劉超賀，龐秀琴#，李成功，許靜蕾，錢(qián)曉莉，常雅萍，楊志斌，楊銀河，王家鵬，肖 懷

藥用昆蟲(chóng)凹紋胡蜂化學(xué)成分及抗炎活性研究

劉超賀1，龐秀琴1#，李成功2，許靜蕾1，錢(qián)曉莉1，常雅萍1，楊志斌1，楊銀河1，王家鵬1*，肖 懷1*

1. 云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 671000 2. 祥云縣綜合檢驗(yàn)檢測(cè)院，云南 祥云 672100

研究藥用昆蟲(chóng)凹紋胡蜂的化學(xué)成分及其抗炎活性。采用硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠和半制備高效液相等色譜技術(shù)進(jìn)行分離純化，通過(guò)核磁共振技術(shù)對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征和解析。以脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）聯(lián)合γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7作為炎癥模型，探討提取物及單體對(duì)炎癥因子mRNA表達(dá)的影響。從凹紋胡蜂醋酸乙酯部位分離鑒定了16個(gè)化合物，分別為鄰苯二酚（1）、對(duì)羥基苯甲醛（2）、對(duì)羥基苯丙酸甲酯（3）、4-羥基苯醋酸乙酯（4）、3,4-二羥基苯乙醇（5）、3,4-二羥基苯酰乙醇（6）、3,4-二羥基苯甲酸（7）、-乙酰基-2-乙氧基-2-(3,4-二羥基苯基)乙胺（8）、2-(2-羥基丙酰氧基)丙酸甲酯（9）、對(duì)甲氧基苯甲醇（10）、3,4-二羥基苯甲酸甲酯（11）、α-乙基葡萄糖苷（12）、2-羥基-3-苯基丙酸甲酯（13）、-乙?；?2-(3,4-二羥基苯基)乙胺（14）、對(duì)甲基苯乙醇（15）和胸腺嘧啶（16）。凹紋胡蜂醇提物及提取物醋酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位在300 μg/mL時(shí)均能有效減少由LPS聯(lián)合IFN-γ誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，）基因相對(duì)表達(dá)量；化合物2、3、5、6、9～11對(duì)LPS聯(lián)合IFN-γ誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，）mRNA表達(dá)有抑制作用（＜0.01）。凹紋胡蜂醇提物及不同極性部位能降低炎癥細(xì)胞中的表達(dá)，具有一定的抗炎作用。化合物1～16均為首次從凹紋胡蜂分離鑒定，其中2、3、5、6、9～11可能為潛在的活性單體。

凹紋胡蜂；抗炎活性；對(duì)羥基苯甲醛；3,4-二羥基苯乙醇；2-(2-羥基丙酰氧基)丙酸甲酯；對(duì)甲氧基苯甲醇

凹紋胡蜂Smith為膜翅目胡蜂科胡蜂屬昆蟲(chóng)，民間俗稱葫蘆蜂、白腳蜂、吊包蜂等，是《中國(guó)藥典》記載胡蜂酒的原藥材物種之一，多以干燥成蟲(chóng)入藥，性味甘、辛、涼，能祛風(fēng)除濕，解毒，用于治療胸腹脹痛、干嘔、急性風(fēng)濕和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。凹紋胡蜂中含有豐富的蛋白質(zhì)和外源必需氨基酸，可作為滋補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)品[1-2]。蜂房和蜂巢中的黃酮、多酚和多糖有強(qiáng)抗氧化活性[3-4]。目前，該昆蟲(chóng)已實(shí)現(xiàn)規(guī)模化、標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖，成為西南地區(qū)的產(chǎn)業(yè)化昆蟲(chóng)。

《中國(guó)藥典》2020年版一部記載：“胡蜂酒用于風(fēng)濕閉阻所致的痹病，急性風(fēng)濕病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎”[5]，云南省很多少數(shù)民族尤其是景頗族長(zhǎng)期采用胡蜂泡制的胡蜂酒來(lái)預(yù)防和治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。研究表明蜂毒中的多肽類(lèi)、酶類(lèi)和非肽類(lèi)等物質(zhì)具有抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛和免疫調(diào)節(jié)等作用[6-7]，胡蜂粗毒可以通過(guò)免疫調(diào)節(jié)和抑制炎癥因子改善類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，還能改善膠原誘導(dǎo)性類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)指數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹及滑膜炎癥等癥狀[8]，抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖[9-10]，但對(duì)胡蜂蟲(chóng)體的化學(xué)成分研究鮮有報(bào)道。課題組對(duì)凹紋胡蜂進(jìn)行物質(zhì)基礎(chǔ)及活性篩選研究，以期探尋其中的潛在活性組分或單體。本研究報(bào)道了凹紋胡蜂乙醇提取物醋酸乙酯部位分離得到的16個(gè)化合物，分別為鄰苯二酚（hydroquinone，1）、對(duì)羥基苯甲醛（4-hydroxy- benzaldehyde，2）、對(duì)羥基苯丙酸甲酯 [methyl 3- (4-hydroxyphenyl)propionate，3]、4-羥基苯醋酸乙酯（4-hydroxyphenethy acetate，4）、3,4-二羥基苯乙醇（3,4-dihydroxyphenethyl alcohol，5）、3,4-二羥基苯酰乙醇（3,4-dihydroxyphenyl ethanol ketone，6）、3,4-二羥基苯甲酸（protocatechuic acid，7）、-乙?；?2-乙氧基-2-(3,4-二羥基苯基)乙胺（divesamides A，8）、2-(2-羥基丙酰氧基)丙酸甲酯[methyl-2- (2-hydroxy-propionyloxy) propionate，9]、對(duì)甲氧基苯甲醇（4-methoxybenzyl alcohol，10）、3,4-二羥基苯甲酸甲酯（protocatechuic acid methyl ester，11）、α-乙基葡萄糖苷（α-ethyl glucoside，12）、2-羥基-3-苯基丙酸甲酯（papuline，13）、-乙?；?2-(3,4-二羥基苯基)乙胺（-acetyl-dopamine，14）、對(duì)甲基苯乙醇 [2-(4-methylphenyl) ethanol，15] 和胸腺嘧啶（thymine，16）。并對(duì)其相應(yīng)的體外抗炎活性進(jìn)行研究。

1 儀器與材料

Bruker AV-400超導(dǎo)核磁共振儀（德國(guó)Bruker公司）；Bruker Compact QTOF質(zhì)譜儀（德國(guó)Bruker公司）；Reveleris?制備型高效液相色譜儀（瑞士BUCHI公司）；熒光定量PCR儀、基因擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

Sephadex LH-20葡聚糖凝膠（美國(guó)GE公司）；柱色譜硅膠（80～100、200～300、300～400目，青島海洋化工廠分廠）；噻唑藍(lán)（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)303H0352）；胎牛血清（Gibco公司，批號(hào)1618862）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7（武漢普諾賽生物科技有限公司）；實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為分析純或色譜純。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，批號(hào)026M4021V，美國(guó)Sigma公司），γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ，批號(hào)061798-1J1221，美國(guó)Peprotech公司）。

凹紋胡蜂原料由云南省德宏州胡蜂養(yǎng)殖基地于2019年11月提供，大理大學(xué)楊自忠教授鑒定為凹紋胡蜂.Smith，模式標(biāo)本（I12075032）保存于大理大學(xué)昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

2 方法

2.1 提取與分離

凹紋胡蜂成蟲(chóng)蟲(chóng)體32 kg，粉碎，95%乙醇室溫浸泡提取4次，合并提取液，減壓濃縮得浸膏，加適量純水混懸，用石油醚、三氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇分別萃取得到5個(gè)萃取部位（A～E）。

醋酸乙酯萃取部位（C，92 g）經(jīng)硅膠柱色譜（200～300目）分離，以石油醚-氯仿（1∶1、3∶7、0∶1）和氯仿-甲醇（25∶1、10∶1、5∶1、1∶1、0∶1）梯度洗脫，TLC檢查合并，得組分C1～C11。組分C3經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜，石油醚-氯仿（1∶1、1∶2、1∶5）及醋酸乙酯-丙酮（1∶1、1∶2、1∶5）梯度洗脫；組分C3-5-4，再通過(guò)半制備高效液相色譜（體積流量17 mL/min，流動(dòng)相：甲醇-水5∶95～95∶5，色譜柱：Sepax bio C18）和Sephadex LH-20凝膠反復(fù)分離得化合物3（5.0 mg）、4（2.5 mg）、9（45.5 mg）和10（17.6 mg）；組分C3-5-5經(jīng)半制備HPLC及LH-20 凝膠分離得到化合物1（3.1 mg）和2（5.8 mg）、C3-5-6反復(fù)分離得化合物11（11.2 mg），C3-5-7分離得化合物13（11.6 mg）；組分C3-7用半制備HPLC及LH-20反復(fù)分離得化合物5（3.4 mg）、6（8.3 mg）和7（9.6 mg）。組分C6過(guò)硅膠柱，氯仿-丙酮（5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5）梯度洗脫得組分C6-1～C6-7，組分C6-3和C6-5采用半制備HPLC分離得到化合物8（6.7 mg）、15（62.8 mg）和16（9 mg）。組分C7過(guò)硅膠柱，以氯仿-甲醇（50∶1、25∶1、10∶1、5∶1、4∶1、7∶3、1∶1）梯度洗脫得到C7-1～C7-6，繼續(xù)采用半制備HPLC和LH-20凝膠純化，獲得化合物14（16.8 mg）。組分C8采用正相硅膠和凝膠反復(fù)分離得到化合物12（7 mg）。

2.2 提取物及單體化合物體外抗炎活性篩選

2.2.1 細(xì)胞毒性測(cè)定 采用MTT法檢測(cè)提取物及部分化合物對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力，提取物分別給予300、30 μg/mL，單體化合物分別給予30、10 μg/mL刺激RAW264.7細(xì)胞，24 h后檢測(cè)細(xì)胞活力。選取對(duì)細(xì)胞存活率不低于80%的濃度用作抗炎活性篩選。

2.2.2 樣品對(duì)細(xì)胞中炎癥因子mRNA表達(dá)的影響 選擇處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，輕輕將細(xì)胞吹落并收集細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個(gè)/mL，按每孔1 mL的體積接種至12孔板中，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。之后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理：空白組、模型組（LPS 1mg/mL＋I(xiàn)FN-γ20 ng/mL）、樣品組（LPS 1mg/mL＋I(xiàn)FN-γ20 ng/mL），培養(yǎng)24 h后樣品組加入100mL含有樣品的培養(yǎng)基，其余2組加入相應(yīng)體積的培養(yǎng)基，每組3個(gè)復(fù)孔。相同條件下培養(yǎng)24 h后，取細(xì)胞沉淀根據(jù)相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行提取總RNA、逆轉(zhuǎn)錄[11]和RT-PCR[12]的操作，檢測(cè)細(xì)胞中炎癥因子一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，）及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，）mRNA表達(dá)情況。相關(guān)引物設(shè)計(jì)信息見(jiàn)表1。

表1 逆轉(zhuǎn)錄引物序列

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：淡黃色粉末，HR-ESI-MS/: 111.042 4 [M＋H]+（計(jì)算值111.044 6），分子式為C6H6O2。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 6.75 (2H, dd,= 5.9, 3.6 Hz, H-4, 5), 6.65 (2H, dd,= 5.9, 3.6 Hz, H-3, 6)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 146.5 (C-1, 2), 121.1 (C-3, 6), 116.6 (C-4, 5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]，故鑒定化合物1為鄰苯二酚。

化合物2：黃色油狀物，HR-ESI-MS/: 123.041 7 [M＋H]+（計(jì)算值123.044 6），分子式為C7H6O2。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.81 (2H, d,= 8.6 Hz, H-2, 6), 6.98 (2H, d,= 8.6 Hz, H-3, 5)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3):191.5 (C-7), 162.1 (C-4), 131.3 (C-2, 6), 128.9 (C-1), 116.2 (C-3, 5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]，故鑒定化合物2為對(duì)羥基苯甲醛。

化合物3：淡黃色粉末，HR-ESI-MS/: 181.083 3 [M＋H]+（計(jì)算值181.086 5），分子式為C10H12O3。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.01 (2H, d,= 8.5 Hz, H-2, 6), 6.69 (2H, d,= 8.5 Hz, H-3, 5), 3.63 (3H, s, -OCH3), 2.81 (2H, t,= 7.6 Hz, H-7), 2.57 (2H, t,= 7.6 Hz, H-8)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)175.9 (C-9), 157.0 (C-4), 132.8 (C-1), 130.4 (C-2, 6), 116.4 (C-3, 5), 52.2 (-OCH3), 35.3 (C-7), 31.3 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]，故鑒定化合物3為對(duì)羥基苯丙酸甲酯。

化合物4：淡黃色粉末，HR-ESI-MS/: 181.084 1 [M＋H]+（計(jì)算值181.086 5），分子式為C10H12O3。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.04 (2H, d,= 8.5 Hz, H-2, 6), 6.71 (2H, d,= 8.6 Hz, H-3, 5), 4.19 (2H, t,= 7.1 Hz, H-8), 2.80 (2H, t,= 7.1 Hz, H-7), 2.00 (3H, s, H-2′)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 173.1 (C-1′), 157.2 (C-4), 131.0 (C-2, 6), 130.1 (C-1), 116.3 (C-3, 5), 66.8 (C-8), 37.2 (C-7), 21.0 (C-2′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]，故鑒定化合物4為4-羥基苯醋酸乙酯。

化合物5：淡黃色粉末，HR-ESI-MS/: 155.073 1 [M＋H]+（計(jì)算值155.070 8），分子式為C8H10O3。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 6.67 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 6.65 (1H, d,= 2.1 Hz, H-2), 6.52 (1H, dd,= 8.0, 2.1 Hz, H-6), 3.67 (1H, t,= 7.1 Hz, H-8), 2.66 (1H, t,= 7.3 Hz, H-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[17]，故鑒定化合物5為3,4-二羥基苯乙醇。

化合物6：淡黃色粉末，HR-ESI-MS/: 169.051 3 [M＋H]+（計(jì)算值169.050 1），分子式為C8H8O4。1H-NMR (400 MHz, CD3OD):7.44 (1H, dd,= 2.0, 8.0 Hz, H-6), 7.36 (1H, d,= 2.1 Hz, H-2), 6.83 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5), 4.80 (2H, s, H-8)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 198.8 (C-7), 152.8 (C-4), 146.8 (C-3), 127.8 (C-1), 122.5 (C-6), 116.2 (C-5), 115.5 (C-2), 65.9 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[18]，故鑒定化合物6為3,4-二羥基苯酰乙醇。

化合物7：淡黃色粉末，HR-ESI-MS/: 155.033 2 [M＋H]+（計(jì)算值 155.034 4），分子式為C7H6O4。1H-NMR (400 MHz, CD3OD):7.44 (1H, dd,= 2.1, 8.3 Hz, H-6), 7.42 (1H, d,= 2.1 Hz, H-2), 6.80 (1H, d,= 8.3 Hz, H-5)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD):170.5 (C-7), 151.6 (C-4), 146.2 (C-3), 124.0 (C-6), 123.3 (C-1), 117.8 (C-5), 115.9 (C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[19]，故鑒定化合物7為3,4-二羥基苯甲酸。

化合物8：黃色粉末，HR-ESI-MS/: 240.124 5 [M＋H]+（計(jì)算值240.123 6），分子式為C12H17NO4。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 6.76 (1H, d,= 2.1 Hz, H-2), 6.74 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5), 6.63 (1H, dd,= 8.4, 2.4 Hz, H-6), 4.22 (1H, dd,= 8.2, 4.8 Hz, H-7), 3.39 (2H, m, H-1′′), 3.31～3.20 (2H, m, H-8), 1.93 (3H, s, H-2′), 1.15 (3H, t,= 7.0 Hz, H-2′′)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD):171.9 (C-1′), 145.2 (C-4), 144.8 (C-3), 131.5 (C-1), 118.1 (C-6), 114.8 (C-5), 113.2 (C-2), 80.0 (C-7), 63.5 (C-1′′), 45.2 (C-8), 21.2 (C-2′), 14.1 (C-2′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[20]，故鑒定化合物8為-乙酰基-2-乙氧基-2-(3,4-二羥基苯基)乙胺。

化合物9：無(wú)色油狀物，HR-ESI-MS/: 177.074 6 [M＋H]+（計(jì)算值177.076 3），分子式為C7H12O5。1H-NMR (400 MHz, CD3OD):5.10 (1H, q,= 7.1 Hz, H-1′), 4.32 (1H, q,= 7.0 Hz, H-2), 3.74 (3H, s, OCH3), 1.49 (3H, d,= 7.1 Hz, H-3′), 1.41 (3H, d,= 7.0 Hz, H-3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD):175.8 (C-1), 172.8 (C-2′), 70.5 (C-1′), 67.9 (C-2), 53.0 (-OCH3), 20.6 (C-3), 17.3 (C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21]，故鑒定化合物9為2-(2-羥基丙酰氧基)丙酸甲酯。

化合物10：黑色油狀物，HR-ESI-MS/: 139.078 5 [M＋H]+（計(jì)算值139.075 9），分子式為C8H10O2。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.07 (2H, d,= 8.5 Hz, H-2, 6), 6.72 (2H, d,= 8.5 Hz, H-3, 5), 3.65 (3H, s, -OCH3), 3.52 (2H, s, H-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[22]，故鑒定化合物10為對(duì)甲氧基苯甲醇。

化合物11：白色粉末，HR-ESI-MS/: 169.052 4 [M＋H]+（計(jì)算值169.050 1），分子式為C8H8O4。1H-NMR (400 MHz, CD3OD):7.42 (1H, dd,= 8.0, 1.9 Hz, H-6), 7.40 (1H, d,= 2.1 Hz, H-2), 6.80 (1H, d,= 8.9 Hz, H-5), 3.83 (3H, s, H-8)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 169.0 (C-7), 151.9 (C-4), 146.4 (C-3), 123.8 (C-6), 122.7 (C-1), 117.5 (C-2), 116.0 (C-5), 52.4 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[23]，故鑒定化合物11為3,4-二羥基苯甲酸甲酯。

化合物12：黃色粉末，HR-ESI-MS/: 209.104 4 [M＋H]+（計(jì)算值209.102 5），分子式為C8H16O6。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 4.79 (1H, d,= 3.7 Hz, H-1), 3.84～3.75 (2H, m, H-6), 3.69～3.34 (6H, m, H-2～5, 1′), 1.24 (3H, t,= 7.1 Hz, H-2′)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 100.0 (C-1), 75.3 (C-3), 73.7 (C-5), 72.1 (C-2), 72.0 (C-4), 64.6 (C-6), 62.8 (C-1′), 15.5 (C-2′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[24]，故鑒定化合物12為α-乙基葡萄糖苷。

化合物13：黃色粉末，HR-ESI-MS/: 181.084 2 [M＋H]+（計(jì)算值181.086 5），分子式為C10H12O3。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.28～7.19 (5H, m, H-2～6), 4.36 (1H, dd,= 7.8, 4.9 Hz, H-8), 3.69 (3H, s, -OCH3), 3.05 (1H, dd,= 13.8, 4.9 Hz, H-7a), 2.91 (1H, dd,= 13.8, 7.8 Hz, H-7b)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 175.9 (C-9), 138.7 (C-1), 130.7 (C-2, 6), 129.4 (C-3, 5), 127.8 (C-4), 73.2 (C-8), 52.5 (-OCH3), 41.8 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[25]，故鑒定化合物13為2-羥基-3-苯基丙酸甲酯。

化合物14：黑色粉末，HR-ESI-MS/: 196.098 7 [M＋H]+（計(jì)算值196.097 4），分子式為C10H13NO3。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 6.68 (1H, d,= 7.9 Hz, H-5), 6.64 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2), 6.52 (1H, dd,= 8.0, 1.9 Hz, H-6), 3.34 (2H, t,= 7.3 Hz, H-8), 2.62 (2H, t,= 7.4 Hz, H-7), 1.90 (3H, s, H-2′)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 173.4 (C-1′), 146.4 (C-4), 144.9 (C-3), 132.2 (C-1), 121.1 (C-6), 117.0 (C-2), 116.5 (C-5), 42.6 (C-8), 36.0 (C-7), 22.7 (C-2′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[17]，故鑒定化合物14為-乙?；?2-(3,4-二羥基苯基)乙胺。

化合物15：黃色粉末，HR-ESI-MS/: 137.093 1 [M＋H]+（計(jì)算值137.096 7），分子式為C9H12O。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.02 (2H, d,= 8.4 Hz, H-2, 6), 6.70 (2H, d,= 8.5 Hz, H-3, 5), 3.33 (2H, t,= 6.7 Hz, H-8), 2.67 (2H, t,= 6.7 Hz, H-7), 1.90 (3H, s, 4-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[26]，故鑒定化合物15為對(duì)甲基苯乙醇。

化合物16：白色粉末，HR-ESI-MS/: 127.050 4 [M＋H]+（計(jì)算值127.050 8），分子式為C5H6N2O2。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6):11.02 (1H, s, 3-NH), 10.62 (1H, s, 1-NH), 7.25 (1H, s, H-6), 1.71 (3H, s, H-7)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6):165.0 (C-4), 151.5 (C-2), 137.8 (C-6), 107.7 (C-5), 11.8 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[27]，故鑒定化合物16為胸腺嘧啶。

3.2 凹紋胡蜂提取物不同部位及單體的抗炎活性

采用LPS聯(lián)合IFN-γ誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥模型，檢測(cè)樣品對(duì)炎癥因子（、）mRNA表達(dá)的影響考察提取物及單體化合物的抗炎活性。

3.2.1 提取物不同部位及單體對(duì)RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性 提取物不同部位對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7的細(xì)胞毒性測(cè)試結(jié)果見(jiàn)圖1，與空白組比較，氯仿部位質(zhì)量濃度為30 μg/mL，醇提物、醋酸乙酯部位、正丁醇部位、石油醚部位及水部位質(zhì)量濃度為300 μg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性。因此，抗炎活性檢測(cè)中氯仿部位給藥質(zhì)量濃度為30 μg/mL，其余樣品質(zhì)量濃度均為300 μg/mL。

單體化合物對(duì)RAW264.7的細(xì)胞毒性如圖2所示，化合物在30、10 μg/mL質(zhì)量濃度下培養(yǎng)24 h后，與空白組比較，各給藥組細(xì)胞存活率均不小于80%，說(shuō)明在30 μg/mL下化合物對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性較小，可選用30 μg/mL進(jìn)行抗炎實(shí)驗(yàn)。

與空白組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，圖2同

圖2 單體化合物對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響(, n = 5)

3.2.2 不同部位提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型中炎癥因子mRNA表達(dá)的影響 如圖3所示，與空白組比較，模型組中的基因相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)（＜0.01），說(shuō)明模型組造模成功。與模型組比較，凹紋胡蜂醇提物、醋酸乙酯部位、正丁醇部位及水部位在質(zhì)量濃度為300 μg/mL時(shí)均能有效地減少由LPS＋I(xiàn)FN-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子基因相對(duì)表達(dá)量（＜0.05、0.01）。

與空白組比較：# #P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，圖4同

3.2.3 單體對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型中炎癥因子mRNA表達(dá)的影響 單體化合物的抗炎活性見(jiàn)圖4。在質(zhì)量濃度為30 μg/mL時(shí)，化合物2、3、5、6、9～11對(duì)LPS＋I(xiàn)FN-γ誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子mRNA的表達(dá)有著明顯抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。而化合物7能夠使炎癥因子基因相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，可能與LPS＋I(xiàn)FN-γ產(chǎn)生了協(xié)同刺激作用，存在一定的致炎性。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)凹紋胡蜂醋酸乙酯部位的化學(xué)成分進(jìn)行研究，從中分離鑒定了16個(gè)化合物，包括2個(gè)乙酰多巴胺類(lèi)化合物、8個(gè)酚類(lèi)化合物和6個(gè)其他化合物，均為首次從凹紋胡蜂蟲(chóng)體中分離得到。乙酰多巴胺類(lèi)和多酚類(lèi)化合物是昆蟲(chóng)的主要化學(xué)成分，在蝗蟲(chóng)[28]、九香蟲(chóng)[29]、琵琶甲[30]和美洲大蠊[31]等昆蟲(chóng)中均廣泛分布，有著較好的抗炎和抗氧化活性。活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，醇提物、醋酸乙酯部位、正丁醇部位及水部位在300 μg/mL的給藥質(zhì)量濃度下均能顯著降低由LPS＋I(xiàn)FN-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子基因相對(duì)表達(dá)量；而在30 μg/mL給藥質(zhì)量濃度下，化合物2、3、5、6、9～11對(duì)LPS＋I(xiàn)FN-γ誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子mRNA的表達(dá)有著明顯抑制作用?？寡谆钚院Y選結(jié)果顯示，凹紋胡蜂抗炎活性部位主要是中等極性、大極性的醋酸乙酯、正丁醇及水部位，低極性的石油醚、氯仿部位無(wú)活性?；衔?～16自活性比較好的醋酸乙酯部位分離得到，而其中化合物2、3、5、6、9～11也對(duì)LPS＋I(xiàn)FN-γ誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型中細(xì)胞炎癥因子mRNA的表達(dá)有明顯抑制作用，具有潛在的抗炎活性，可能為醋酸乙酯部位的抗炎有效物質(zhì)，同時(shí)也提示凹紋胡蜂的抗炎作用是一個(gè)多組分的協(xié)同作用。

圖4 單體化合物對(duì)LPS聯(lián)合IFN-γ誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞后TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響(, n = 3)

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)豐富了凹紋胡蜂化學(xué)成分和藥理活性的研究，闡明了其發(fā)揮抗炎活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，但抗炎的作用機(jī)理仍需進(jìn)行深入研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chemical constituents of medicinal insectand its anti-inflammatory activities

LIU Chao-he1, PANG Xiu-qin1, LI Cheng-gong2, XU Jing-lei1, QIAN Xiao-li1, CHANG Ya-ping1, YANG Zhi-bin1, YANG Yin-he1, WANG Jia-peng1, XIAO Huai1

1. Yunnan Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D, College of Pharmacy, Dali University, Dali 671000, China 2. Xiangyun County Comprehensive Inspection and Testing Institute, Xiangyun, 672100, China

To study the chemical constituents and anti-inflammatory activities of medicinal insect.The compounds were isolated and purified by silica gel, Sephadex LH-20 and semi-preparative liquid chromatography, while the structures of compounds were characterized and analyzed by nuclear magnetic resonance (NMR) technique. The mouse macrophage RAW264.7 inflammation model was induced by lipopolysaccharide (LPS) combined with interferon γ (IFN-γ), the effects of extracts and monomers on the mRNA expression of inflammatory factors were investigated.A total of 16 compounds were isolated from ethyl acetate fractions and identified as catechol hydroquinone (1), 4-hydroxybenzaldehyde (2), methyl 3-(4-hydroxyphenyl)propionate (3), 4-hydroxyphenethy acetate (4), 3,4-dihydroxy-phenethyl alcohol (5), 3,4-dihydroxyphenyl ethanol ketone (6), 3,4-dihydroxy-benzoic acid (7), divesamides A (8), methyl-2- (2-hydroxy-propionyloxy) propionate (9), 4-methoxybenzyl alcohol (10), 3,4-dihydroxy-benzoic methyl ester (11), α-ethyl glucoside (12), papuline (13),-acetyl-dopamine (14), 2-(4-methylphenyl) ethanol (15), thymine (16). The alcohol extracts, ethyl acetate fractions,-butanol fractions and water fractions of.could effectively reduce the relative expression ofgene of cellular inflammatory factor in RAW264.7 induced by LPS + IFN-γ when the administration concentration of ethyl acetate,-butanol and water fractions was 300 μg/mL. Compounds 2, 3, 5, 6, 9—11 inhibited the expression ofmRNA in RAW264.7 cells induced by LPS combined with IFN-(< 0.01).The alcoholic extracts and different polar parts of.can reduce the expression of iNOS in inflammatory cells and have some anti-inflammatory effects. Compounds 1—16 are isolated and identified from the ethyl acetate portion of.for the first time, of which 2, 3, 5, 6, 9—11 may be potential active monomers.

Smith; anti-inflammatory activity; 4-hydroxybenzaldehyde; 3,4-dihydroxy-phenethyl alcohol; methyl-2-(2-hydroxy-propionyloxy) propionate; 4-methoxybenzyl alcohol

R284.1

A

0253 - 2670(2023)22 - 7351 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.22.012

2023-04-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82160822）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82160798）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82060765）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82260163）；云南省“興滇英才支持計(jì)劃”團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)（202305AS350001）；云南省重大科技專項(xiàng)計(jì)劃（202002AA100007）；云南省自然科學(xué)基金（2017FA050）；云南省科技廳基礎(chǔ)研究計(jì)劃面上項(xiàng)目（202101AT070029）

劉超賀（1998—），男，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)樗幚韺W(xué)。E-mail: lch412728@163.com

通信作者：肖 懷，女，教授，博士，從事藥用昆蟲(chóng)活性物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理藥效研究。E-mail: xiaohuai@dali.edu.cn

王家鵬，男，講師，博士，從事天然藥物化學(xué)研究。E-mail:jpwang@dali.edu.cn

#共同第一作者：

龐秀琴（1996—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)。E-mail: p18787230348@163.com

[責(zé)任編輯 王文倩]