引物5’-UAAGAAAGCUAGACUACUUGGAdTd-3’）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后，設(shè)置千金子生品（50、200、800 μg/mL）組，千金子霜品（50、200、800 μg/mL）組和對(duì)照組，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，孵育48 h后，收集細(xì)胞上清液，按照“2.6”項(xiàng)下方法檢測(cè)Caco-2細(xì)胞上清液中IL-1β和TNF-α水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 千金子制霜前后提取物對(duì)Caco-2細(xì)胞膜脂筏豐度的影響

如圖1所示，與對(duì)照組比較，千金子生品與霜品提取物均可顯著提高Caco-2細(xì)胞膜中脂筏豐度（＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性；相同質(zhì)量濃度下，與千金子生品組比較，千金子霜品可顯著減輕對(duì)Caco-2細(xì)胞膜中脂筏豐度的上調(diào)作用（＜0.05、0.01）。

3.2 千金子制霜前后提取物對(duì)Caco-2細(xì)胞中TLR4與脂筏共定位的影響

采用激光共聚焦顯微鏡對(duì)Caco-2細(xì)胞中TLR4與脂筏的共定位進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖2和表1所示，與對(duì)照組比較，千金子生品提取物可使Caco-2細(xì)胞中TLR4與脂筏的共定位顯著增加（＜0.01）；千金子霜品提取物作用于Caco-2細(xì)胞后，TLR4與脂筏的共定位程度略有增加，但與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與千金子生品組相比，千金子霜品組對(duì)Caco-2細(xì)胞中TLR4與脂筏的共定位的影響顯著減輕（＜0.01）。

3.3 千金子制霜前后提取物對(duì)Caco-2細(xì)胞中TLR4、NLRP3、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，與對(duì)照組比較，各劑量的千金子生品提取物能夠顯著提高Caco-2細(xì)胞中TLR4和NLRP3的蛋白表達(dá)（＜0.05、0.001），低、高劑量的千金子生品提取物能夠顯著提高Caco-2細(xì)胞中NF-κB p65的蛋白表達(dá)（＜0.001），中、高劑量的千金子生品提取物能夠顯著提高Caco-2細(xì)胞中p-NF-κB p65/NF-κB p65的蛋白表達(dá)（＜0.001）；相同劑量下，與千金子生品提取物比較，千金子霜品提取物對(duì)Caco-2細(xì)胞中TLR4、NLRP3、NF-κB p65和p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)水平的調(diào)控作用均明顯減輕（＜0.01、0.001）。

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與千金子生品組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001，圖3同

脂筏富集區(qū)表現(xiàn)為綠色熒光，TLR4表現(xiàn)為紅色熒光，細(xì)胞核表現(xiàn)為藍(lán)色熒光

表1 Caco-2細(xì)胞中TLR4與脂筏的共定位系數(shù)(, n = 3)

與對(duì)照組比較：**＜0.01；與千金子生品組比較：##＜0.01

**< 0.01control group;##< 0.01group

3.4 千金子制霜前后提取物對(duì)Caco-2細(xì)胞上清液中IL-1β和TNF-α分泌的影響

如圖4所示，千金子制霜前后提取物干預(yù)Caco-2細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組（NC）比較，千金子生品和霜品各劑量組均可顯著上調(diào)Caco-2細(xì)胞上清液中IL-1β和TNF-α的含量（＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性；相同劑量下，與千金子生品比較，千金子霜品提取物對(duì)上清液中IL-1β和TNF-α含量的上調(diào)作用明顯減弱（＜0.05、0.01）。

3.5 TLR4基因沉默后對(duì)Caco-2細(xì)胞IL-1β和TNF-α分泌的影響

如圖4所示，用siRNA-1772轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞24 h后，給予千金子生品與霜品提取物刺激48 h，與對(duì)照組（-siRNA）比較，千金子生品各劑量組及霜品中、高劑量組均可促進(jìn)Caco-2細(xì)胞分泌TNF-α和IL-1β（＜0.05、0.01、0.001）；相同劑量下，與千金子生品比較，千金子霜品提取物可以顯著減弱對(duì)TNF-α和IL-1β含量的上調(diào)（＜0.05、0.01），這與沉默前千金子制霜前后提取物對(duì)Caco-2細(xì)胞IL-1β和TNF-α含量的影響趨勢(shì)一致。與相同劑量下的未轉(zhuǎn)染組（NC）比較，沉默后，Caco-2細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-1β的含量顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）。

圖3 千金子制霜前后提取物對(duì)Caco-2細(xì)胞中TLR4、NLRP3、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與千金子生品組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與未轉(zhuǎn)染（NC）組比較：△P＜0.05 △△P＜0.01 △△△P＜0.001

4 討論

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，千金子制霜前后提取物可通過(guò)LXRα-ABCA1影響Caco-2細(xì)胞中膽固醇外流[6]。由于膽固醇是脂筏的主要組成成分，其在脂筏的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，脂筏的含量受細(xì)胞膽固醇外流途徑的高度調(diào)節(jié)[8-9]。因此，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步考察千金子制霜前后對(duì)Caco-2細(xì)胞膜脂筏豐度的影響，結(jié)果表明千金子制霜前后提取物均可顯著增加Caco-2細(xì)胞膜脂筏豐度，而制霜后對(duì)Caco-2細(xì)胞膜脂筏含量的上調(diào)作用較生品減弱，說(shuō)明千金子制霜前后可能通過(guò)LXRα-ABCA1途徑調(diào)節(jié)膽固醇外流，進(jìn)而影響脂筏的豐度及其功能，制霜后可以減輕對(duì)Caco-2細(xì)胞膜脂筏豐度的影響。

脂筏作為質(zhì)膜上的重要功能平臺(tái)，在TLR4介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和靶向促炎因子表達(dá)中扮演關(guān)鍵角色[10-11]。脂筏含量的增加會(huì)導(dǎo)致TLR4受體在脂筏中占據(jù)時(shí)間變長(zhǎng)、信號(hào)增強(qiáng)，進(jìn)而引起炎癥[12-15]。為探究千金子制霜前后是否會(huì)通過(guò)調(diào)控Caco-2細(xì)胞膜脂筏豐度影響TLR4向脂筏的募集，本研究應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡考察千金子制霜前后對(duì)TLR4和脂筏共定位的影響，結(jié)果顯示千金子制霜前后提取物均可促進(jìn)TLR4向脂筏的募集；而制霜后對(duì)Caco-2細(xì)胞中TLR4向脂筏中募集的促進(jìn)作用明顯弱于生品。此結(jié)果進(jìn)一步表明，千金子制霜減毒作用是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞膜微區(qū)脂筏豐度影響Caco-2細(xì)胞中TLR4向脂筏的募集實(shí)現(xiàn)的。

此外，課題組前期研究結(jié)果還表明，千金子制霜減毒的作用機(jī)制與致炎能力下降以及干預(yù)小鼠結(jié)腸組織中TLR4/NF-κB/NLRP3信號(hào)通路有關(guān)[7]。為了更深入地研究千金子制霜前后是否能夠通過(guò)影響TLR4向脂筏募集進(jìn)一步干擾Caco-2細(xì)胞中TLR4下游信號(hào)通路傳導(dǎo)，本研究利用Western blotting和ELISA分別檢測(cè)千金子制霜前后提取物對(duì)TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、NLRP3蛋白表達(dá)和IL-1β、TNF-α釋放的影響，結(jié)果表明千金子生品可以提高Caco-2細(xì)胞脂筏中所含有的TLR4、NLRP3、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)，促進(jìn)IL-1β和TNF-α的釋放；而制霜后可不同程度地逆轉(zhuǎn)千金子誘導(dǎo)的TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、NLRP3、IL-1β和TNF-α水平的增高，與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，提示千金子生品可以促進(jìn)TLR4向脂筏的募集，誘導(dǎo)TLR4復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，使得NF-κB p65從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并提高NLRP3蛋白和炎癥因子的表達(dá)；千金子制霜后可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞膜微區(qū)脂筏豐度影響TLR4向脂筏的募集，進(jìn)而干預(yù)脂筏中包含的TLR4信號(hào)級(jí)聯(lián)，降低Caco-2細(xì)胞體外毒性。體外siRNA沉默技術(shù)顯示Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，IL-1β和TNF-α的含量顯著降低，進(jìn)一步證實(shí)千金子制霜前后對(duì)Caco-2細(xì)胞中IL-1β和TNF-α含量的上調(diào)作用與TLR4信號(hào)通路有關(guān)。但除了TLR4介導(dǎo)的NF-κB/NLRP3途徑外，TLR4還可介導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶/絲蘇氨酸激酶、干擾素調(diào)節(jié)因子3等多種信號(hào)途徑[16]，本研究結(jié)果尚不能揭示千金子制霜前后提取物對(duì)其他途徑的調(diào)控作用，后續(xù)將對(duì)TLR4介導(dǎo)的其他炎癥信號(hào)通路開(kāi)展研究。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)千金子生品可以顯著改善Caco-2細(xì)胞脂筏豐度，促進(jìn)TLR4向脂筏募集，從而誘導(dǎo)TLR4/NF-κB/NLRP3途徑的激活和TNF-α和IL-1β的釋放，而制霜后對(duì)脂筏豐度、TLR4向脂筏募集、TLR4/NF-κB/NLRP3通路傳導(dǎo)以及下游促炎因子分泌的影響均明顯減弱，提示千金子制霜減毒的作用機(jī)制可能與影響細(xì)胞膜微區(qū)脂筏豐度從而干擾Caco-2細(xì)胞中TLR4信號(hào)通路傳導(dǎo)有關(guān)，此結(jié)果可為深入探討千金子制霜減毒機(jī)制提供重要依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of extracts frombefore and after frosting mediating TLR4 signaling pathway in Caco-2 cells via regulating lipid rafts

WANG Hui-nan, WEI Xiao-tong, SHI Shuang-hui, WANG Meng-lin, MA Si-yuan, HU Yu-feng, JIANG Ming-rui, ZHANG Jing-qiu, WANG Ying-zi

School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

To study the mechanism of extracts from Qianjinzi () and Qianjinzishuang () mediating Toll-like receptor 4 (TLR4) signaling pathway in Caco-2 cells via regulating lipid rafts.Caco-2 cells were divided intolow-, medium- and high-dose (50, 200, 800 μg/mL) groups,low-, medium- and high-dose (50, 200, 800 μg/mL) groups and control group. Flow cytometry was used to detect the lipid rafts abundance of Caco-2 cells membrane. Confocal laser scanning microscope was used for studying the co-localization of TLR4 and lipid rafts in Caco-2 cells. Western blotting was applied to detect TLR4, nuclear factor-κB p65 (NF-κB p65), p-NF-κB p65 and NOD-like receptor family pyrin domain containing 3 (NLRP3) protein expressions in Caco-2 cells. Furthermore, ELISA was applied to determine the levels of interleukin-1β (IL-1β) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in the supernatant of Caco-2 cells. And the levels of IL-1β and TNF-α were detected in Caco-2 cells after transfection with.Compared with control group,extracts could increase the content of lipid rafts (< 0.01), promote the recruitment of TLR4 to lipid rafts (< 0.01), increase the protein expressions of TLR4, NF-κB p65, p-NF-κB p65 and NLRP3, as well as induce the release of IL-1β and TNF-α in Caco-2 cells (< 0.05, 0.01, 0.001). However, the effects ofextracts on the abundance of lipid rafts, the recruitment of TLR4 to lipid rafts, the conduction of TLR4-mediated signaling pathways and the secretion of pro-inflammatory factors were significantly weaker than those ofextracts at the same dose (< 0.05, 0.01, 0.001). In addition, the results of sitransfectionfurther confirmed that the content of IL-1β and TNF-α were significantly decreased after transfection ofin Caco-2 cells (< 0.05, 0.01, 0.001).The attenuation mechanism of processing formay be closely related to interfering the recruitment of TLR4 to lipid rafts by regulating lipid rafts abundance, and ultimately affecting the cascade of TLR4 signaling protein contained in lipid rafts.

; attenuating toxicity of frosting; lipid rafts; Toll-like receptor 4; Caco-2 cells; euphobiasteroid

R285.5

A

0253 - 2670(2023)22 - 7474 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.22.024

2023-07-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82074021）

王慧楠（1997—），女，博士研究生，從事中藥制劑新技術(shù)與中藥炮制原理研究。E-mail: 2672667045@qq.com

通信作者：王英姿（1975—），女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥制劑新技術(shù)與中藥炮制原理研究。Tel: (010)84738615 E-mail: wangyzi@sina.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]