亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS和HPLC-DAD法研究不同干燥方式對馬藍葉化學(xué)成分的影響

        2023-11-27 07:54:26賀亞男謝慧娟紀奇森張定堃
        中草藥 2023年22期

        蘇 娟,賀亞男,楊 鑫,謝慧娟,紀奇森,楊 明,張定堃*,韓 麗*

        ?藥劑與工藝·

        基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS和HPLC-DAD法研究不同干燥方式對馬藍葉化學(xué)成分的影響

        蘇 娟1,賀亞男1,楊 鑫1,謝慧娟1,紀奇森2,楊 明3,張定堃1*,韓 麗1*

        1. 成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院西南特色中藥資源國家重點實驗室,四川 成都 611137 2. 雅安迅康藥業(yè)有限公司,四川 雅安 625600 3. 江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室,江西 南昌 330004

        研究陰干、曬干、真空冷凍干燥、熱風干燥4種干燥方式對馬藍葉化學(xué)成分的影響,尋找差異成分,并建立HPLC-DAD同時定量分析5種吲哚類生物堿成分的方法,以期為建立規(guī)范的馬藍葉干燥方式提供理論依據(jù)。利用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS對4種干燥處理的馬藍葉進行定性分析,并結(jié)合熱圖聚類分析(heat map clustering analysis,HCA)、主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘-判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)篩選差異成分。共鑒定出67個共有化合物。HCA和PCA將陰干和熱風干燥歸為一類。OPLS-DA篩選出14個差異成分,多為生物堿類,且呈現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。HPLC-DAD結(jié)果表明,不同干燥方式馬藍葉中的5種吲哚類生物堿含量存在明顯差異。其中,熱風干燥樣品的靛藍含量最高,靛玉紅含量最低;陰干樣品的靛紅、色胺酮、靛玉紅含量最高。不同的干燥方式對馬藍葉的品質(zhì)有明顯影響。熱風干燥和曬干有利于吲哚苷水解合成靛藍,但靛紅和靛玉紅的含量較低。而陰干和真空冷凍干燥樣品的靛藍含量較低,而靛玉紅含量較高。陰干和熱風干燥能顯著提高馬藍葉藥效成分的總含量。建議在初加工馬藍葉時使用陰干或熱風干燥,為進一步探究馬藍葉的產(chǎn)地加工方式提供了數(shù)據(jù)支持,同時也為評估馬藍葉的質(zhì)量提供了技術(shù)支持。

        馬藍葉;UHPLC-Q-Orbitrap HRMS;HPLC-DAD;靛藍;靛玉紅;吲哚苷;靛紅;色胺酮;合成途徑;多元統(tǒng)計分析

        馬藍葉(南大青葉)是福建的道地藥材,屬于爵床科板藍屬多年生草本植物,具有清熱解毒、涼血消斑、瀉火定驚的功效[1]?,F(xiàn)代藥理研究表明,馬藍葉有抗菌、抗病毒、抗內(nèi)毒素、抗癌、增強免疫等作用,臨床上主要用于防治流感、流腦、病毒性肝炎等[1-2]。由于馬藍莖葉種植范圍大、易栽培和產(chǎn)量高,目前被廣泛用作生產(chǎn)青黛的主要植物來源。

        產(chǎn)地初加工是中藥材生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),直接影響到飲片的質(zhì)量,其中干燥方式是內(nèi)外質(zhì)量的決定性因素[3]。研究發(fā)現(xiàn)新鮮植物中的胞內(nèi)酶可以分解有效成分(次生代謝物等),未經(jīng)干燥或殺青(殺酶)的新鮮植物放置時間越長,其次生代謝物的含量降低也更明顯[3]。此外,干燥過程中的溫度和含水量的變化會影響植物中的正常代謝以及生理生化過程的穩(wěn)態(tài),誘導(dǎo)與次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)酶的表達,從而促進次生代謝產(chǎn)物的生成[4]。

        馬藍葉的主要化學(xué)成分包括生物堿類、黃酮類、五環(huán)三萜類等次級代謝產(chǎn)物,其中靛藍、靛玉紅是主要藥效成分[5]。已有研究證明,不同的干燥方式會明顯影響馬藍葉中的靛藍和色胺酮含量,然而目前市售的馬藍葉并沒有統(tǒng)一的干燥方法,導(dǎo)致其質(zhì)量參差不齊。因此,本實驗采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UHPLC-Q- Orbitrap HRMS)技術(shù)[6]結(jié)合多變量模式識別方法[主成分分析(principal component analysis,PCA)與正交偏最小二乘-判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)]對馬藍葉在不同干燥方式下進行系統(tǒng)評價,尋找差異化學(xué)成分,為闡明不同干燥方式馬藍葉中藥效成分的變化規(guī)律和機制提供參考,也為建立規(guī)范化的馬藍葉干燥方式提供了數(shù)據(jù)支持。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器

        Vanquish型超高效液相色譜聯(lián)用Q Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀、Ultimate 3000型高效液相色譜儀,美國Thermo Fisher Scientific公司;Thermo Scientific AccucoreTMC18色譜柱(100 mm×3 mm,2.6 μm),美國Thermo Fisher Scientific公司;Welchrom-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),月旭科技(上海)股份有限公司;KQ-500DE型超聲波清洗機,昆山市超聲儀器有限公司;BT25S型1/10萬分析天平,德國Sartorius公司;CR-400型色彩色差計,日本柯尼卡美能達株式會社;FEI Inspect F50型掃描電子顯微鏡(SEM),美國Thermo Fisher Scientific公司;MB25型水分測定儀,奧豪斯儀器(常州)有限公司。

        1.2 材料

        馬藍于2022年10月由四川迅康公司提供,經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院西南特色中藥資源國家重點實驗室韓麗教授鑒定,為爵床科板藍屬植物馬藍(Nees) Bremek.,實驗所需的2批藥材分別采摘于10月上旬和下旬,均來自于四川雅安。

        -酪氨酸,批號CHB-L-010,購自成都克洛瑪生物科技有限公司;對照品靛紅(批號DSTDD01820)、靛玉紅(批號DSTDD012201)、吲哚苷(批號DST220317-664)、色胺酮(批號DST 200611-256)、靛藍(批號DSTDD008801)、吲哚(批號AFCB1556)、-精氨酸(批號DSTDJ021701)、-正亮氨酸(批號DST201101-152)、松脂素-β--吡喃葡萄糖苷(批號DS0024-0020)均購自成都德思特生物技術(shù)有限公司,所有對照品質(zhì)量分數(shù)均大于95%;對照品毛蕊花糖苷,批號AF21081201,購自成都埃法生物科技有限公司,質(zhì)量分數(shù)大于98%;水為超純水,甲醇為色譜級;,-二甲基甲酰胺(,-dimethylformamide,DMF)、二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)為分析級。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 樣品干燥

        用清水沖洗新鮮馬藍葉的表面泥土,然后用吸水紙吸取表面多余水分。將馬藍葉片分成4份,每份1500 g,分別進行陰干、曬干、真空冷凍干燥、熱風干燥,干燥的最后標準是葉片脆碎。陰干組:將樣品鋪在單層托盤上,放置于通風陰涼處3~4 d;曬干組:將樣品鋪在單層托盤上,然后將干燥托盤暴露在22~28 ℃的陽光下,直到表皮起皺;真空冷凍干燥組:先在?20 ℃冰箱中預(yù)凍3 h,于真空冷凍干燥機(真空度6.0 Pa;冷阱溫度?60 ℃)干燥;熱風干燥組:將馬藍葉置于40 ℃的鼓風式恒溫干燥箱中干燥。干燥后,將樣品用打粉機打碎成細粉,過40目篩后儲存在4 ℃下。

        2.2 含水量測定

        分別精密稱取4種干燥方式下的馬藍葉粉末2 g于水分測定儀的樣品盤中,均勻平鋪,水分測定儀自動測定不同干燥方式馬藍葉粉末樣品的含水率,結(jié)果見表1。根據(jù)表1可知,不同干燥方式的馬藍葉樣品的含水率有所不同。從高到低,4種干燥方式的馬藍葉粉末含水率依次為陰干、曬干、熱風干燥和真空冷凍干燥。自然干燥(陰干和曬干)干燥耗時長、效率較低、含水率較高,而相較于自然干燥,真空冷凍干燥、熱風干燥耗時更短,干燥效率更高。因此,機械干燥能有效提高干燥速度,達到快速降低水分的目的。

        表1 不同干燥方式下馬藍葉粉末水分含量(, n = 3)

        2.3 色澤測定

        以*=100、*=0、*=0為參照校正色,經(jīng)校準后,分別取4種不同干燥方式處理的馬藍葉粉末(圖1)測得各樣品的*、*、*、Δ*。*值的正、負代表紅色、綠色,*值的正、負代表黃色、藍色,Δ*代表著總色差,數(shù)值越大表示與白板相比色差越大。不同干燥方式的馬藍葉粉末顏色測定結(jié)果見表2。不同干燥方式對樣品的表觀品質(zhì)有顯著影響(<0.05)。

        真空冷凍干燥樣品粉末的*、*、*分別為43.36±0.02、?7.57±0.01、17.69±0.01,與真空冷凍干樣品相比,陰干、曬干、熱風干燥樣品粉末*、*均顯著降低,*顯著升高。這說明陰干、曬干、熱風干燥這3種干燥方式的樣品色澤變暗,比真空冷凍干樣品少綠、少黃(多紅、多藍)。這可能是由于馬藍葉中糖類、氨基化合物、酚類物質(zhì),長時間放置在高溫潮濕的環(huán)境中,易發(fā)生氧化反應(yīng)和美拉德反應(yīng),高溫環(huán)境還會加劇樣品中的糖苷類物質(zhì)發(fā)生降解,從而降低色澤。而真空冷凍干燥在亞大氣壓環(huán)境下干燥,會減少熱損傷和氧化損傷,最大程度上保留了樣品的色澤和營養(yǎng)成分。

        圖1 不同干燥方式馬藍葉粉末外觀性狀

        表2 不同干燥方式下馬藍葉粉末顏色測定結(jié)果(, n = 3)

        同列不同字母表示顯著性差異(<0.05)

        different letters in the same column indicate significant differences (< 0.05)

        2.4 SEM觀察

        將各樣品粉末分別用雙面導(dǎo)電膠固定到樣品臺上,經(jīng)離子濺射儀真空噴金鍍膜后,置于SEM下進行觀察并拍照。不同干燥方式的馬藍葉粉末的SEM觀察結(jié)果見圖2。結(jié)果表明,不同干燥方式的馬藍葉樣品粉末的微觀形態(tài)具有明顯差異。陰干樣品表面略微收縮,呈現(xiàn)團塊狀;曬干樣品的表面皺縮更為明顯,同時呈現(xiàn)團塊狀并出現(xiàn)裂痕;真空冷凍干燥樣品表面相對平整,基本無皺縮,內(nèi)部疏松多孔;熱風干燥樣品表面明顯皺縮和凹陷,多呈實心團狀。

        2.5 基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS的化學(xué)成分分析

        2.5.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取對照品-精氨酸、纈氨酸、-正亮氨酸、吲哚苷、靛紅、松脂素-β--吡喃葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、吲哚、靛藍、靛玉紅于25 mL量瓶中,加入適量DMSO,超聲(150 W、40 kHz)溶解后用DMSO溶劑定容。取1 mL溶液于5 mL量瓶中,用色譜甲醇稀釋,配制成質(zhì)量濃度分別為64.0、84.4、66.4、90.0、75.6、120.4、88.0、135.2、78.4、57.6 μg/mL的混合對照品溶液,溶液過0.22 μm微孔濾膜后,供UHPLC-Q-Orbitrap HRMS檢測分析。

        2.5.2 供試品溶液的制備 精密稱取4種干燥方式下的馬藍葉粉末0.5 g,置于具塞三角瓶中,加入DMSO 25 mL,超聲(150 W、40 kHz)提取30 min,靜置,8000 r/min離心(離心半徑1 cm)5 min。精密移取上清液1 mL置10 mL量瓶中,加甲醇定容,過0.22 μm微孔濾膜,即得供試品溶液。

        2.5.3 色譜條件 Thermo Scientific AccucoreTMC18色譜柱(100 mm×3 mm,2.6 μm,美國Thermo Fisher Scientific公司),以1%冰醋酸水溶液-甲醇為流動相,梯度洗脫:0~3 min,5%甲醇;3~5 min,5%~10%甲醇;5~10 min,10%~20%甲醇;10~15 min,20%~30%甲醇;15~20 min,30%~50%甲醇;20~25 min,50%~55%甲醇;25~30 min,55%~60%甲醇;30~35 min,60%~70%甲醇;35~36 min,70%~80%甲醇;36~40 min,80%~90%甲醇;40~45 min,90%甲醇;檢測波長255 nm;體積流量0.3 mL/min;柱溫為30 ℃;進樣量為5 μL。

        2.5.4 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI),正、負離子模式檢測,噴霧電壓+3.5 kV/?3.0 kV,輔助氣加熱溫度350 ℃,鞘氣體積流量35 arb,輔助氣體積流量10 arb,離子傳輸管溫度320 ℃。掃描模式為一級質(zhì)譜全掃描結(jié)合自動觸發(fā)二級質(zhì)譜掃描模式(full MS/ dd-MS2),一級分辨率35 000,二級分辨率17 500,離子掃描范圍/50~1500,碰撞能量梯度為20、40、60 eV。

        2.5.5 化學(xué)成分鑒定 將采集得到的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound Discoverer 3.0軟件進行峰對齊和峰提取。利用提取得到的分子離子色譜峰、同位素峰擬合出可能的分子式,并將二級碎片實測譜圖與mzCloud網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫及mzVaul數(shù)據(jù)庫進行匹配。設(shè)置匹配結(jié)果過濾參數(shù)為:一級及二級質(zhì)量偏差1×10?5,匹配度分值高于80。對過濾后的離子與數(shù)據(jù)庫中的化合物信息及對照品進行比對,結(jié)合相關(guān)文獻和在線數(shù)據(jù)庫(PubChem、Human Metabolome Database、CNKI)對化學(xué)成分進一步分析鑒定。在正、負離子模式下,對照品和供試品溶液的總離子流圖如圖3所示。鑒定結(jié)果(表3)顯示,從4種不同干燥方式的樣品中共鑒定出67個共有成分,包括17種生物堿、17種有機酸、13種氨基酸、6種核苷、5種黃酮、2種萜類、2種木脂素、2種苯乙醇苷、2種糖類、1種香豆素類成分。各成分的保留時間、質(zhì)譜信息和結(jié)構(gòu)鑒定見表3。

        2.5.6 PCA和聚類分析 以共有峰的峰面積為變量,利用Metabo Analyst進行聚類分析、SIMCA-P 14.0進行PCA,以研究同種樣品之間的相似性和不同種樣品間的差異性的關(guān)系和趨勢,結(jié)果見圖4、5。熱圖(圖4)結(jié)果表明,不同干燥方式的馬藍葉存在明顯的分組模式,樣品可聚為2類,其中陰干、熱風干燥聚為一類,曬干、真空冷凍干燥聚為一類。PCA結(jié)果(圖5)表明,不同干燥方式被分為3組,其中陰干、熱風干燥樣品為一組,曬干、真空冷凍干燥樣品各為一組。陰干和熱風干燥2組顯示出部分重疊,表明這2組間的化學(xué)成分含量較為相似,而曬干和真空冷凍干燥組在PC2方向上的間距較大,說明這2組樣品的成分含量存在差異。4組組內(nèi)樣本間的離散均較小,表明組內(nèi)均一性良好。因此,綜合PCA和聚類分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同干燥方式馬藍葉的化學(xué)成分含量存在差異,陰干和熱風干燥樣品相似,而與曬干、真空冷凍干燥樣品化學(xué)成分含量差異明顯。

        2.5.7 差異成分分析 利用SIMCA-P 14.0將陰干、曬干、熱風干燥組分別與真空冷凍干燥組進行OPLS- DA和S-plot分析,并以VIP>1和|p(corr)|>0.58為標準篩選出顯著差異化合物,結(jié)果見圖6。

        由圖6-a~c可知,各組OPLS-DA模型均表現(xiàn)出更明顯的分離趨勢。OPLS-DA模型驗證結(jié)果中各組參數(shù)指標均大于0.85且2>0.9,說明模型構(gòu)建良好,預(yù)測性可靠。散點得分圖(S-plot)可以表示組間的差異成分,數(shù)據(jù)點離原點越遠,則該變量對樣本分組差異的貢獻越大。

        如圖6-d~f所示,共篩選出個14個差異化合物。陰干真空冷凍干燥篩選出10種差異化合物,其中上調(diào)的化合物有3種,包括靛藍、靛紅、葡萄糖酸,下調(diào)的化合物有7種,包括吲哚苷、2-吲哚酮、靛玉紅、綠原酸、奎寧酸、芥酰胺酸、纈氨酸;曬干真空冷凍干燥篩選出12種差異化合物,其中上調(diào)的化合物有4種,包括靛藍、纈氨酸、金圣草素、5,7,4′-三羥基-6甲氧基黃酮,下調(diào)的化合物有8種,包括靛玉紅、吲哚苷、綠原酸、靛紅、芥酰胺酸、毛蕊花糖苷、2-吲哚酮、油酸酰胺;熱風干燥真空冷凍干燥篩選出10種差異化合物,其中上調(diào)的化合物有2種,包括靛藍、5,7,4′-三羥基-6甲氧基黃酮,下調(diào)的化合物有8種,包括吲哚苷、靛玉紅、綠原酸、毛蕊花糖苷、2-吲哚酮、奎寧酸、纈氨酸、芥酸酰胺。

        此外,分析發(fā)現(xiàn)靛藍、靛紅、靛玉紅、吲哚苷、2-吲哚酮這5種吲哚類生物堿是3個比較組模型的共有差異代謝物。因此,不同干燥方式會對馬藍葉的代謝產(chǎn)生影響,尤其是與靛藍、靛玉紅等吲哚類生物堿相關(guān)的代謝途徑。

        2.6 HPLC法吲哚生物堿含量測定

        2.6.1 對照品溶液的制備 精密稱取靛藍、靛玉紅、色胺酮、靛紅、吲哚苷對照品適量于10 mL量瓶中,加入DMF適量,超聲溶解后定容,配制成質(zhì)量濃度為108.0、132.0、121.0、68.8、142.0 μg/mL的混合對照品溶液。

        2.6.2 供試品溶液的制備 精密稱取馬藍葉粉末10 mg于10 mL量瓶中,加入適量DMF,超聲(150 W、40 kHz)提取30 min,靜置,加DMF定容,過0.22 μm微孔濾膜,即得供試品溶液。

        2.6.3 HPLC條件 色譜柱為Welchrom-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);以純水-甲醇為流動相,梯度洗脫:0~8 min,20%~40%甲醇;8~12 min,40%~44%甲醇;12~17 min,44%~70%甲醇;17~37 min,70%~85%甲醇;37~42 min,85%甲醇;42~47 min,85%~20%甲醇。

        2.6.4 線性關(guān)系考察 按照“2.6.1”項下方法制備對照品溶液,并以DMF為溶劑,逐級稀釋至7個不同質(zhì)量濃度,得到系列對照品溶液。按照“2.6.3”項下HPLC條件測定不同梯度質(zhì)量濃度混合對照品溶液中各成分的峰面積。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(),峰面積值為縱坐標()繪制標準曲線,進行線性回歸計算,得到線性回歸方程:吲哚苷=0.132 8+0.005 0,2=1.000 0,線性范圍0.043 2~108.000 μg/mL;靛紅=0.189 7+0.022 3,2=0.999 9,線性范圍0.058~132.000 μg/mL;色胺酮=0.210 6+0.003 4,2=1.000 0,線性范圍0.048 4~121.000 μg/mL;靛藍=0.324 9+ 0.290 4,2=0.999 5,線性范圍0.133 6~66.800 μg/mL;靛玉紅=0.843 6+0.005 5,2=1.000 0,線性范圍0.056 8~142.000 μg/mL;結(jié)果回歸方程2值均大于0.999,表明線性關(guān)系考察結(jié)果良好。

        圖3 混合對照品和4種不同干燥方式馬藍葉粉末UHPLC-Q-Exactive MS正、負離子模式的總離子流圖

        續(xù)表3

        2.6.5 精密度試驗 取吲哚苷、靛紅、色胺酮、靛藍、靛玉紅混合對照品溶液,按照“2.6.3”項下色譜條件連續(xù)測定6次,計算各成分峰面積的RSD值。結(jié)果表明吲哚苷、靛紅、色胺酮、靛藍、靛玉紅峰面積的RSD分別為0.13%、0.19%、0.25%、0.53%、0.19%,均小于5%,精密度試驗結(jié)果良好。

        2.6.6 重復(fù)性試驗 根據(jù)“2.6.2”項下的制備方法平行制備馬藍葉陰干樣品溶液6份,按照“2.6.3”項下色譜條件測定6份樣品溶液中吲哚苷、靛紅、色胺酮、靛藍、靛玉紅的峰面積,利用標準曲線計算各成分質(zhì)量分數(shù)的RSD值。結(jié)果表明吲哚苷、靛紅、色胺酮、靛藍、靛玉紅的峰面積RSD分別為3.24%、4.16%、2.18%、0.63%、0.40%,均小于5%,精密度試驗結(jié)果良好。

        2.6.7 穩(wěn)定性試驗 根據(jù)“2.6.2”項下的制備方法陰干馬藍葉樣品溶液,按照“2.6.3”項下色譜條件測定,分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h吲哚苷、靛紅、色胺酮、靛藍、靛玉紅峰面積的RSD值,分析樣品在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性。結(jié)果表明吲哚苷、靛紅、色胺酮、靛藍、靛玉紅峰面積的RSD分別為0.86%、2.72%、3.94%、1.38%、0.36%,馬藍葉樣品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

        A-陰干 B-曬干 C-真空冷凍干燥 D-熱風干燥 1~67-化合物峰號(圖5、6同)

        2.6.8 加樣回收率試驗 精密稱取6份已測定的馬藍葉陰干樣品10 mg,分別加入與樣品中等質(zhì)量的吲哚苷、靛紅、色胺酮、靛藍、靛玉紅對照品溶液,混合后,按照“2.6.2”項下制備方法進行制備,按照“2.6.3”項下色譜條件進行測定,計算加樣回收率。結(jié)果吲哚苷、靛紅、色胺酮、靛藍、靛玉紅的平均加樣回收率分別為100.60%、101.20%、99.20%、96.59%、100.99%,RSD分別為3.87%、1.88%、1.74%、1.30%、2.50%。

        2.6.9 吲哚生物堿含量測定 取4種不同干燥方式的馬藍葉樣品,根據(jù)“2.6.2”項下方法制備樣品溶液,按照“2.6.3”項下色譜條件進行分析,記錄峰面積。根據(jù)線性關(guān)系計算吲哚苷、靛紅、色胺酮、靛藍、靛玉紅5種生物堿的含量并進行含量方差分析(ANOVA)。不同的字母(a~d)代表各組在<0.05的水平上具有顯著差異,無字母代表無顯著差異,馬藍葉樣品中各成分含量結(jié)果見表4。

        4組馬藍葉樣品中的吲哚苷、色胺酮、靛藍含說明一定的干燥溫度可能促進酶/微生物的活性,進而有助于植物代謝合成靛藍,但會降低靛玉紅(靛藍的同分異構(gòu)體)的含量。色胺酮的含量與文獻報道[25]的后熟現(xiàn)象一致,即在低溫低氧下真空冷凍干燥樣品中的色胺酮含量最低,甚至有時含量過低而未檢測到,而陰干、曬干、熱風干燥樣品的色胺酮含量均有增加,表現(xiàn)為陰干>曬干>熱風干燥。這可能是由于陰干法干燥溫度適中,干燥時間較長,其次是曬干、熱風干燥,在藥材未完全干透之前有利于色胺酮的后熟,致使其含量升高。以靛藍、靛玉紅為代表的吲哚生物堿類成分是馬藍發(fā)揮藥效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。結(jié)合多元統(tǒng)計分析結(jié)果和HPLC含量測定結(jié)果,認為陰干和熱風干燥更能明顯提高靛藍、靛玉紅的總含量,保障馬藍葉的質(zhì)量。

        圖5 不同干燥方式馬藍葉粉末PCA得分圖和載荷圖

        d~f圖中三角形代表符合篩選條件的差異化合物的分子離子峰

        2.7 不同干燥處理方式對靛藍、靛玉紅合成途徑的影響分析

        基于上述實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同干燥方式對馬藍葉的化學(xué)成分有明顯影響,尤其是吲哚類生物堿的含量,其原因可能是干燥過程中的溫度和含水量變化會影響馬藍葉中的正常代謝以及與次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)酶的表達和微生物的活性,所以導(dǎo)致靛藍、靛玉紅等次生代謝產(chǎn)物含量的變化。

        表4 不同干燥方式馬藍葉中的吲哚生物堿含量(, n = 3)

        同行的不同的字母(a~d)代表各組在<0.05的水平上具有顯著差異,“?”表示未檢測出

        different letters (a—d) of the peer group represented significant differences at< 0.05 level, “?” indicates that alarm is not detected

        靛藍、靛玉紅合成途徑(圖7)[15-16,19]有2種方式:莽草酸途徑和分解儲存在液泡中的前體物質(zhì)(吲哚苷、大青素B、大青素C等成分)。通過分析合成途徑發(fā)現(xiàn)靛紅、2-吲哚酮、2-羥基吲哚、3-羥基吲哚是合成靛藍、靛玉紅的關(guān)鍵物質(zhì)。

        進一步對合成途徑中的多元成分進行了方差分析,結(jié)果(表5)顯示,不同干燥組的莽草酸合成途徑中的多元活性成分相對峰強度差異較小,然而尿苷二磷酸葡萄糖、吲哚苷、靛紅、2-吲哚酮的相對峰面積含量顯示出明顯差異。由于3-羥基吲哚和吲哚的穩(wěn)定性較差且易氧化,所以二者的相對峰強度未體現(xiàn)差異。因此,不同干燥方式可能主要通過影響吲哚苷的合成和水解進而影響2-羥基吲哚、3-羥基吲哚、靛紅、2-吲哚酮等中間物質(zhì)的生成,最終影響靛藍、靛玉紅的含量。

        真空冷凍干燥是在低溫低氧的條件下進行干燥,對植物的代謝影響較小,各成分的含量可能更接近最初的狀態(tài)。相比之下,陰干在較溫和的條件下干燥,水分揮發(fā)速度較慢,干燥時間長,吲哚苷水解的時間更長;熱風干燥溫度較高,會提高β--葡萄糖苷酶的活性,從而提高吲哚苷水解速率。曬干樣品中的吲哚苷含量則介于陰干和熱風干燥之間。

        CYP-細胞色素酶P450 glu-葡萄糖 UGT-UDP-葡糖基轉(zhuǎn)移酶 GLU-β-D葡萄糖苷酶,虛線表示多步反應(yīng)

        表5 不同干燥方式馬藍葉中多元活性成分的方差分析(n = 3)

        不同的字母(a~d)代表各組在<0.05的水平上具有顯著差異

        different letters (a to d) represented significant differences among groups at< 0.05 level

        與真空冷凍干燥相比,其余3種方式的靛藍含量均升高,而靛玉紅含量均降低,差異顯著。除陰干樣品的靛紅含量有所上升外,曬干、熱風干燥樣品的靛紅和2-吲哚酮含量以及陰干樣品的2-吲哚酮含量均下降,說明陰干、曬干、熱風干燥的條件更有利于促進合成靛藍。此外,靛藍的耐光、耐熱性較差,吲哚苷水解合成靛藍、靛玉紅的過程與氧氣、溫度、水分、光照等因素均有一定關(guān)聯(lián)。因此,對于影響該過程的因素以及干燥工藝的最佳參數(shù)還需要進行深入探索。

        3 討論

        本實驗利用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS和多元統(tǒng)計分析技術(shù),分析出不同干燥處理馬藍葉樣品中的顯著差異成分和主要藥效成分(靛藍、靛玉紅)含量變化規(guī)律及原因。聚類分析和PCA將陰干和熱風干燥歸為一類,OPLS-DA篩選出14個差異化合物,多數(shù)為生物堿類成分,其中5種吲哚類生物堿成分為各組的共有差異化合物。HPLC-DAD測定和多元活性成分的方差分析進一步顯示陰干和熱風干燥樣品中主要藥效成分(靛藍、靛玉紅)的總量更高。在陰干、曬干、真空冷凍、熱風干燥4種干燥方式中,熱風干燥、曬干的溫度會提高β--葡萄糖苷酶和與靛藍合成相關(guān)的微生物的活性,促進吲哚苷分解,進一步轉(zhuǎn)化和合成靛藍,但溫度的升高會導(dǎo)致靛紅和2-吲哚酮等中間成分含量減少,進而導(dǎo)致靛玉紅含量降低,而陰干、真空冷凍干燥樣品的靛玉紅含量較高。因此,建議馬藍葉初加工時采用陰干或熱風干燥的方法。本研究結(jié)果為深入研究馬藍葉的產(chǎn)地加工方式提供數(shù)據(jù)支撐,并解釋了不同干燥方式導(dǎo)致馬藍葉中靛藍、靛玉紅等藥效成分含量差異的機制。此外,還建立了一種同時測定5種吲哚類生物堿成分含量的方法,該方法具有靈敏度高,重復(fù)性和專屬性好的特點,為評價馬藍葉的質(zhì)量提供了一定的技術(shù)支持。

        利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

        [1] 樊莉, 李婉姝, 劉望才, 等. 馬藍葉化學(xué)成分的分離與鑒定 [J]. 中藥材, 2023, 46(3): 648-651.

        [2] 馬樂樂, 許潤春, 張定堃, 等. 古今青黛飲片形式的變化: 靛花與粗靛質(zhì)量的系統(tǒng)對比研究 [J]. 中國中藥雜志, 2021, 46(13): 3188-3197.

        [3] 董娟娥, 龔明貴, 梁宗鎖, 等. 干燥方法和提取溫度對板藍根、大青葉有效成分的影響 [J]. 中草藥, 2008, 39(1): 111-114.

        [4] 李澤娜, 劉暢, 吳乾峰, 等. 基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的不同加工干燥方法下的杜仲代謝組學(xué)分析 [J]. 分析測試學(xué)報, 2022, 41(7): 998-1006.

        [5] Chen J, Zhu Z P, Gao T H,.and: A systematic review on ethnopharmacology, phytochemistry and pharmacology [J]., 2022, 283: 114648.

        [6] 孫志, 張媛媛, 周勝楠, 等. 基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS和生物信息學(xué)探討瓜蔞薤白湯治療冠心病的潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制 [J]. 中草藥, 2022, 53(18): 5613-5624.

        [7] 徐志琴, 趙志敏, 馬慶, 等. 南板藍根化學(xué)成分、藥理作用及質(zhì)量控制研究進展 [J]. 世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2021, 23(9): 3365-3375.

        [8] 黃玉香, 譚何新, 于劍, 等. 藥用植物生物堿次生代謝工程研究進展 [J]. 中草藥, 2016, 47(23): 4271-4281.

        [9] 田世民, 謝錦, 尚強, 等. 基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS和GC-MS技術(shù)的抗病毒顆?;瘜W(xué)成分分析 [J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2023, 43(2): 134-144.

        [10] 沈繼偉, 馬小毛, 魏道智. 馬藍鄰氨基苯甲酸合成酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析 [J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2020, 39(12): 5773-5780.

        [11] 雷黎明, 潘清平. 板藍根化學(xué)、藥理、質(zhì)量及提取方法的研究進展 [J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2007, 18(10): 2578-2580.

        [12] 劉澤玉, 蘇柘僮, 楊明, 等. 馬藍葉中β-葡萄糖苷酶的提取及酶學(xué)性質(zhì)的研究 [J]. 中草藥, 2010, 41(9): 1461-1464.

        [13] Marcinek H, Weyler W, Deus-Neumann B,. Indoxyl-UDPG-glucosyltransferase from[J]., 2000, 53(2): 201-207.

        [14] 李柯城, 袁銘銘, 代敏, 等. 大青葉中生物堿類成分研究 [J]. 中成藥, 2022, 44(12): 3879-3884.

        [15] 郭志英, 李卿, 吳循循, 等. 馬藍WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族生物信息學(xué)及表達特征分析 [J]. 藥學(xué)學(xué)報, 2022, 57(9): 2864-2875.

        [16] 張一鳴, 黃元貞, 萬會花, 等. 植物中靛藍生物合成途徑研究進展 [J]. 中國中藥雜志, 2020, 45(3): 491-496.

        [17] 胡永勝. 菘藍中木脂素生源合成途徑五個關(guān)鍵酶基因的克隆與功能分析 [D]. 上海: 第二軍醫(yī)大學(xué), 2010.

        [18] 張東東. 板藍根化學(xué)成分及其抑制一氧化氮釋放活性研究 [D]. 上海: 上海中醫(yī)藥大學(xué), 2020.

        [19] 林文津. 福建馬藍有效成分累積及其分子基礎(chǔ)研究 [D]. 福州: 福建農(nóng)林大學(xué), 2015.

        [20] 何雨晴, 陳迪路, 張鄭潔, 等. UPLC-Q-TOF-MS聯(lián)合UNIFI篩查平臺快速分析湘產(chǎn)大青葉化學(xué)成分 [J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2021, 17(5): 33-37.

        [21] 羅文艷, 段和祥, 劉緒平, 等. HPLC-一測多評法同時測定大青葉中6種抗腫瘤活性成分的含量 [J]. 中國藥房, 2018, 29(19): 2635-2639.

        [22] 姬志強, 張建民, 李永麗, 等. 大青葉脂溶性成分的GC-MS分析 [J]. 中國藥師, 2014, 17(6): 950-952.

        [23] 楊立國, 王琪, 蘇都那布其, 等. 菘藍屬植物化學(xué)成分及藥理作用研究進展 [J]. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2021, 38(16): 2039-2048.

        [24] 聶黎行, 王馨平, 黃烈?guī)r, 等. 板藍根化學(xué)成分信息庫的構(gòu)建 [J]. 中國藥學(xué)雜志, 2022, 57(6): 428-452.

        [25] 徐志琴, 蔡銥?zāi)? 陳奕弟, 等. 馬藍葉化學(xué)成分研究 [J]. 中藥材, 2021, 44(8): 1875-1879.

        [26] 廖維, 宋嬌, 韓麗, 等. 天然產(chǎn)物色胺酮的研究進展 [J/OL]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2022-09-30. https://kns. cnki.net/kcms/detail/51.1335.Q.20220928.1836.002.html.

        Effects of different drying methods on chemical composition ofleaves based on UHPLC-Q-Orbitrap HRMS and HPLC-DAD methods

        SU Juan1, HE Ya-nan1, YANG Xin1, XIE Hui-juan1, JI Qi-sen2, YANG Ming3, ZHANG Ding-kun1, HAN Li1

        1. State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. Ya’an Xunkang Pharmaceutical Co., Ltd., Ya’an 625600, China 3. Key Laboratory of Modern Preparation of TCM, Ministry of Education, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China

        The effects of four drying methods by drying in the shade, sun drying, vacuum freeze-drying, and hot air drying on the chemical components of Malan () leaves were studied to searched for the differential compounds, and a method for simultaneous quantitative analysis of five indole alkaloids was established by HPLC-DAD, in order to provide theoretical basis for establishing standardized drying methods ofleaves.UHPLC-Q-Orbitrap HRMS was used to qualitatively analyze theleaves with four drying methods, and heat map clustering analysis (HCA), principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least square-discriminant analysis (OPLS-DA) were used to screen the differential compounds.A total of 67 common compounds were identified. Heat map clustering analysis (HCA) and PCA analysis classified the drying in the shade and the hot air drying in one class. OPLS-DA screened 14 differential components, most of which were alkaloids, and showed different change rules. The results of HPLC-DAD showed that the contents of five indole alkaloids inleaves were significantly different by different drying methods. Among them, the hot-air drying samples had the highest indigo content and the lowest indirubin content. The drying in the shade samples had the highest content of isatin, tryptanthrin and indirubin.Different drying methods have a significant impact on the quality ofleaves. Hot air drying and sun drying favor the hydrolysis of indican to synthesize indigo, but the content of isatin and indirubin is lower. Drying in the shade and vacuum freeze-dried samples had a lower indigo content, while indirubin a higher content. Drying in the shade and hot air drying significantly increased the total content of theleaves efficacy components. It is suggested to use drying in the shade and hot air drying in the initial processing of theleaves, which provides data support for further study of the processing methods of theleaves, and also provide technical support for evaluating the quality of theleaves.

        leaves; UHPLC-Q-Orbitrap HRMS; HPLC-DAD; indigo; indirubin; indican;isatin; tryptanthrin; synthetic pathway; multivariate statistical analysis

        R283.6

        A

        0253 - 2670(2023)22 - 7374 - 13

        10.7501/j.issn.0253-2670.2023.22.014

        2023-06-13

        國家自然科學(xué)基金面上項目(82173976)

        蘇 娟,女,碩士,研究方向為從事中藥制劑新技術(shù)研究。E-mail: 1105072526@qq.com

        通信作者:韓 麗,女,博士,教授,研究方向為主要從事中藥制劑新技術(shù)研究。E-mail: hanliyx@163.com

        張定堃,男,博士,副教授,研究方向為主要從事中藥制劑新技術(shù)研究。E-mail: zhangdingkun@cdutcm.edu.cn

        [責任編輯 鄭禮勝]

        99久久免费国产精品2017| 国产成人久久精品一区二区三区| 欧美日韩国产在线人成dvd| 一区二区av日韩免费| 99久久精品人妻一区| 在线观看午夜视频国产| 中国老太婆bb无套内射| 国产精品美女久久久久久久久| 亚洲精品123区在线观看| 亚洲一区二区三区毛片| 日本精品视频免费观看| 免费人成网ww555kkk在线| 国产精品综合日韩精品第一页| 亚洲高清美女久久av| 9久久婷婷国产综合精品性色| 亚洲精品久久久久久久久久吃药| 国产呦精品系列在线播放| 国产主播在线 | 中文| 一本大道加勒比东京热| 色吧噜噜一区二区三区| 天码人妻一区二区三区| 无码不卡免费一级毛片视频| 亚洲中文字幕乱码免费看| 日韩人妻不卡一区二区三区| 国产成人无码一区二区在线观看| 正在播放淫亚洲| 熟女少妇av一区二区三区| 狠狠躁18三区二区一区| 天堂sv在线最新版在线| 亚洲黄片高清在线观看| 精品一区二区在线观看免费视频| 天堂а√在线最新版中文在线| 免费成人福利视频| 国产精品天堂在线观看 | 亚洲高潮喷水无码av电影| 97精品国产高清自在线看超 | 国产精品综合女同人妖| 日本一区二区三区视频在线观看| 亚洲精品无码成人a片| 精品人妻av一区二区三区麻豆| 人人妻人人澡人人爽超污|