苑楠楠，王宏進(jìn)，孫 琪，趙 蕾，白樺芳，孫立新

基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS鑒定參芪降糖膠囊在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物

苑楠楠，王宏進(jìn)，孫 琪，趙 蕾，白樺芳，孫立新*

沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 本溪 117004

研究參芪降糖膠囊在大鼠血漿、膽汁、尿液和糞便中的代謝產(chǎn)物及其代謝途徑。采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技術(shù)，以0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫，并采用ESI離子源，分別在正、負(fù)離子模式進(jìn)行全掃描和二級質(zhì)譜掃描，獲得化合物的一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合文獻(xiàn)報道、對照品裂解規(guī)律及藥物代謝反應(yīng)規(guī)律,對大鼠ig參芪降糖膠囊混懸液后的生物樣品進(jìn)行分析鑒定。在大鼠體內(nèi)共鑒定出125個化合物，包括47個原型成分（PA1～PF）和78個代謝產(chǎn)物（MA1～ME14），其中2個為新代謝產(chǎn)物，分別為MC15（五味子甲素雙脫甲基后葡萄糖醛酸化產(chǎn)物）和MD3（去氫茯苓酸的硫酸酯化產(chǎn)物），4個為新化合物，分別為MC14：(6,7)-2,3,10,11-tetramethoxy-6,7-dimethyl- 5,6,7,8-tetrahydrodibenzo[a,c][8]annulene-1,7-diol、MC16：(6,7)-2,3,10-trimethoxy-6,7-dimethyl-5,6,7,8-tetrahydrodibenzo [a,c][8]annulene-1,7,11-triol、MD1：()-2-((3,3a,6,7,9b)-6-(2-carboxyethyl)-3a,6,9b-trimethyl-7-(prop-1-en-2-yl)-3a,4,6,7,8,9b- hexahydro-3-cyclopenta[a]naphthalen-3-yl)-6-methylhept-5-enoic acid和MD4：(3,5,10,13,14,16,17)-4,4,10,13,14,17- hexamethyl-2,3,4,5,6,10,12,13,14,15,16,17-dodecahydro-1-cyclopenta[a]phenanthrene-3,16-diol。參芪降糖膠囊在大鼠體內(nèi)的代謝途徑主要涉及脫羥基、脫甲基、脫水、水解、還原氫化、甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸酯化和多種反應(yīng)類型的復(fù)合反應(yīng)等。初步闡明了參芪降糖膠囊的體內(nèi)代謝特征，同時為探索其生物活性成分及作用機(jī)制提供參考。

參芪降糖膠囊；超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法；代謝產(chǎn)物；代謝途徑；黃芪甲苷；芒柄花素；五味子甲素

糖尿病是一種以血糖水平升高為主要特征的慢性代謝性疾病，主要分為1型和2型糖尿病，其中2型糖尿病患者約占90%以上。在具有降糖療效的中藥制劑中，參芪降糖膠囊（Shenqi Jiangtang Capsules，SJC）由人參莖葉總皂苷、黃芪、地黃、天花粉、麥冬、五味子、枸杞子、覆盆子、山藥、茯苓和澤瀉11味藥味組成，具滋陰、健脾、補(bǔ)腎之功效，臨床上單獨(dú)使用或作為輔助中藥制劑聯(lián)合降糖西藥治療氣陰兩虛型的2型糖尿病及其并發(fā)癥且具有一定的降糖療效[1-3]。目前，對該制劑的研究主要集中于統(tǒng)計和觀察臨床療效[4-6]、化學(xué)成分分析[7-8]和藥動學(xué)研究[9]等，而對其在體內(nèi)代謝的研究尚無報道。中藥復(fù)方制劑的藥效成分可能是原型成分、代謝產(chǎn)物或兩者的綜合疊加，通過作用于體內(nèi)的相關(guān)靶點(diǎn)發(fā)揮療效。因此，研究藥物在體內(nèi)的代謝，對于揭示其生物活性成分和闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要意義[10]。

中藥復(fù)方制劑由于化學(xué)成分復(fù)雜、體內(nèi)代謝途徑多樣及內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，代謝產(chǎn)物鑒定困難，需要采用具有高選擇性、高分析速度、高分辨率的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，提高色譜對復(fù)雜組分的分離能力和獲得多級質(zhì)譜信息。其中，超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（ultra-high-performance liquid chromatography-quadrupole-electrostatic field orbitaltrap high resolution mass spectrometer， UHPLC- Q-Exactive Orbitrap MS）具高分辨率、檢測限度低、質(zhì)量偏差低和高質(zhì)量精度的優(yōu)勢，可顯著降低樣品基質(zhì)的干擾，已逐漸應(yīng)用于中藥復(fù)方制劑的定性分析。

本研究采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技術(shù)，對大鼠ig給予SJC混懸液后的血漿、膽汁、尿液和糞便樣品中的原型成分及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定，以期為闡明SJC的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和解析其在大鼠體內(nèi)的代謝過程提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Vanquish Flex超高效液相色譜儀、Q-Exactive TM四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（美國Thermo公司），配有電噴霧離子源（ESI）、Trace Finder 4.1工作站及TraceFinder 4.1 General Quan數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；CPA225D型電子分析天平（十萬分之一，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；TGL-16型高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

SJC（批號2004263，0.35 g/粒，河南羚銳制藥股份有限公司）；對照品人參皂苷Rg1（批號G30N10Y104330，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、五味子甲素（批號R12O8F45508，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、人參皂苷Re（批號B04D9S76499，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、黃芪甲苷（批號J25F10T81373，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、茯苓酸（批號P07D10S105271，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%）均購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜級）、乙腈（質(zhì)譜級）、甲酸（質(zhì)譜級），美國Sigma公司；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g，動物生產(chǎn)合格證號SCXK（遼）2020-0001，由沈陽藥科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)溫度為（22±2）℃，飼養(yǎng)環(huán)境相對濕度為50%～60%，光照時間為12 h，自由飲食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。動物實(shí)驗(yàn)倫理審查編號SYPU-IACUC- S2021-06.18-201。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱定人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、五味子甲素、黃芪甲苷和茯苓酸對照品，分別置于10 mL棕色量瓶中，用80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為104.0、97.0、87.0、98.0和92.0 mg/L的對照品儲備液，精密量取以上溶液各0.24 mL，置100 mL棕色量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.250、0.233、0.209、0.235、0.221 mg/L的混合對照品溶液，于4 ℃儲存，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取適量的SJC內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱定，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液（CMC-Na）混懸，配制成質(zhì)量濃度約為210 g/L的供試品溶液。

2.2 分組與給藥

SD大鼠12只，隨機(jī)分為空白組和給藥組（血漿組、膽汁組、尿液/糞便組），每組3只。末次給藥大鼠前禁食12 h，自由飲水，給藥劑量為4.96 g/(kg·d)，每天早、晚2次給藥，連續(xù)給藥3 d?？瞻捉M大鼠ig等體積0.5%的CMC-Na溶液。

2.3 生物樣品采集

2.3.1 血漿組 分別于給藥后0、0.33、0.5、1、3、6、10和24 h自眼眶靜脈叢取血，置于預(yù)先用肝素鈉處理的EP管中，4000 r/min離心10 min，取上清液，即得血漿樣品。

2.3.2 膽汁組 將大鼠麻醉后，膽管插管術(shù)按時間段0～2、2～4、4～8、8～12、12～24 h收集大鼠給藥后24 h內(nèi)的膽汁樣品。

2.3.3 尿液/糞便組 給藥后，立即將大鼠置于代謝籠中，分別按時間段0～4、4～8、8～12、12～24、24～48 h和時間段0～6、6～12、12～24、24～48 h收集48 h內(nèi)的尿液樣品和糞便樣品。以上樣品收集后均于?20 ℃冰箱保存。

2.4 生物樣品預(yù)處理

2.4.1 血漿樣品預(yù)處理 分別取給藥后8個時間點(diǎn)的血漿各100 μL，共800 μL，置于EP管中，渦旋混勻1 min，加3.2 mL甲醇，渦旋混勻2 min，于4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，上清液于室溫下氮?dú)獯蹈桑瑲堅?00 μL 80%甲醇水復(fù)溶，4 ℃12 000 r/min離心10 min，離心2次，取上清，進(jìn)樣分析。

2.4.2 膽汁樣品預(yù)處理 按體積比（各時間段采集生物樣品體積占總量的體積比例）取各時間段膽汁樣品共1 mL，置于EP管中，渦旋混勻1 min，加2 mL甲醇，渦旋混勻2 min，于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，上清液于室溫下氮?dú)獯蹈?，膽汁殘渣? mL 60%甲醇水復(fù)溶，于4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，離心2次，取上清，即得膽汁樣品，進(jìn)樣分析。

2.4.3 尿液和糞便樣品預(yù)處理 按體積比取各時間段尿液樣品共1 mL，置于EP管中，渦旋混勻1 min，加2 mL甲醇，渦旋混勻2 min，于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，上清液于室溫下氮?dú)獯蹈?，尿液殘渣?00 μL 60%甲醇水復(fù)溶，于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，離心2次，取上清，即得尿液樣品。將各時間段給藥糞便烘干，研磨混勻，按比例（各時間段稱取的生物樣品質(zhì)量占總量的質(zhì)量比例）稱取各時間段糞便共1.0 g，加5 mL 60%甲醇，超聲提取30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，離心2次，取上清，氮?dú)獯蹈桑瑲堅? mL 60%甲醇水復(fù)溶，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，離心2次，取上清，進(jìn)樣分析。

2.5 檢測條件

2.5.1 色譜條件 色譜柱：采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～15.5 min，8%～35% B；15.5～32.5 min，35%～95% B；32.5～32.6 min，95%～8% B；32.6～35.6 min，8% B）；體積流量0.2 mL/min；柱溫35 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

2.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；正負(fù)離子模式；數(shù)據(jù)采集模式：全掃描和自動觸發(fā)二級質(zhì)譜掃描（Full MS/dd-MS2）；掃描范圍為100～1500，一級質(zhì)譜分辨率70 000，二級質(zhì)譜分辨率17 500；噴霧電壓正負(fù)離子模式下分別為3.8、3.0 kV；碰撞能量（CE）為20、35、60 eV；脫溶劑氣體溫度正負(fù)離子模式下分別為310、350 ℃，毛細(xì)管溫度正負(fù)離子模式下分別為320、350 ℃。

2.6 數(shù)據(jù)處理

采用TraceFinder 4.1 General Quan data processing system和Xcalibur 2.1工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理，代謝物的分子式通過Xcalibur 2.1軟件在質(zhì)量偏差5×10?6內(nèi)推測。通過查閱SJC化學(xué)成分的相關(guān)文獻(xiàn)，建立包含化合物名稱、分子式、精確相對分子質(zhì)量、一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)的代謝物數(shù)據(jù)庫以快速篩選和鑒定SJC在大鼠體內(nèi)的代謝物。

3 結(jié)果

采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技術(shù)對大鼠ig給予SJC混懸液后的生物樣品進(jìn)行分析。結(jié)合對照品、SJC中化學(xué)成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律和代謝物數(shù)據(jù)庫，共鑒定出125個化合物，包括47個原型成分（PA1～PF）和78個代謝產(chǎn)物（MA1～ME14），并發(fā)現(xiàn)了2個新代謝產(chǎn)物和4個新化合物。SJC在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物在正、負(fù)離子模式下扣除空白后的總離子流圖見圖1。代謝物具體信息見表1、2。

a-血漿 b-膽汁 c-尿液 d-糞便

表1 參芪降糖膠囊在大鼠體內(nèi)的原型成分

續(xù)表1

“*”經(jīng)與對照品比對；P-血漿 B-膽汁 U-尿液 F-糞便，下表同

“*” Compare with reference substance; P-Plasma; B-Bile; U-Urine; F-Feces, same as table below

3.1 原型成分鑒定

3.1.1 皂苷類成分 化合物PA1～PA16是皂苷類化合物。其中，化合物PA1與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[11]及相應(yīng)對照品的保留時間和質(zhì)譜裂解碎片比較，被鑒定為人參皂苷Re；PA9保留時間為19.30 min，準(zhǔn)分子離子峰 [M＋Na]+/807.444 40，碎片離子為/627.386 78 [M＋Na－C6H10O5－H2O]+，經(jīng)與對照品比對，鑒定為黃芪甲苷，見圖2。

3.1.2 黃酮類成分 化合物PB1～PB6是黃酮類化合物。PB6的保留時間為18.89 min，準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+/269.079 10，碎片離子/254.055 36 [M＋H－CH3]+、237.053 33 [M＋H－OH－CH3]+和213.089 94 [M＋H－2CO]+與文獻(xiàn)報道結(jié)果相符[12]，推測PB6為芒柄花素。

3.1.3 木脂素類成分 化合物PC1～PC7是木脂素類化合物，PC4保留時間為28.29 min，準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+/417.224 88，碎片離子為/402.200 96 [M＋H－CH3]+、386.207 28 [M＋H－OCH3]+、316.129 61 [M＋H－C5H10－OCH3]+和301.106 23 [M＋H－C5H10－OCH3－CH3]+，經(jīng)與對照品比對，鑒定為五味子甲素，見圖3。

3.1.4 三萜類成分 化合物PD1～PD14是三萜類化合物。化合物PD13與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[13]及相應(yīng)對照品的保留時間和質(zhì)譜裂解碎片比較，鑒定為茯苓酸。

3.1.5 酚酸類成分 化合物PE1～PE3是酚酸類化合物，PE1的保留時間為3.12 min，準(zhǔn)分子離子峰 [M－H]?/153.019 00，碎片離子/109.028 85 [M－H－COOH]?與文獻(xiàn)報道結(jié)果相符[14]，推測PE1為原兒茶酸。

原型成分PA2～PA8、PA10～PA16、PB1～PB5、PC1～PC3、PC5～PC7、PD1～PD12、PD14、PE2、PE3和PF的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的質(zhì)譜數(shù)據(jù)相符[15-25]。具體的質(zhì)譜信息見表1。

3.2 代謝產(chǎn)物鑒定

3.2.1 皂苷類代謝產(chǎn)物 皂苷類成分在大鼠體內(nèi)主要發(fā)生Ⅰ相代謝，包括脫糖基、脫羥基和還原等反應(yīng)。在大鼠體內(nèi)共檢測到10個皂苷類代謝產(chǎn)物（MA1～MA10），其來源及碎片離子信息見表2。以PA9（黃芪甲苷）為例分析皂苷類成分的代謝途徑。MA1～MA5是PA9的相關(guān)代謝產(chǎn)物。MA1準(zhǔn)分子離子峰 [M＋Na]+/513.354 74，較PA9減少294且含碎片離子/495.343 11 [M＋Na－H2O]+和477.337 01 [M＋Na－2H2O]+，推測是PA9水解產(chǎn)物：環(huán)黃芪醇[26]；MA2準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+/471.344 88，較MA1減少20，推測是MA1脫水脫氫產(chǎn)物[27]；MA3準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+/469.366 27，較MA1減少22，含碎片離子/451.355 59 [M＋H－H2O]+和433.347 11 [M＋H－2H2O]+，推測是MA1雙脫水后甲基化產(chǎn)物[26]；MA4準(zhǔn)分子離子峰 [M＋Na]+/499.340 09，較MA1減少14且兩者碎片均相差14，推測是MA1脫甲基產(chǎn)物，同理可推MA5是MA4脫甲基產(chǎn)物[26]。

表2 參芪降糖膠囊在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物

續(xù)表2

續(xù)表2

圖2 PA9 (黃芪甲苷) 二級質(zhì)譜圖

3.2.2 黃酮類代謝產(chǎn)物 黃酮類化合物在大鼠體內(nèi)主要發(fā)生脫甲基、脫羥基和還原等Ⅰ相代謝反應(yīng)，葡萄糖醛酸化和硫酸酯化等Ⅱ相代謝反應(yīng)。在大鼠體內(nèi)共檢測到31個黃酮類代謝產(chǎn)物（MB1～MB31），其來源及碎片離子信息見表2。以PB6（芒柄花素）為例分析黃酮類成分的代謝途徑。MB2～MB12是PB6的相關(guān)代謝產(chǎn)物。MB2、MB5和MB9為Ⅰ相代謝產(chǎn)物，MB3、MB4、MB6～MB8和MB10～MB12為Ⅱ相代謝產(chǎn)物。MB2準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+/255.063 66，較PB6減少14，推測是PB6脫甲基產(chǎn)物：大豆苷元[28]；MB9準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+/243.101 15，較MB2減少12，推測是MB2脫飽和后氫化還原產(chǎn)物雌馬酚[29]；MB5的準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+/271.094 85，較PB6增加2，推測是PB6的氫化還原產(chǎn)物[27]；MB8準(zhǔn)分子離子峰 [M－H]?/333.008 00，較MB2增加80且含碎片離子/253.049 36 [M－H－SO3H]?，推測是MB2硫酸酯化產(chǎn)物[29]，MB3準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+/445.111 11，較PB6增加176且含碎片離子/269.079 13 [M＋H－C6H8O6]+，推測是PB6葡萄糖醛酸化產(chǎn)物，同理可推MB4是PB6硫酸酯化產(chǎn)物[27]，MB6和MB7分別是MB5的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物和硫酸酯化產(chǎn)物，MB10和MB11分別是MB9的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物和硫酸酯化產(chǎn)物[29]；MB12準(zhǔn)分子離子峰 [M－H]?/337.039 18，相對分子質(zhì)量較MB9增加96且含碎片離子/257.080 78 [M－H－SO3H]?，推測是MB9羥基化后硫酸酯化產(chǎn)物[29]。

圖3 PC4 (五味子甲素) 二級質(zhì)譜圖

3.2.3 木脂素類代謝產(chǎn)物 木脂素類化合物在大鼠體內(nèi)主要發(fā)生脫甲基、脫羥基、羥基化和脫水等Ⅰ相代謝反應(yīng)。在大鼠體內(nèi)共檢測到19個木脂素類代謝產(chǎn)物（MC1～MC19），其來源及碎片離子信息見表2。以PC4（五味子甲素）為例分析木脂素類成分的代謝途徑。MC4～MC16是PC4的相關(guān)代謝產(chǎn)物，通過SciFinder檢索發(fā)現(xiàn)，MC14和MC16是新化合物，MC15是未曾報道過的五味子甲素的新代謝產(chǎn)物。MC4準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+/401.193 45，較PC4減少16，含碎片離子/386.168 79 [M＋H－CH3]+、370.174 84 [M＋H－OCH3]+和355.151 21 [M＋H－OCH3－CH3]+，推測是PC4脫甲氧基和氧化產(chǎn)物[30]；MC5準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+/415.173 80，較MC4增加14，含碎片離子385.162 51 [M＋H－2CH3]+、371.146 70 [M＋H－CHO－CH3]+和356.124 60 [M＋H－2CH3－CHO]+，推測是MC4醛基化產(chǎn)物[30]；MC6準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+/389.194 82，較PC4減少28，推測是PC4雙脫甲基產(chǎn)物[30]；MC7準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+/421.184 30，較MC6增加32，推測為MC6雙羥基化產(chǎn)物；MC8準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+/435.200 74，較PC4增加18，含碎片離子417.189 18 [M＋H－H2O]+、385.162 84 [M＋H－H2O－CH3－OH]+和359.147 61 [M＋H－C2H4O－CH3－OH]+，推測是PC4脫甲基后雙羥基化產(chǎn)物[31]；MC9準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+/401.194 40，較MC8減少14，含碎片離子386.170 81 [M＋H－CH3]+、370.174 87 [M＋H－OCH3]+和355.151 21 [M＋H－OCH3－CH3]+，推測是MC8的脫水脫羥基產(chǎn)物；MC11、MC12、MC13和MC10是同分異構(gòu)體且碎片離子相似，因前三者保留時間相近，故推測MC11、MC12、MC13是PC4的單脫甲氧基和羥基化產(chǎn)物，MC10最后出鋒，較PC4減少14，推測MC10是PC4的脫甲基產(chǎn)物[31]。

MC14的保留時間為21.17 min，準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+/389.193 51，根據(jù)Xcalibur軟件在5×10?6的質(zhì)量偏差范圍內(nèi)推測其分子式為C22H28O6，與PC4相差28，推測是PC4羥基化后連續(xù)脫甲氧基、脫甲基產(chǎn)物。根據(jù)木脂素類化合物裂解規(guī)律進(jìn)行碎片裂解。碎片離子/374.169 74 [M＋H－CH3]+、357.168 09 [M＋H－CH3－OH]+、326.149 41 [M＋H－CH3－OH－OCH3]+、288.097 11 [M＋H－CH3－C5H10O]+、342.144 99 [M＋H－2CH3－OH]+和273.074 22 [M＋H－2CH3－C5H10O]+，推測MC14是PC4羥基化后連續(xù)脫甲氧基、脫甲基產(chǎn)物，與Xcalibur軟件推測結(jié)果一致。根據(jù)ChemDraw軟件將其命名為(6,7)-2,3,10,11-tetramethoxy-6,7- dimethyl-5,6,7,8-tetrahydrodibenzo[a,c][8]annulene-1,7-diol。MC14的質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律見圖4。

圖4 MC14的質(zhì)譜圖及可能的裂解規(guī)律

MC15的保留時間為21.04 min，準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+/565.226 75，根據(jù)Xcalibur軟件在5×10?6的質(zhì)量偏差范圍內(nèi)推測其分子式為C28H36O12，較MC6增加176，推測是MC6葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。碎片離子/389.193 54 [M＋H－C6H8O6]+證實(shí)葡萄糖醛酸的存在，碎片離子/374.170 78、357.168 09、288.096 98和273.074 40與MC6一致，因此推測MC15是代謝物MC6的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物，即PC4的雙脫甲基后葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。

MC16的保留時間為18.58 min，準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+/375.176 30，根據(jù)Xcalibur軟件在5×10?6的質(zhì)量偏差范圍內(nèi)推測其分子式為C21H26O6，較MC14減少14，推測是MC14脫甲基產(chǎn)物。利用ChemDraw軟件畫出MC14脫掉1分子甲基的結(jié)構(gòu)并進(jìn)行碎片裂解，碎片離子/358.167 18 [M＋H－OH]+、343.152 13 [M＋H－OH－CH3]+、311.126 46 [M＋H－H2O－OCH3－CH3]+、287.089 39 [M＋H－C3H6－OCH3－CH3]+、273.074 16 [M＋H－C4H8O－2CH3]+、241.048 03 [M＋H－C6H12O－2OH]+和213.053 31 [M＋H－C6H12O－2OCH3]+，推測是MC14脫甲基產(chǎn)物，與Xcalibur軟件推測結(jié)果一致。通過ChemDraw軟件得到其化學(xué)名為(6,7)-2,3,10- trimethoxy-6,7-dimethyl-5,6,7,8-tetrahydrodibenzo[a,c][8]annulene-1,7,11-triol。MC16的質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律見圖5。

3.2.4 三萜類代謝產(chǎn)物 三萜類化合物在大鼠體內(nèi)主要以原型形式存在，在生物樣品中共檢測到4個三萜類相關(guān)代謝產(chǎn)物（MD1～MD4），經(jīng)SciFinder檢索，其中MD1和MD4是新化合物，MD3是未曾報道過的去氫茯苓酸的新代謝產(chǎn)物。

MD1的保留時間為26.12 min，準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+/467.311 43，根據(jù)Xcalibur軟件在5×10?6的質(zhì)量偏差范圍內(nèi)推測其分子式為C30H42O4，與PD6（茯苓新酸B）相差18，推測為PD6脫水產(chǎn)物。利用ChemDraw軟件對其進(jìn)行碎片裂解，MD1脫去1分子羥基得碎片離子/449.302 37、支鏈上雙鍵斷裂得碎片離子/425.265 26和失去側(cè)鏈得碎片離子/325.214 94，故推測是PD6脫水代謝產(chǎn)物，與Xcalibur軟件推測結(jié)果一致。根據(jù)ChemDraw軟件得到其化學(xué)名為()-2-((3,3a,6, 7,9b)-6-(2-carboxyethyl)-3a,6,9b-trimethyl-7-(prop-1-en-2-yl)-3a,4,6,7,8,9b-hexahydro-3-cyclopenta[a] naphthalen-3-yl)-6-methylhept-5-enoic acid。MD1的質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律見圖6。

圖5 MC16的質(zhì)譜圖及可能的裂解規(guī)律

MD3的保留時間為13.11 min，準(zhǔn)分子離子峰 [M－H]?/605.31665，根據(jù)Xcalibur軟件在5×10?6的質(zhì)量偏差范圍內(nèi)推測其分子式為C33H50O8S，比PD12（去氫茯苓酸）相對分子質(zhì)量高80，碎片離子/525.358 76 [M－H－SO3H]?證實(shí)硫酸酯的存在，因此推測MD3是PD12硫酸酯化產(chǎn)物。

MD4的保留時間為26.36 min，準(zhǔn)分子離子峰 [M＋H]+/345.278 14，根據(jù)Xcalibur軟件在5×10?6的質(zhì)量偏差范圍內(nèi)推測其分子式為C23H36O2，利用ChemDraw軟件畫出PD12酯鍵斷裂并失去側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)進(jìn)行碎片裂解，碎片離子/327.266 88 [M＋H－H2O]+和309.256 59 [M＋H－2H2O]+，推測是PD12結(jié)構(gòu)上酯鍵斷裂并失去側(cè)鏈的產(chǎn)物。根據(jù)ChemDraw軟件得到其化學(xué)名為(3,5,10,13, 14,16,17)-4,4,10,13,14,17-hexamethyl-2,3,4,5,6, 10,12,13,14,15,16,17-dodecahydro-1-cyclopenta[a] phenanthrene-3,16-diol。MD4的質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律見圖7。

圖6 MD1的質(zhì)譜圖及可能的裂解規(guī)律

圖7 MD4的質(zhì)譜圖及可能的裂解規(guī)律

3.2.5 酚酸類代謝產(chǎn)物 酚酸類化合物在大鼠體內(nèi)主要發(fā)生脫甲基、脫羥基和水解反應(yīng)等Ⅰ相代謝反應(yīng)，硫酸酯化和甲基化等Ⅱ相代謝反應(yīng)。在體內(nèi)共檢測到14個酚酸類代謝產(chǎn)物（ME1～ME14），其來源及碎片離子信息見表2。以PE1（原兒茶酸）為例分析酚酸類成分的代謝途徑。ME1-ME4是PE1的相關(guān)代謝產(chǎn)物。ME1準(zhǔn)分子離子峰 [M－H]?/216.980 09，較PE1增加64且含碎片離子/137.023 56 [M－H－SO3H]?，推測是PE1脫羥基后硫酸酯化產(chǎn)物；ME2準(zhǔn)分子離子峰 [M－H]?/230.996 26，較ME1增加14，推測是ME1的甲基化產(chǎn)物；ME3準(zhǔn)分子離子峰 [M－H]?/188.985 06較PE1增加36且含碎片離子/109.028 79 [M－H－SO3H]?，推測是PE1脫羧基后硫酸酯化產(chǎn)物，同理推測ME4為PE1脫羧基后羥基化后與硫酸酯結(jié)合產(chǎn)物。

4 討論

本研究基于文獻(xiàn)報道和課題組前期研究，采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技術(shù)，在正、負(fù)離子模式下，對大鼠ig給予SJC后的生物樣品進(jìn)行鑒定。血漿中檢測到19個原型和21個代謝產(chǎn)物；膽汁中檢測到5個原型和31個代謝產(chǎn)物；尿液中檢測到4個原型和44個代謝產(chǎn)物；糞便中檢測到39個原型和37個代謝產(chǎn)物。

根據(jù)代謝物結(jié)構(gòu)種類，將其分為5類，皂苷類、黃酮類、木脂素類、三萜類和酚酸類。其中，木脂素類和三萜類化合物在正離子模式下響應(yīng)較好，皂苷類和有機(jī)酸類化合物在負(fù)離子模式下響應(yīng)較好，黃酮類化合物在正、負(fù)離子模式下響應(yīng)均較好，為盡可能全面獲得SJC體內(nèi)代謝產(chǎn)物信息，本研究選擇在正、負(fù)離子2種模式下進(jìn)行檢測。

藥物進(jìn)入機(jī)體后主要經(jīng)肝臟和胃腸道代謝，代謝產(chǎn)物由腎臟經(jīng)尿液排出，一些生物利用度低的藥物主要由糞便排出。在SJC中，皂苷類成分來源于君藥人參莖葉總皂苷和黃芪，分子結(jié)構(gòu)中常含有多個羥基和糖基，易發(fā)生脫羥基和脫糖基等Ⅰ相代謝反應(yīng)。本研究中，檢測到的皂苷類成分主要以原型形式經(jīng)糞便排泄，吸收入血的成分較少。經(jīng)分析，原因其一是中藥復(fù)方化學(xué)成分復(fù)雜，各成分所占的配比低，含量較低，不易檢測；其二是皂苷類成分極性大且相對分子質(zhì)量大，在胃腸道吸收性差，生物利用度低；其三是由于在樣品前處理過程中某些成分在血漿中回收率較低，沒有檢測到。黃酮類成分主要來源于君藥黃芪，母核結(jié)構(gòu)上常含有甲氧基和羥基，易發(fā)生脫甲基化、脫羥基化、脫甲氧基化和還原等Ⅰ相代謝反應(yīng)及在Ⅰ相代謝物基礎(chǔ)與葡萄糖醛酸或硫酸結(jié)合，使極性增大，經(jīng)尿液和膽汁排泄。黃酮類化合物在體內(nèi)經(jīng)某些代謝酶作用可發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，如黃芪中代表性成分毛蕊異黃酮、芒柄花素、黃豆黃素和大豆苷元，毛蕊異黃酮通過脫羥基轉(zhuǎn)變?yōu)槊⒈ㄋ?，再繼續(xù)脫甲基轉(zhuǎn)變?yōu)榇蠖管赵?，黃豆黃素脫甲氧基也可轉(zhuǎn)變?yōu)榇蠖管赵?，故四者具有共同的代謝物群。木脂素類化合物來源于五味子，具有聯(lián)苯環(huán)辛烯型的母核結(jié)構(gòu)且含有多個甲氧基和羥基，易發(fā)生脫水、脫甲基、脫甲氧基、脫羥基、羥基化和脫亞甲基等反應(yīng)，其脂溶性較強(qiáng)，ig給藥后在大鼠胃腸道的吸收較好，生物利用度較高，主要以原型和Ⅰ相代謝物形式存在于血漿和膽汁中。三萜類化合物主要來源于澤瀉和茯苓藥味，脂溶性較強(qiáng)，主要以原型形式在血漿中被檢測到并經(jīng)糞便排泄。酚酸類化合物分子結(jié)構(gòu)中常含有多個羥基和羧基，在體內(nèi)易與葡萄糖醛酸和硫酸結(jié)合，主要在膽汁中以Ⅱ相代謝物形式存在。

綜上，本研究利用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS方法，首次從ig給予SJC的大鼠血漿、膽汁、尿液和糞便樣品中鑒定出125個化合物，包括47個原型和78個代謝產(chǎn)物，經(jīng)SciFinder檢索，其中2個為新代謝產(chǎn)物，4個為新化合物。本文初步闡明SJC的體內(nèi)代謝特征，為明確SJC的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和進(jìn)一步闡明其活性成分作用機(jī)制及臨床合理用藥提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 張蕾, 王雷雷, 黎明東, 等. 參芪降糖顆粒輔助治療氣陰兩虛型2型糖尿病臨床研究 [J]. 新中醫(yī), 2019, 51(4): 166-168.

[2] Li R L, Dong T W, Wei J G,. Meta-analysis of the therapeutic effect of Shenqi Jiangtang Granule on type 2 diabetes mellitus [J]., 2020, 2020: 5754823.

[3] 趙能江, 楊叔禹, 李博, 等. 參芪降糖顆粒治療2型糖尿病臨床應(yīng)用專家共識[J]. 中草藥, 2020, 51(17): 4383-4387.

[4] 楊迎. 參芪降糖膠囊聯(lián)合格列本脲片治療2型糖尿病的療效觀察 [J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2015, 30(2): 161-165.

[5] Li T L, Li H Z, Wu Y,. Efficacy and safety of Shenqi Jiangtang Granules plus oral hypoglycemic agent in patients with type 2 diabetes mellitus: A protocol for systematic review and meta-analysis of 15 RCTs [J]., 2021, 100(5): e23578.

[6] 鄭諶, 朱俊, 何先鳳, 等. 參芪降糖顆粒合吡格列酮二甲雙胍對糖尿病合并代謝綜合征的影響[J]. 世界中醫(yī)藥, 2022, 17(2): 237-242.

[7] 張慧, 張曉靜, 姜慧潔, 等. UPLC-Q-TOF MS/MS法分析參芪降糖顆?；瘜W(xué)成分 [J]. 中成藥, 2017, 39(10): 2101-2108.

[8] 王倩, 李冰冰, 黃文靜, 等. 基于2種色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的參芪降糖顆粒化學(xué)成分分析 [J]. 中草藥, 2021, 52(6): 1568-1581.

[9] Zhang H, Chen R Y, Xu C,. Simultaneous determination of saponins and lignans in rat plasma by UPLC-MS/MS and its application to a pharmacokinetic study of Shenqi Jiangtang Granule [J]., 2021, 22(3): 224-231.

[10] Chen W Y, Liang G Y, Zheng Z L,. UPLC-ESI-Q-TOF/MS based metabolic profiling of protosappanin B in rat plasma, bile, feces, urine and intestinal bacteria samples [J]., 2021, 22(6): 491-499.

[11] Xie H L, Wang D X, Zhang W J,. Comparative pharmacokinetic studies of four ginsenosides in rat plasma by UPLC-MS/MS after oral administration of-andextracts [J]., 2019, 2019: 4972816.

[12] 劉亞麗, 魏韶鋒, 宋永貴, 等. UPLC/Q-TOF-MS/MS法分析豐城雞血藤中刺芒柄花素在大鼠腸道菌群中的代謝 [J]. 中國新藥雜志, 2015, 24(23): 2715-2723.

[13] 楊慧敏, 楊彪, 胡玉梅, 等. 基于 UPLC-ESI-Q-TOF- MS/MS 技術(shù)的桂枝茯苓膠囊化學(xué)成分分析 [J]. 中國中藥雜志, 2020, 45(4): 861-877.

[14] 陳家全, 王慧, 李冬玉, 等. 原兒茶酸在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物的分析 [J]. 中成藥, 2017, 39(3): 561-564.

[15] Yang L, Deng Y H, Xu S J,.pharmacokinetic and metabolism studies of ginsenoside Rd [J]., 2007, 854(1/2): 77-84.

[16] 王若柳, 王海強(qiáng), 范驍輝, 等. LC-Q-TOF-MS和LC-IT-MS分析參麥注射液中化學(xué)成分 [J]. 中國中藥雜志, 2020, 45(3): 555-564.

[17] Li Y, Peng Y, Wang M Y,. Rapid screening and identification of the differences between metabolites ofandwater extract in rats by UPLC-Q-TOF-MS combined pattern recognition analysis [J]., 2016, 131: 364-372.

[18] Simons A L, Renouf M, Hendrich S,. Metabolism of glycitein (7,4′-dihydroxy-6-methoxy-isoflavone) by human gut microflora [J]., 2005, 53(22): 8519-8525.

[19] 雷艷, 劉傳鑫, 李尹, 等. 基于UPLC-Q-TOF-MSE的玉泉丸化學(xué)成分表征 [J]. 中藥材, 2020, 43(7): 1639-1646.

[20] Wang J Y, Jiang B, Shan Y Y,. Metabolic mapping oflignans and their metabolites in rats using a metabolomic approach based on HPLC with quadrupole time-of-flight MS/MS spectrometry [J]., 2020, 43(2): 378-388.

[21] 李偉, 宋永貴, 劉匡一, 等. UHPLC-QTOF/MSE與代謝組學(xué)技術(shù)對北五味子炮制前后化學(xué)成分遷移研究 [J]. 藥學(xué)學(xué)報, 2016, 51(9): 1445-1450.

[22] 方瀟, 丁曉萍, 陳林霖, 等. 茯苓皮中三萜類化學(xué)成分的HPLC-LTQ-Orbitrap分析 [J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2019, 30(9): 2117-2121.

[23] 鄧岳, 劉阿娜, 王小明, 等. HPLC-TOF-MS分析澤瀉提取物中三萜類化合物 [J]. 化學(xué)分析計量, 2015, 24(6): 11-14.

[24] Wang X Y, Yan K J, Ma X H,. Simultaneous determination and pharmacokinetic study of protocatechuic aldehyde and its major active metabolite protocatechuic acid in rat plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J]., 2016, 54(5): 697-705.

[25] 雷冬梅, 姚長良, 陳雪冰, 等. 基于RP-Q-TOF-MS和HILIC-Q-TOF-MS的經(jīng)典名方當(dāng)歸補(bǔ)血湯成分分析 [J]. 中國中藥雜志, 2022, 47(8): 2109-2120.

[26] 劉曉亞. 黃芪甲苷和環(huán)黃芪醇的體內(nèi)外代謝研究 [D]. 北京: 北京中醫(yī)藥大學(xué), 2013.

[27] 賈璐. 黃芪建中湯化學(xué)成分體內(nèi)代謝研究 [D]. 太原: 山西大學(xué), 2020.

[28] Ding Y, Chen S T, Wang H L,. Identification of secondary metabolites inby UPLC-Q-exactive-orbitrap MS [J]., 2021, 2021: 1-8.

[29] Huang J, Chen H Y, Li C Y,. Screening and identification of the metabolites of water extracts of raw and honey-processedin rat urine based on UHPLC/ESI-Q-TOF-MS and multivariate statistical analysis [J]., 2018, 29(9): 1919-1935.

[30] 蘇聯(lián)麟, 程雪, 季德, 等. 基于UHPLC-QTOF/MS技術(shù)的生、醋五味子醇提物在大鼠血漿、膽汁、尿液、糞便中藥物原形成分及其代謝產(chǎn)物的分析鑒定 [J]. 藥學(xué)學(xué)報, 2016, 51(10): 1600-1608.

[31] Zhang H Z, Jiang Y M, Wu J J,. Metabolic mapping ofextract and its active lignans using a metabolomic approach based on ultra high performance liquid chromatography with high-resolution mass spectrometry [J]., 2017, 40(2): 574-586.

Identification of metabolites of Shenqi Jiangtang Capsules in rats based on UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS

YUAN Nan-nan, WANG Hong-jin, SUN Qi, ZHAO Lei, BAI Hua-fang, SUN Li-xin

College of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Benxi 117004, China

To investigate the metabolites and their major metabolic pathways of Shenqi Jiangtang Capsules (SJC, 參芪降糖膠囊) in rat plasma, bile, urine and feces biological samples.Based on UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS technology, gradient elution was carried out with 0.1% formic acid solution (A)-acetonitrile (B) as the mobile phase, and full scanning and secondary mass spectrometry scanning were carried out with ESI ion source in positive and negative ion modes, respectively, to obtain the primary and secondary mass spectrometry data of the compounds. Combined with literature reports, the fragmentation pattern of reference substance and the law of drug metabolism reaction, the biological samples of rats after ig administration of SJC suspension were analyzed and identified.A total of 125 compounds were identified in rats, including 47 prototype components (PA1—PF) and 78 metabolites (MA1—ME14), of which two were novel metabolites, namely MC15 (glucuronic acid product after di-demethylation of schizandrin A) and MD3 (sulfuric acid esterification product of dehydropachymic acid), and four were new compounds, namely (6,7)-2,3,10,11-tetramethoxy-6,7-dimethyl-5,6,7,8-tetrahydrodibenzo[a,c][8] annulene-1,7-diol (MC14), (6,7)-2,3,10-trimethoxy-6,7-dimethyl-5,6,7,8-tetrahydrodibenzo [a,c][8]annulene-1,7,11-triol (MC16), ()-2-((3,3a,6,7,9b)-6-(2-carboxyethyl)-3a,6,9b-trimethyl-7-(prop-1-en-2-yl)-3a,4,6,7,8,9b-hexa hydro-3-cyclopenta[a] naphthalen- 3-yl)-6-methylhept-5-enoic acid (MD1) and (3,5,10,13,14,16,17)-4,4,10,13,14,17-hexamethyl-2,3,4,5,6,10,12,13,14,15, 16,17-dodecahydro-1-cyclopenta[a]phenanthrene-3,16-diol (MD4).Research revealed that dehydroxylation, demethylation, dehydration, hydrolysis, reductive hydrogenation, methylation, glucuronidation and sulfation were the main metabolic pathways of SJC in rat samples. The preliminarily clarifiedmetabolic characteristics of SJC provided a reference for exploring bioactive ingredients and action mechanisms of SJC.

Shenqi Jiangtang Capsules; UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS; metabolites; metabolic pathways; astragaloside IV; formononetin; schizandrin A

R284.1

A

0253 - 2670(2023)22 - 7358 - 16

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.22.013

2023-03-18

遼寧省教育廳“遼寧特聘教授滾動支持項(xiàng)目”（遼教函［2018］35號）

苑楠楠（1995—），女，碩士，研究方向?yàn)樗幬锓治觥el: (024)43520599 E-mail: ynn950921@163.com

通信作者：孫立新（1967—），女，博士，教授，研究方向?yàn)樗幬锓治觥el: (024)43520599 E-mail: slx04@163.com

[責(zé)任編輯 王文倩]