李曉晨，李天嬌, 2, 3，包永睿, 2, 3，王 帥, 2, 3，孟憲生, 2, 3*

基于“質-量”雙標的當歸質量分析方法研究

李曉晨1，李天嬌1, 2, 3，包永睿1, 2, 3，王 帥1, 2, 3，孟憲生1, 2, 3*

1. 遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連 116600 2. 遼寧省中藥多維分析專業(yè)創(chuàng)新技術中心，遼寧 大連 116600 3. 遼寧省現代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 116600

建立以對照藥材為基準物質定性和不完全依賴對照品定量的當歸藥材“質-量”雙標控制方法。采用HPLC技術建立當歸對照藥材的特征圖譜，將其與供試藥材圖譜進行比對來辨別藥材的真?zhèn)?，即“質”；采用內標物質對特征峰化學成分進行相對定量來區(qū)分藥材的優(yōu)劣，即“量”。建立的當歸藥材“質-量”分析方法符合方法學考察要求，各供試藥材與對照藥材的相似度均大于0.98；規(guī)定了當歸藥材特征峰化學成分相對含量下限。該方法不依賴多種對照品，能清晰、快速地判斷藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣，彌補目前當歸藥材質量控制的不足，完善中藥材質量控制體系，降低中藥材（飲片）檢測成本，減輕中藥企業(yè)經濟負擔，以期推動中醫(yī)藥事業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

當歸；對照藥材；質量控制；特征圖譜；綠原酸；阿魏酸；洋川芎內酯Ⅰ；藁本內酯

當歸藥材來源于傘形科當歸屬植物(Oliv.) Diels的干燥根，始載于《神農本草經》，又名干歸、馬尾當歸、秦哪、馬尾歸、云歸、山民歸等，是我國臨床最常用中藥之一，具補血活血和調經止痛的功效，有“血中之氣藥”“補血之要藥”“婦科之良藥”等稱號，主要含有揮發(fā)油、有機酸、多糖、核苷類、氨基酸等多種類型的化合物，藥用歷史悠久，許多經典名方以其入藥[1-6]。由文獻可知[7-9]，甘肅作為當歸道地產區(qū)歷史悠久，南北朝時期，醫(yī)書記載當歸產于隴西（今甘肅隴西至蘭州一帶）、黑水（今甘肅定西）、西川（今四川西部）。近年來，隨著當歸市場需求量的增加，種植面積在不斷擴大，隨著全球氣候變暖、氣溫升高的大環(huán)境，當歸傳統(tǒng)主產區(qū)出現一定的變化，正在逐漸向西遷移，種苗質量良莠不齊，影響了當歸藥材生產健康發(fā)展。當歸的栽培歷時長，優(yōu)質種質的收集、選育工作相對滯后，品種退化嚴重，以上都可能是影響藥材品質的重要因素。傳統(tǒng)的中藥材及飲片鑒別主要依靠性狀鑒別、顯微鑒別和理化方法，由于這些傳統(tǒng)技術受制于檢驗人員的專業(yè)知識和從業(yè)人員經驗，主觀判斷存在很大的局限性，且中藥復雜體系質量評控技術難度和高額成本給中藥企業(yè)帶來了巨大的壓力，因而對中藥臨床合理用藥和臨床療效提升的指導和支持作用一直難以體現。

本實驗針對上述問題提出了基于“質-量”雙標的當歸質量分析方法。首先，本課題組以對照藥材為基準，構建了特征圖譜，選取可代表當歸藥效的有限個代表性成分作為特征峰，并通過評價對照藥材和供試藥材特征峰的相似度，實現對當歸真?zhèn)蔚呐袛?。其次，本實驗選擇了保留時間穩(wěn)定、價格低廉且易于獲得的內標物質，作為定量評價的指標?；趦葮宋镔|，進行了特征峰化學成分的相對定量研究，通過內標物質的化學成分準確量化，計算供試藥材特征峰化學成分的相對含量，從而評價當歸的優(yōu)劣。這種基于“質-量”雙標的當歸質量分析方法有效地克服了當歸有效成分的快速測定和中藥復雜體系質量評控成本高的難題。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent-1260Ⅱ高效液相色譜儀；Agilent 6550 Q-TOF-MS質譜儀（美國安捷倫科技有限公司）。

1.2 材料

當歸對照藥材（批號120927-201617，中國食品藥品檢定研究所）；當歸藥材信息見表1，經遼寧中醫(yī)藥大學張慧教授鑒定為傘形科當歸屬植物(Oliv.) Diels的干燥根。對照品阿魏酸（批號wkq17022303），購自四川省維克奇生物科技有限公司；對照品洋川芎內酯I（批號150213），購自成都普菲德生物技術有限公司；對照品藁本內酯（批號111737-201910）、綠原酸對照品（批號110753-201415）均由中國食品藥品檢定研究院提供；所有對照品質量分數均大于98%；乙腈（質譜級，德國Merck公司）；水（娃哈哈純凈水）。

表1 當歸來源信息

2 方法與結果

2.1 基于當歸對照藥材的特征圖譜建立

2.1.1 對照藥材溶液的制備 取當歸對照藥材粉末2.0 g，精密稱定, 置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質量，超聲提取30 min（頻率40 kHz），放冷，加甲醇補足減失質量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為參照物溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取供試品粉末（過4號篩）2.0 g，按上述方法制成供試品溶液。

2.1.3 混合對照品溶液的制備 取適量阿魏酸、洋川芎內酯I、藁本內酯、綠原酸對照品精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇，搖勻，作為混合對照品溶液。

2.1.4 色譜條件 色譜柱：Agilent poroshell 120 SB-C18色譜柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流動相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），進行梯度洗脫：0～15 min，5%～40% B；15～17 min，40%～60% B；17～25 min，60%～75% B，25～31 min，75%～87% B；31～35 min，87%～95% B；體積流量：0.6 mL/min；柱溫30 ℃；DAD檢測器波長254 nm；進樣量5 μL。

2.1.5 特征圖譜的建立 將對照品溶液和供試品溶液，每份樣品平行2次，按色譜條件依次進樣檢測，將254 nm波長下的圖譜數據由分析檢測儀器中導入中國藥典委員會“中藥指紋圖譜相似度評價軟件”（2012.130727版本），獲得當歸藥材的HPLC特征圖譜，見圖1。以當歸對照藥材的圖譜為參照譜圖，使用中位數進行自動匹配，加以多點校正，共標定15個共有峰，共有峰面積占特征圖譜的75%以上，其中6號峰穩(wěn)定性、重復性、分離度好、位置居中，故以其為參照峰（S）；將共有模式與對照藥材特征圖譜進行比對，見圖2；供試品色譜中應呈現15個特征峰，并應與對照藥材色譜圖中的15個特征峰保留時間相對應，見表2。

2.2 方法學考察

2.2.1 專屬性試驗 分別取混合對照品溶液、供試品溶液進行測定，各主峰與雜質峰分離度良好，專屬性強，見圖3。

2.2.2 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液5 μL，按“2.1.4”項下色譜條件測定，連續(xù)進樣6次，測定各色譜峰相對保留時間、相對峰面積，計算相對標準偏差。各色譜峰相對保留時間、相對峰面積RSD值均小于1.0%，表明儀器精密度良好。

圖1 8批供試藥材的HPLC疊加圖譜

圖2 對照藥材特征圖譜及供試藥材共有模式

表2 特征峰保留時間及相對保留時間

4-綠原酸 6-阿魏酸 7-洋川芎內酯Ⅰ 14-藁本內酯

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液5 μL，按“2.1.4”項下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣6次檢測，測定各色譜峰相對保留時間、相對峰面積，計算相對標準偏差。各色譜峰相對保留時間、相對峰面積RSD值均小于2.4%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.2.4 重復性試驗 按供試品溶液制備方法制備6份供試樣品，按“2.1.4”項下色譜條件，分別進樣檢測，測定各色譜峰相對保留時間、相對峰面積，計算相對標準偏差。各色譜峰相對保留時間、相對峰面積RSD值均小于2.0%，表明方法重復性良好。

2.3 相似度評價

采用中國藥典委員會“中藥指紋圖譜相似度評價軟件”（2012.130727版本）進行數據處理，該軟件利用夾角余弦法計算每個色譜圖與對照藥材圖譜相比較的相似度。以當歸對照藥材和供試藥材特征峰的相似度明確當歸藥材真?zhèn)?。當歸供試藥材與當歸對照藥材的相似度均大于0.98，說明所收集的當歸供試藥材的特征峰化學成分基本一致，質量相對穩(wěn)定。相似度計算結果見表3。

表3 供試藥材相似度評價結果

2.4 特征峰化學成分解析

在初步采用Agilent-1260 II高效液相色譜儀利用相對保留時間與對照品比對的基礎上，采用Agilent 6550Q-TOF-MS質譜儀，進行質譜分析，運用Agilent MassHunter Qualitative Analysis軟件，通過對照品比對的方法對正、負離子模式進行化學成分解析，進一步明確特征峰的化學成分。

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent poroshell 120 SB-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～30 min，5%～95% B；體積流量0.4 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量1.5 μL。

2.4.2 質譜分析條件 電噴霧離子源（Dual AJS ESI），正、負離子模式，毛細管電壓（Vcap）為3 500 V，干燥氣體體積流量（drying gas flow）為11 L/min，干燥氣體溫度（drying gas temp）為150 ℃，霧化器壓力（neulizer pressure）為172.4 kPa，鞘氣溫度（sheath gas temp）為350 ℃，鞘氣體積流量（sheath gas flow）為10 L/min，質量掃描范圍（mass range）為/100～1000。采用auto MS/MS模式，利用對照品比對及數據庫查詢等方法對特征峰化學成分進行解析。正、負離子模式鑒定出了15個特征峰中的4個化學成分，見圖4。其中，4號峰為綠原酸、6號峰為阿魏酸、7號峰為洋川芎內酯I、14號峰為藁本內酯，鑒定結果見表4。

4-綠原酸 6-阿魏酸 7-洋川芎內酯I 14-藁本內酯

S該化合物是由對照品進行指認

SThis compound was identified using reference standards

2.5 基于內標物質的特征峰化學成分相對定量研究

2.5.1 線性關系考察 配制阿魏酸的6個質量濃度溶液，按色譜條件，分別進樣檢測，以質量為橫坐標（），峰面積為縱坐標（），繪制標準曲線并進行線性回歸，得到線性回歸方程（＝0.702 1＋0.770 3）、相關系數（＝0.999 1）和線性范圍（0.051 0～0.202 0 mg）。結果表明進樣量范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.5.2 精密度試驗 同“2.2.2”項下方法，計算阿魏酸相對峰面積RSD值均小于1.80 %，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 同“2.2.3”項下方法，計算阿魏酸相對峰面積RSD值均小于1.90%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.5.4 重復性試驗 同“2.2.4”項下方法，計算阿魏酸相對峰面積RSD值均小于2.10%，表明方法重復性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 精密稱定當歸藥材粉末6 份，分別精密加入阿魏酸對照品適量，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.4”項下色譜條件，分別進樣檢測，計算得到阿魏酸的平均加樣回收率為99.80%，RSD為1.88%。

2.5.6 含量測定 根據《中國藥典》2020版當歸“含量測定”項下方法檢測，8批產地供試品中，供試品均能符合藥典規(guī)定（含阿魏酸不得少于0.05%）。6號峰“阿魏酸”為《中國藥典》2020年版中當歸“含量測定”項下的指標之一，該峰分離效果好、保留時間穩(wěn)定居中、對照品價格低廉，故以其作為內標物質，開展基于內標物質的特征峰化學成分相對定量研究。取供試品藥材，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.4”項下色譜條件分析測定阿魏酸含量，每個供試品平行2份，結果見表5。計算每個供試品中特征峰化學成分的相對含量[特征峰化學成分相對含量＝特征峰峰面積×(阿魏酸含量/阿魏酸峰面積)]，結果見表6。取“平均數－標準差”作為特征峰化學成分相對于內標物質化學成分的相對含量下限，供試藥材根據此方法測得的特征峰相對含量不低于該含量下限[10]。

3 討論

中藥材是中醫(yī)藥的源頭，中藥質量的提升必須對藥材質量進行嚴格把控。目前，《中國藥典》2020年版中質量控制項對多成分指標進行測定的中藥品種已有上百種，且有些對照品價格昂貴，加大了企業(yè)生產和民眾的用藥成本。

表5 內標物質的準確定量結果（n＝2）

表6 基于內標物質的特征峰相對定量結果

當歸為我國中藥材十大出口品種之一，出口量在2 723.98 t，出口額2 539.53萬美元，出口金額占比為2.23%[11]。由于市場需求劇增中藥材種植區(qū)域的不斷擴大和盲目引種，造成中藥材質量問題日益突出，影響中藥當歸的臨床合理使用[12]。中藥材（飲片）質量控制方法主要包括單指標含量測定法、多指標含量測定法和指紋圖譜與含量測定結合法，以上方法雖能夠為控制中藥材（飲片）質量提供量化數據，但存在著單一指標不能反映藥材整體特征、多指標含量測定依賴于多種對照品且某些指標成分不能反映藥效、指紋圖譜只能模糊地評價藥材相似性不能清晰地判斷供試品真?zhèn)蝺?yōu)劣的不足。為解決以上問題，本研究創(chuàng)新研究思路，不依賴多種對照品，建立了以價格低廉易獲得的對照藥材為基準物質的定性和不依賴多種對照品定量的當歸藥材“質-量”雙標控制方法。通過構建當歸對照藥材及8個不同產地當歸供試藥材的特征圖譜，以對照藥材為基準物質，評價對照藥材和供試藥材特征峰的相似度，可以用于判斷當歸藥材的真?zhèn)?，即“質”；同時準確定量1種內標物質化學成分，計算當歸藥材其余各特征峰的相對含量，確定的各特征峰相對含量的下限能夠區(qū)分當歸藥材優(yōu)劣，即“量”。本研究所提出的當歸藥材的“質-量”控制方法能夠有效判斷藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣，形成科學、可控的中藥質量控制體系，旨在為中藥質量控制和中藥產業(yè)持續(xù)發(fā)展提供探索性解決方案。

本研究將與對照藥材相似度好、信噪比大于10、分離度大于1.5的特征峰作為定量分析指標成分。其中，綠原酸具有保肝、利膽、抗腫瘤、抗病毒等廣泛的藥理活性[13-14]，苯酞類化合物包括藁本內酯、洋川芎內酯I等，是當歸揮發(fā)油的主要成分，其中藁本內酯的含有量最高，該類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抑制血管生成、消炎解痛等多種藥理作用[15-18]。說明本方法選擇的當歸定性分析的指標能夠較為科學地反映當歸藥材的藥效，能全面科學地反映當歸的內在質量。

本實驗所收集的市面所售不同產地供試品，旨在建立基于“質-量”雙標的當歸質量分析方法，所收集的當歸供試藥材與當歸對照藥材的相似度均大于0.90[19]，說明所收集的當歸供試藥材的特征峰化學成分基本一致，但僅采用8批不同產地的藥材規(guī)定特征峰相對含量下限，缺乏全面性，因此，需要更進一步大量收集不同產地、不同批次的藥材，完善該套方法，以期有效判斷藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣，形成一個科學、可控的中藥質量控制體系，在滿足藥材多項質量控制項的同時減輕企業(yè)需大量購買對照品的經濟壓力，推動中醫(yī)藥事業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Research on quality analysis method ofbased on “quality-quantity” double standard

LI Xiao-chen1, LI Tian-jiao1, 2, 3, BAO Yong-rui1, 2, 3, WANG Shuai1, 2, 3, MENG Xian-sheng1, 2, 3

1. College of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China 2. Liaoning Multi-dimensional Analysis of Traditional Chinese Medicine Technical Innovation Center, Dalian 116600, China 3. Liaoning Modern Traditional Chinese Medicine Research and Engineering Laboratory, Dalian 116600, China

To establish a “quality-quantity” double standard control method for,which is qualitative based on the reference traditional Chinese medicinal materials (TCMM) as standard substances and quantitative without relying on multiple reference substances.HPLC technology was used to establish the characteristic chromatogram of the TCMM of, which was compared with the chromatogram of the tested TCMM to identify the authenticity of the medicinal materials, that is, “quality”. The internal standard substance was used to relatively quantify the chemical composition of characteristic peaks to distinguish the quality of medicinal materials, that is, “quantity”.The established “quality-quantity” analysis method ofmet the requirements of methodology investigation, and the similarity between the tested TCMM and the reference TCMM was greater than 0.98. The lower limit of relative content of chemical components of characteristic peaks ofwas defined.This method can judge the authenticity of medicinal materials clearly and quickly without many reference substances, make up for the shortage of quality control ofat present, improve the quality control system of TCMM, reduce the testing cost of TCMM (decoction pieces), reduce the economic burden of traditional Chinese medicine enterprises, and promote the sustainable development of traditional Chinese medicine.

(Oliv.) Diels; reference traditional Chinese medicinal materials; quality control; characteristic chromatogram; chlorogenic acid; ferulic acid; senkyunolide I; ligustilide

R286

A

0253 - 2670(2023)22 - 7313 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.22.006

2023-05-06

遼寧省教育廳創(chuàng)新團隊項目（LT2017015）

李曉晨，女，碩士研究生，主要從事藥物分析研究。Tel: 13644936393 E-mail: 215153259@qq.com

通信作者：孟憲生，男，博士生導師，主要從事藥效物質組學和作用機制整合研究。E-mail: mxsvvv@126.com

[責任編輯 時圣明]