李業(yè),孟麗虹,嚴(yán)豪,白仲虎*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)2(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無(wú)錫,214122)3(清華大學(xué) 深圳國(guó)際研究生院生物醫(yī)藥與健康工程研究院,廣東 深圳,518000)

依靠不可再生原料的化工、能源、醫(yī)藥等傳統(tǒng)制造業(yè)以“高排放、高污染”的加工模式對(duì)生態(tài)環(huán)境造成巨大影響,在全球倡導(dǎo)發(fā)展綠色低碳循環(huán)經(jīng)濟(jì)體系的趨勢(shì)下,傳統(tǒng)制造業(yè)面臨綠色轉(zhuǎn)型的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[1]。具有原料再生、過(guò)程高效清潔優(yōu)良特征的生物制造作為生物經(jīng)濟(jì)戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展方向,利用生物有機(jī)體進(jìn)行高質(zhì)量的綠色生產(chǎn),有望推動(dòng)生物技術(shù)融合工業(yè)制造,變革未來(lái)物質(zhì)加工和生產(chǎn)模式,實(shí)現(xiàn)綠色可持續(xù)發(fā)展[2]。

工業(yè)微生物細(xì)胞工廠(chǎng)是綠色生物制造的前提,其利用天然可再生原料通過(guò)自身代謝網(wǎng)絡(luò)合成“高價(jià)值、低能耗”的各類(lèi)物質(zhì),也可實(shí)現(xiàn)廢棄物回收利用,提高資源利用率[3]。目前微生物細(xì)胞工廠(chǎng)已廣泛應(yīng)用于輕工業(yè)、化工、能源、環(huán)保、生物防治等領(lǐng)域生產(chǎn)食品、藥品、生物環(huán)保材料和生物制劑等。但是,迄今為止我國(guó)自主研發(fā)的成熟高性能工業(yè)微生物細(xì)胞工廠(chǎng)仍然較少,其生產(chǎn)水平距國(guó)際大公司先進(jìn)工業(yè)微生物細(xì)胞工廠(chǎng)仍存在一定差距。因此,開(kāi)展我國(guó)自主工業(yè)微生物細(xì)胞工廠(chǎng)的設(shè)計(jì)創(chuàng)制研究,是保障我國(guó)生物制造產(chǎn)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵[4]。

為了建立具有優(yōu)良性狀的高效微生物細(xì)胞工廠(chǎng),對(duì)微生物為底盤(pán)的工業(yè)菌株進(jìn)行多維度的改造與構(gòu)建,通過(guò)多輪“設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)”(design-build-test-learning,DBTL)循環(huán)以達(dá)到以下目的[5]:(1)提高微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)速率;(2)擴(kuò)大底物譜及增強(qiáng)底物轉(zhuǎn)化效率;(3)提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量;(4)增強(qiáng)微生物底盤(pán)細(xì)胞的魯棒性和耐受性;(5)優(yōu)化目標(biāo)產(chǎn)物生產(chǎn)分離方式,減少下游產(chǎn)業(yè)成本等。對(duì)此研究人員融合“建物致知”和“建物致用”的理念開(kāi)發(fā)了許多育種策略,主要包括傳統(tǒng)的誘變育種策略和新型的理性、非理性育種策略以創(chuàng)制微生物細(xì)胞工廠(chǎng)[6]。

由于谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)具有公認(rèn)食品安全(Generally Regarded As Safe, GRAS)的特性,已成為工業(yè)生產(chǎn)的模式微生物之一,被應(yīng)用于構(gòu)建綠色高效的微生物細(xì)胞工廠(chǎng)[7]。20世紀(jì)50年代后已被廣泛用于大規(guī)模生產(chǎn)L-氨基酸,隨著基因工程、代謝工程和分子生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展,它也被用于工業(yè)生產(chǎn)高價(jià)值產(chǎn)品,包括有機(jī)酸、聚合物前體、高級(jí)醇和蛋白質(zhì)等。而該菌株的非致病性、無(wú)芽孢、迅速生長(zhǎng)、無(wú)內(nèi)毒素,有完整的分泌途徑,胞外水解酶活性較低的優(yōu)良性狀使其備受關(guān)注[8]。近年來(lái),基因編輯技術(shù)、代謝調(diào)控技術(shù)和高通量篩選技術(shù)的快速發(fā)展,顯著加速了工業(yè)菌種的改造提升與工業(yè)化應(yīng)用,也推動(dòng)了生物制造領(lǐng)域的進(jìn)步[9]。本文針對(duì)谷氨酸棒桿菌的育種策略和高通量篩選結(jié)合實(shí)際案例進(jìn)行綜述,介紹了傳統(tǒng)及新型育種策略,并展望了生物技術(shù)與人工智能融合對(duì)未來(lái)微生物細(xì)胞工廠(chǎng)的潛在應(yīng)用。

1 谷氨酸棒桿菌育種策略

從自然界中分離得到的谷氨酸棒桿菌,其性狀遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足工業(yè)生產(chǎn)的需要,因此如何對(duì)微生物底盤(pán)進(jìn)行提升,以獲得高產(chǎn)高效的工業(yè)微生物細(xì)胞工廠(chǎng)就成為了工業(yè)應(yīng)用的關(guān)鍵。而微生物育種的策略主要包括傳統(tǒng)育種和新型育種,傳統(tǒng)育種方式主要采用誘變育種,是指在人為條件下,利用物理、化學(xué)、生物因素,誘發(fā)生物體產(chǎn)生突變,從中選擇、培育植物和微生物新品種的方法,而隨著合成生物學(xué)、代謝工程、基因編輯技術(shù)、多種組學(xué)以及各種交叉學(xué)科的深入研究,使得微生物細(xì)胞工廠(chǎng)創(chuàng)制技術(shù)得到了不斷的發(fā)展和創(chuàng)新[6],發(fā)展的新型育種包括非理性的重離子輻射、常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)誘變育種、適應(yīng)性進(jìn)化育種,理性的基因編輯等,這些技術(shù)和手段都為獲得優(yōu)質(zhì)的微生物底盤(pán)細(xì)胞提供了便利[10]。

1.1 傳統(tǒng)育種策略

誘變育種作為傳統(tǒng)的微生物育種技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物領(lǐng)域,包括物理誘變、化學(xué)誘變、生物誘變及復(fù)合誘變[11]。如圖1所示,它不需要復(fù)雜的基因操作及代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控知識(shí),方便快捷、成本較低及成功率較高,因此為微生物選育提供了便利。

圖1 提高重組蛋白產(chǎn)量的主要方法[11]Fig.1 The main method to increase the yield of recombinant protein[11]

物理誘變主要利用電離輻射如X-射線(xiàn)、γ-射線(xiàn)和來(lái)自放射性物質(zhì)及非電離輻射如紫外線(xiàn)、激光、微波等物理誘變因素,加速微生物的突變率。電離輻射能量極高,能使構(gòu)成基因的化學(xué)物質(zhì)直接發(fā)生電離作用,從而形成變異。非電離輻射的能量較低,只能產(chǎn)生激發(fā)作用,其中紫外線(xiàn)照射是最常采用的方法之一,紫外線(xiàn)可使DNA分子形成嘧啶二聚體,阻礙堿基正常配對(duì),引起突變或死亡[12]。陳曉博等[13]通過(guò)紫外線(xiàn)誘變谷氨酸棒桿菌出發(fā)菌株BC001,用結(jié)構(gòu)類(lèi)似物D-精氨酸平板篩選獲得高產(chǎn)L-精氨酸的BC307突變株,產(chǎn)量提升至2.94 g/L。

化學(xué)誘變主要利用一些化學(xué)物質(zhì)以提高生物的突變率,其可以使DNA分子發(fā)生烷化、錯(cuò)配或移碼,影響mRNA的轉(zhuǎn)錄,造成功能蛋白重組,表型改變[14]。常用的化學(xué)誘變劑如烷化劑、堿基類(lèi)似物、移碼誘變劑等。例如,ZHANG等[15]先通過(guò)沉默丙酮酸脫氫酶基因復(fù)合物并敲除乳酸脫氫酶基因,然后通過(guò)硫酸二乙酯誘變獲得高產(chǎn)3-甲基-1-丁醇的谷氨酸棒桿菌突變體,其產(chǎn)量高達(dá)659 mg/L。

生物誘變通過(guò)提高基因重組頻率獲得新的遺傳型,主要包括噬菌體、DNA轉(zhuǎn)座子誘變和原生質(zhì)體融合、基因組重排等。其中原生質(zhì)體融合是一種很重要的菌種改良技術(shù),可將遺傳性狀不同的親株細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)融合,借以獲得兼有雙親優(yōu)良性狀的穩(wěn)定重組子[16]。它打破了物種間界限,實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣菌株的基因重組,為誘變育種提供了一種有效手段。張婧芳等[17]將谷氨酸棒桿菌GS538和谷氨酸高產(chǎn)菌S9114進(jìn)行原生質(zhì)體融合,定向選育出1株高產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸的RH169菌株,產(chǎn)量可達(dá)19.3 g/L。

復(fù)合誘變是采用2種或多種誘變劑同時(shí)處理或先后使用。因?yàn)榫觊L(zhǎng)期使用同種誘變劑后,會(huì)產(chǎn)生“疲勞效應(yīng)”,同時(shí)會(huì)出現(xiàn)菌株生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)、代謝減慢、回復(fù)突變等問(wèn)題,而研究表明復(fù)合誘變具有協(xié)同效應(yīng),較單一因子誘變有很大優(yōu)勢(shì)[11]。例如,PARK等[18]用N-甲基-N-亞硝基-N′-硝基胍和紫外線(xiàn)處理谷氨酸棒桿菌AR0菌株,成功獲得耐10 g/L精氨酸羥酸酯和30 g/L刀豆氨酸的AR1突變菌株,AR1經(jīng)分批補(bǔ)料培養(yǎng)后L-精氨酸產(chǎn)量達(dá)34.2 g/L,比在相同條件下培養(yǎng)的AR0菌株獲得的L-精氨酸高2倍以上。

1.2 新型育種策略

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,多種新型育種策略的出現(xiàn)為創(chuàng)制工業(yè)微生物細(xì)胞工廠(chǎng)注入了新的活力,主要分為非理性的育種策略和理性的育種策略。非理性的育種策略包括重離子輻射、ARTP誘變技術(shù)及適應(yīng)性進(jìn)化等策略。理性育種策略是基于合成生物學(xué)、基因編輯技術(shù)及微生物代謝網(wǎng)絡(luò)的深入研究,應(yīng)用理性設(shè)計(jì)構(gòu)建優(yōu)良的微生物細(xì)胞工廠(chǎng)[19]。

1.2.1 非理性育種策略

相比存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)的傳統(tǒng)育種技術(shù),近年來(lái)發(fā)展的新型育種技術(shù)[20]更加安全高效。例如重離子輻射、ARTP等有無(wú)毒無(wú)害、突變率高、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),適應(yīng)性進(jìn)化具有能夠提供足夠的遺傳多樣性,積累豐富的有益突變體等特點(diǎn),這些技術(shù)加速了優(yōu)良微生物細(xì)胞工廠(chǎng)的構(gòu)建。

重離子輻射在其穿透的路徑上有較大的能量沉積,產(chǎn)生很強(qiáng)的局部電離,與傳統(tǒng)的光子輻射相比具有較高的生物學(xué)相對(duì)效應(yīng),已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物育種、疾病診斷和治療[21]。繆建順等[22]通過(guò)12C6+束輻照誘變谷氨酸棒桿菌,經(jīng)篩選后獲得谷氨酸高產(chǎn)菌株GM006,其產(chǎn)量最高達(dá)121.1 g/L,比原始菌株提高10.09%。

ARTP誘變是1種新近開(kāi)發(fā)的安全物理誘變育種技術(shù)[23],如圖2所示,主要采用He作為誘變?cè)?能夠在大氣壓下產(chǎn)生溫度在25～40 ℃的高活性粒子濃度的等離子體射流,包含多種化學(xué)活性粒子,如激發(fā)態(tài)的氦原子、氧原子、氮原子、·OH自由基等。這些粒子能夠改變微生物細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)及通透性,對(duì)遺傳物質(zhì)造成損傷,誘發(fā)生物細(xì)胞啟動(dòng)容錯(cuò)率高的SOS修復(fù)機(jī)制,從而獲得遺傳穩(wěn)定的突變菌株。與其他誘變方法相比,ARTP具有突變率高、突變頻譜廣、操作簡(jiǎn)單、安全性高、環(huán)境友好等特點(diǎn),目前已廣泛應(yīng)用于包括細(xì)菌、放線(xiàn)菌、真菌、酵母等在內(nèi)的100多種微生物誘變育種。例如,ZHAO等[24]通過(guò)ARTP誘變產(chǎn)生累積19.4 g/L的L-精氨酸的突變菌株,并通過(guò)發(fā)酵優(yōu)化進(jìn)一步提升L-精氨酸產(chǎn)量獲得高達(dá)71.3 g/L的突變株。LV等[25]利用ARTP誘變及高通量篩選獲得了高產(chǎn)L-谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌,發(fā)酵終質(zhì)量濃度為(25.7±2.7) g/L,并通過(guò)理性改造進(jìn)一步改善L-谷氨酰胺的生產(chǎn),使L-谷氨酰胺發(fā)酵終質(zhì)量濃度增加了186.0%,達(dá)到(73.5±3.1)g/L。

a-以直接作用模式使用大氣壓DBD等離子體處理生物體;b-以間接作用方式使用射頻APGD等離子體射流處理生物體圖2 ARTP誘變2種模式原理[23]Fig.2 Principle of two modes of ARTP mutagenesis[23]

對(duì)于缺乏遺傳背景或與表型特征相互影響的微生物,可以采用具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)的適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化(adaptive laboratory evolution,ALE)。ALE是在實(shí)驗(yàn)室條件下,借助人工選擇壓力,通過(guò)微生物自發(fā)突變的不斷富集實(shí)現(xiàn)微生物的定向進(jìn)化,并從進(jìn)化群體中篩選優(yōu)良性狀個(gè)體的一種方法,其作為定向誘變已被廣泛應(yīng)用于提高微生物產(chǎn)物產(chǎn)量、生長(zhǎng)速度、脅迫耐受力和底物利用率等研究[26]。例如TUYISHIME等[27]利用ALE成功獲得高甲醇利用率的谷氨酸棒桿菌,突變體在甲醇-木糖最小培養(yǎng)基上顯示出細(xì)胞生長(zhǎng)增加20倍,并利用甲醇和木糖,物質(zhì)的量比達(dá)3.83∶1。KRüGER等[28]通過(guò)ALE增強(qiáng)谷氨酸棒狀桿菌的耐受性,使其適應(yīng)血紅素水平的增加,分離的菌株顯示出對(duì)濃度高達(dá)100 μmol/L的血紅素生長(zhǎng)的高度耐受性。徐美娟等[29]還闡述了谷氨酸棒桿菌抗各種環(huán)境脅迫機(jī)制,并總結(jié)了提高谷氨酸棒桿菌魯棒性和耐受性的合成生物學(xué)新策略。

1.2.2 理性育種策略

隨著代謝工程、合成生物學(xué)及全基因組測(cè)序的發(fā)展,加速了研究人員對(duì)微生物代謝調(diào)控機(jī)制的深入了解,對(duì)微生物細(xì)胞工廠(chǎng)的創(chuàng)制也從非理性的育種策略轉(zhuǎn)變?yōu)楦鼮槔硇缘挠N方式,其理性改造主要有以下策略[30]:

(1)生物合成元件及代謝途徑的挖掘和優(yōu)化[31]。經(jīng)典的基因表達(dá)調(diào)控元件包括5′非編碼區(qū)、啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome-binding site,RBS)、終止子等能夠有效調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平,但由于細(xì)胞基因水平的調(diào)控是復(fù)雜的、多元化的過(guò)程,經(jīng)典的基因表達(dá)調(diào)控元件不能滿(mǎn)足精準(zhǔn)調(diào)控的強(qiáng)度,因此研究人員也開(kāi)發(fā)了多種新型基因調(diào)控元件,如核糖開(kāi)關(guān)、核酸適配體等,在調(diào)控蛋白表達(dá)水平、改變細(xì)胞物質(zhì)代謝等過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。例如,WEN等[32]將谷氨酸棒桿菌S9114進(jìn)行代謝工程改造,并調(diào)節(jié)基因odhA的RBS序列以減弱α-氧戊二酸脫氫酶復(fù)合物活性,實(shí)現(xiàn)谷氨酸在生物素過(guò)量的玉米秸稈水解物中的高效積累,使谷氨酸積累量升高6倍以上。

基因編輯技術(shù)的發(fā)展使研究人員能夠更為理性的改善微生物底盤(pán)的自身性能,可以挖掘內(nèi)源性物質(zhì)代謝途徑,并利用過(guò)表達(dá)代謝途徑中的關(guān)鍵基因,消除產(chǎn)物反饋抑制等方式進(jìn)行優(yōu)化,也可以通過(guò)對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)的解析,構(gòu)建異源代謝的最佳途徑,從而提高目標(biāo)產(chǎn)物合成路徑的精確性[7]。例如WANG等[33]通過(guò)敲除ltbR轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,過(guò)表達(dá)L-亮氨酸合成途徑的關(guān)鍵基因,包括ilvC、leuDH、rocG,從而獲得L-亮氨酸產(chǎn)量達(dá)(23.31±0.24) g/L的高產(chǎn)菌株。

(2)代謝流量動(dòng)態(tài)調(diào)控

細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)存在復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制,對(duì)微生物底盤(pán)進(jìn)行單一調(diào)控元件或代謝途徑的改造可能會(huì)引起代謝失衡,不利于構(gòu)建高效的工業(yè)化微生物細(xì)胞工廠(chǎng),因此對(duì)微生物底盤(pán)進(jìn)行全局性的代謝流量動(dòng)態(tài)調(diào)控是必要的。常用的代謝流量動(dòng)態(tài)調(diào)控策略包括調(diào)控關(guān)鍵酶、強(qiáng)化底物利用過(guò)程中的能量供給、優(yōu)化目標(biāo)產(chǎn)物合成過(guò)程中的碳通量和氧化還原平衡等[34]。

細(xì)胞的代謝通過(guò)“基因-酶-反應(yīng)”組成了基因組代謝網(wǎng)絡(luò)模型,多種酶參與的代謝途徑普遍存在代謝失衡,導(dǎo)致中間代謝物積累,影響目標(biāo)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化效率。因此,可以通過(guò)強(qiáng)化關(guān)鍵酶的性能和產(chǎn)量、削弱支路副產(chǎn)物的關(guān)鍵酶,來(lái)提高代謝途徑的整體催化效率。優(yōu)化底物利用過(guò)程中能量供給以提高利用率,也可以通過(guò)構(gòu)建廉價(jià)碳或氮源底物利用途徑來(lái)降低能源成本。細(xì)胞在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生和消耗能量,若供給量小于需求量,會(huì)影響目標(biāo)產(chǎn)物的合成效率,因此需要對(duì)代謝途徑中碳通量和氧化還原平衡進(jìn)行優(yōu)化[35],實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)調(diào)控。例如XU等[36]通過(guò)理性改造依賴(lài)于NAD(P)H的二氫二吡啶酸還原酶,改變了其氧化還原通量,從而提高了谷氨酸棒桿菌中L-賴(lài)氨酸的產(chǎn)量[2.93 g/(L·h)],其碳產(chǎn)量從0.35 g/g葡萄糖提高到0.44 g/g葡萄糖。

(3)大規(guī)?；蚓庉?/p>

隨著基因編輯技術(shù)、高通量篩選及生物信息學(xué)的發(fā)展,為創(chuàng)制綠色高效的微生物細(xì)胞工廠(chǎng)提供了更多有力工具。傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)基于同源重組以實(shí)現(xiàn)目的基因的敲除、敲入和突變,但由于其低效率限制了底盤(pán)細(xì)胞改造的效率和通量,不能滿(mǎn)足全基因組范圍大量基因編輯的需求。近年來(lái),新一代基因編輯技術(shù) CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)展迅速,因其具有效率高、操作便捷、成本低等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于多種真核和原核生物的基因組編輯。迄今為止,NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)收錄了79株全基因組測(cè)序的谷氨酸棒桿菌,且研究人員開(kāi)發(fā)了完備的基因組編輯系統(tǒng),如CRISPR-Cas9系統(tǒng)、CRISPR-Cpf1/dCpf1系統(tǒng)及RE-CRISPR系統(tǒng)等,推動(dòng)了谷氨酸棒桿菌底盤(pán)細(xì)胞的優(yōu)化改造[37]。目前主要通過(guò)“自上而下的基因組精簡(jiǎn)”和“自下而上的基因組合成”2種策略進(jìn)行底盤(pán)細(xì)胞構(gòu)建。LIU等[38]通過(guò)優(yōu)化谷氨酸棒桿菌的CRISPR系統(tǒng)并利用CRISPR輔助的染色體編輯和CRISPRi陣列篩選用于工程關(guān)鍵酶,微調(diào)代謝通量和提高L-脯氨酸產(chǎn)量,最終獲得L-脯氨酸產(chǎn)量達(dá)到142.4 g/L的高產(chǎn)菌株。SUN等[39]建立了基于人工合成sRNA的基因表達(dá)沉默技術(shù),實(shí)現(xiàn)了染色體基因表達(dá)的快速下調(diào),單基因弱化效率達(dá)到80%以上。

2 高通量篩選技術(shù)

微生物細(xì)胞工廠(chǎng)通過(guò)理性/非理性的改造,會(huì)產(chǎn)生大量非目標(biāo)性的個(gè)體,尤其是非理性改造會(huì)產(chǎn)生大型突變文庫(kù),需要從其中篩選出理想性狀的底盤(pán)細(xì)胞具有很大挑戰(zhàn)性。傳統(tǒng)的瓊脂平板篩選法、搖瓶篩選方法和微孔板篩選方法是目前最常用的篩選方法,其作為簡(jiǎn)單易行的初篩方法,可用于排除大量無(wú)活性和極低活性的微生物。但由于微生物改造所產(chǎn)生的巨大文庫(kù),通過(guò)傳統(tǒng)篩選方式不僅通量低、效率低下且成本昂貴。為克服以上問(wèn)題,近年來(lái)已開(kāi)發(fā)了多種高通量篩選技術(shù)及設(shè)備[40],如自動(dòng)化液體處理平臺(tái)、熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)(fluorescence-activated cell sorting,FACS)、液滴微流控分選技術(shù)(droplet-based microfluidic sorting,DMFS)和基于生物傳感器篩選策略等,用于高效篩選具有目標(biāo)性狀的微生物底盤(pán)細(xì)胞。

2.1 高通量自動(dòng)化液體處理平臺(tái)

早期的高通量篩選主要采用多孔板進(jìn)行微生物細(xì)胞的檢測(cè)篩選,可以實(shí)現(xiàn)樣品與試劑的添加、培養(yǎng)和檢測(cè),包括24、48、96和384孔板。多孔板培養(yǎng)結(jié)合自動(dòng)化液體處理平臺(tái),每天處理樣品高達(dá)104個(gè),顯著提升篩選速率。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種全自動(dòng)處理工作站,利用軟件程序推動(dòng)自動(dòng)化液體處理平臺(tái)與多種檢測(cè)儀器組合的無(wú)縫集成[41],包括微孔板檢測(cè)儀、細(xì)胞成像系統(tǒng)、洗板機(jī)、分液器、自動(dòng)培養(yǎng)箱和儲(chǔ)板器等,極大縮短了手動(dòng)操作時(shí)間,通過(guò)更高效的工作流程提高實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)率,這些系統(tǒng)已應(yīng)用于微生物工程菌株選育、藥物篩選、微生物高內(nèi)涵分析等,是不可或缺的初期醫(yī)藥研發(fā)工具。例如RAJ等[42]開(kāi)發(fā)了一種環(huán)保的高通量自動(dòng)化篩選平臺(tái),能夠快速有效地建立表型酶和微生物菌株的微孔板篩選實(shí)驗(yàn),加速實(shí)現(xiàn)DBTL循環(huán),研究者成功利用該平臺(tái)在厭氧條件下生產(chǎn)烯酸還原酶,并進(jìn)行了烯酸還原酶最大活性的最佳pH值篩選,發(fā)現(xiàn)其在pH 5～6下工作最佳。

2.2 熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)

FACS是流式細(xì)胞術(shù)的一種特殊技術(shù)[43],如圖3所示,它是利用激光束激發(fā)將基因型和表型偶聯(lián)的微生物細(xì)胞中的熒光標(biāo)記物,通過(guò)光學(xué)系統(tǒng)收集并分析每個(gè)細(xì)胞的光散射和熒光信號(hào),再根據(jù)設(shè)定的參數(shù)將細(xì)胞按照特定的性質(zhì)進(jìn)行分選,分選速率高達(dá)107克隆/h,是一種高效分析和分選微生物細(xì)胞的工具,也是目前最常用和成熟的細(xì)胞高通量篩選技術(shù),已廣泛應(yīng)用于新藥研發(fā)、醫(yī)學(xué)研究、臨床診斷等多種領(lǐng)域中。例如ZHANG等[44]通過(guò)ARTP誘變提高谷氨酸ΔSSAAI菌株的L-絲氨酸產(chǎn)率,構(gòu)建了基于NCgl0581響應(yīng)L-絲氨酸的濃度的生物傳感器,利用FACS從大型誘變庫(kù)中成功分選出高產(chǎn)L-絲氨酸的谷氨酸C36-pDser菌株,累積量為34.78 g/L,蔗糖產(chǎn)量為0.35 g/g,分別比親本菌株高35.9%和66.7%。

圖3 流式細(xì)胞分選原理簡(jiǎn)圖[43]Fig.3 Schematic diagram of flow cell sorting[43]

2.3 液滴微流控分選技術(shù)

近年來(lái),DMFS發(fā)展迅速,已成為強(qiáng)大的超高通量篩選工具[45],其通過(guò)液滴生成、液滴培養(yǎng)及液滴檢測(cè)分選,從大量的液滴中分離出目標(biāo)液滴,獲得高效的微生物底盤(pán)細(xì)胞。納升至皮升級(jí)液滴作為微反應(yīng)器,常采用油包水的形式做區(qū)室化反應(yīng),同時(shí)適用胞內(nèi)表達(dá)和胞外分泌,具有通量高、速度快、體積微小、均一性好、單分散性良好等特點(diǎn),為醫(yī)藥、食品、環(huán)保研究等搭建了一個(gè)全新的平臺(tái)。目前液滴微流控技術(shù)已經(jīng)在生命科學(xué)研究中有不同的應(yīng)用[46],例如高通量篩選細(xì)胞藥物、單細(xì)胞組學(xué)研究,并結(jié)合細(xì)胞測(cè)序形成單細(xì)胞高通量液滴測(cè)序技術(shù),以繪制整個(gè)細(xì)胞亞群的基因組圖譜、適應(yīng)性進(jìn)化、開(kāi)發(fā)藥物輸送系統(tǒng)等。

基于不同的分選參數(shù)開(kāi)發(fā)了有多種檢測(cè)技術(shù),典型的檢測(cè)技術(shù)如熒光激活液滴分選技術(shù)(fluorescence-activated droplet sorting,FADS),它的應(yīng)用最為廣泛,已成為微生物工程菌株液滴分選的主要方式。JIANG等[47]綜述了不同分析物質(zhì)利用FADS研究的最新進(jìn)展,并根據(jù)熒光偶聯(lián)策略原理,將其分為4大類(lèi),包括熒光底物分析策略、酶聯(lián)熒光分析策略、基于生物傳感器熒光偶聯(lián)策略以及基于抗體親和力熒光偶聯(lián)策略。然而,有許多天然酶或代謝物是非熒光的,因此限制了FADS的適用性。為了克服這些問(wèn)題,其他檢測(cè)技術(shù)也被開(kāi)發(fā),例如吸光度激活液滴分選技術(shù)、吸光度激活液滴分選技術(shù)、質(zhì)譜液滴分選技術(shù)等。

目前基于DMFS開(kāi)發(fā)了微型化、自動(dòng)化、智能化的全自動(dòng)高通量微生物液滴培養(yǎng)儀(microbial microdroplet culture system,MMC),可用于單細(xì)胞微生物篩選,進(jìn)行生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定、壓力富集、適應(yīng)性進(jìn)化及菌種耐藥性研究等[48]。鄧?yán)诘萚49]利用ARTP誘變技術(shù)及MMC選育組氨酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的抗性突變株,成功從耐受3-氨基-1,2,4-三氮唑10 g/L和D-組氨酸8 g/L的抗性突變株中篩選得到谷氨酸棒桿菌Cg-F4,其L-組氨酸產(chǎn)量為0.561±0.016 g/L。YU等[50]建立第一個(gè)谷氨酸棒桿菌基因組規(guī)模CRISPRi干擾文庫(kù),同時(shí)集成了FlAsH-四半胱氨酸驅(qū)動(dòng)的FADS技術(shù),如圖4所示,開(kāi)發(fā)了一個(gè)工程化高通量的CRISPRi-微流體篩選平臺(tái),并成功應(yīng)用該平臺(tái)增強(qiáng)了谷氨酸棒狀桿菌中多種重組蛋白分泌產(chǎn)量。

2.4 基于生物傳感器的高通量篩選策略

生物傳感器是合成生物學(xué)和代謝工程的重要組成部分,可以將生物物質(zhì)濃度轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)、光信號(hào)等易于檢測(cè)的信號(hào),具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、分析速度快的特點(diǎn),因此被認(rèn)為是動(dòng)態(tài)調(diào)控、篩選理想表型的強(qiáng)大裝置。常用的生物傳感器主要包括基于熒光蛋白的生物傳感器、基于核酸的生物傳感器、基于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的生物傳感器和基于雙組分系統(tǒng)的生物傳感器等[51]。近年來(lái)生物傳感器已應(yīng)用于目標(biāo)化合物濃度檢測(cè)、高通量篩選、定向進(jìn)化和代謝動(dòng)態(tài)控制等方面,為加快構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠(chǎng)提供了有力工具。STELLA等[52]開(kāi)發(fā)了一種基于轉(zhuǎn)錄因子的生物傳感器,通過(guò)整合pfkA和Lrp,將谷氨酸棒狀桿菌的生長(zhǎng)與支鏈氨基酸的細(xì)胞內(nèi)濃度耦合,從而增強(qiáng)氨基酸的產(chǎn)生。TAN等[53]利用L-異亮氨酸生物傳感器篩選得到對(duì)L-異亮氨酸響應(yīng)增強(qiáng)的突變啟動(dòng)子PbrnFE7,獲得高產(chǎn)4-羥基-L-異亮氨酸谷氨酸棒桿菌ST17,產(chǎn)量達(dá)到135.3 mmol/L。

3 展望

微生物細(xì)胞工廠(chǎng)的構(gòu)建以滿(mǎn)足工業(yè)需求為導(dǎo)向加快市場(chǎng)應(yīng)用,經(jīng)過(guò)多年的研究積累,谷氨酸棒桿菌從誘變育種到基于先驗(yàn)知識(shí)和模擬計(jì)算理性設(shè)計(jì),利用新型技術(shù)對(duì)微生物底盤(pán)進(jìn)行改造,達(dá)到“建物致用”的目標(biāo),應(yīng)用基因型-表型關(guān)聯(lián)技術(shù),通過(guò)高通量篩選獲得不同特性的工業(yè)微生物細(xì)胞工廠(chǎng),極大提高了谷氨酸棒桿菌細(xì)胞工廠(chǎng)的創(chuàng)制效率,然而細(xì)胞工廠(chǎng)物質(zhì)和能量代謝受時(shí)空的影響及復(fù)雜多元化的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍然是制約其工業(yè)應(yīng)用的瓶頸[54]。盡管目前的改造和檢測(cè)手段眾多,能夠從多方面獲取不同優(yōu)良性狀的微生物底盤(pán),但目前的技術(shù)和日益增長(zhǎng)的微生物細(xì)胞工廠(chǎng)需求依然存在巨大差異,缺乏對(duì)多層次信息的理解和應(yīng)用。

隨著合成生物學(xué)、生物信息學(xué)及人工智能的發(fā)展,有望克服這些難題,使得包括先進(jìn)的人工智能輔助設(shè)計(jì)、復(fù)雜基因網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)調(diào)控、基因組編輯、超高通量篩選、智能檢測(cè)、智能自動(dòng)化生物平臺(tái)在內(nèi)的前沿技術(shù)的結(jié)合將合成生物推向下一個(gè)階段[55],實(shí)現(xiàn)生物制造到生物智造的變革,突破合成生物學(xué)科技創(chuàng)新,開(kāi)發(fā)出更為經(jīng)濟(jì)、高效、可持續(xù)發(fā)展的工業(yè)微生物細(xì)胞工廠(chǎng),加快推動(dòng)生物智造在輕化工、醫(yī)藥、能源等領(lǐng)域的規(guī)?；瘧?yīng)用,完善生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系,使生物經(jīng)濟(jì)實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量發(fā)展。