于笛,傅志宇,姜鵬飛,李龍,劉煜珺,方梓鎣,李雙雙,5,鄭杰*

1(遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院,遼寧 大連,116023)2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)與發(fā)掘利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連,116023)3(大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,遼寧 大連,116034)4(大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧 大連,116023)5(大連鑫玉龍海洋生物種業(yè)科技股份有限公司,遼寧 大連,116222)

海參(Stichopusjaponicus)屬于棘皮動(dòng)物門海參綱,是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)品,年產(chǎn)值達(dá)千億元人民幣[1]。海參體壁主要由膠原蛋白、蛋白聚糖和糖蛋白組成[2],作為高蛋白低脂肪的水產(chǎn)品,海參已被證實(shí)具有免疫調(diào)節(jié)[3]、神經(jīng)保護(hù)[4]、抗疲勞[5]和抗氧化[6]等多種生物活性。隨著消費(fèi)者對(duì)合理膳食結(jié)構(gòu)和健康生活方式的追求,海參產(chǎn)品越來(lái)越受到市場(chǎng)的青睞,產(chǎn)業(yè)鏈不斷壯大。2021年我國(guó)刺參養(yǎng)殖面積達(dá)24.74萬(wàn)hm2,養(yǎng)殖產(chǎn)量22.27萬(wàn)t[7]。由于極易自溶,海參多數(shù)是以加工產(chǎn)品的方式銷售,目前市場(chǎng)上主要產(chǎn)品形式為干海參和即食海參。干海參水分含量低,利于長(zhǎng)期貯藏且便于運(yùn)輸,但食用前需要較為復(fù)雜的復(fù)水處理。即食海參屬于預(yù)制菜的一種,因其食用方便且兼顧了營(yíng)養(yǎng)與便利而受到消費(fèi)者的歡迎,但即食海參通常需要冷凍保存,在常溫甚至冷藏條件下海參體壁極易出現(xiàn)品質(zhì)劣變的現(xiàn)象,影響了其市場(chǎng)占有率。目前已有部分針對(duì)即食海參貯藏期間變化的相關(guān)研究[8-9],但樣品處理均在實(shí)驗(yàn)室完成,與實(shí)際生產(chǎn)有一定差異。本文擬通過對(duì)4 ℃條件下市售即食海參體壁品質(zhì)變化規(guī)律的研究,探究影響即食海參貯藏穩(wěn)定性的原因,旨在為即食海參的穩(wěn)定化加工及貯藏提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料:即食海參80只,每只質(zhì)量約50～60 g,購(gòu)于大連市某海參加工企業(yè)。新鮮海參經(jīng)解剖、鹽煮、泡發(fā)、速凍、包裝后冷凍保存,保溫箱加冰袋密封3 h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

H型氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(每種氨基酸濃度2.50 μmol/mL,日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社);羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、一水合檸檬酸、無(wú)水乙酸鈉、氯胺T、對(duì)二氨基苯甲醛,阿拉丁生化科技股份有限公司;海參組織蛋白酶L測(cè)定試劑盒,上海酶聯(lián)生物有限公司;其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204分析天平、HB43-S水分測(cè)定儀、FE20K酸度計(jì),瑞士梅特勒托利多科技有限公司;LG-1.0真空冷凍干燥機(jī),沈陽(yáng)航天新陽(yáng)速凍設(shè)備制造有限公司;PEN3電子鼻,德國(guó)Airsense公司;TA.XT Plus物性測(cè)試儀,英國(guó)Stable Micro System公司;Spectra Max Plus384酶標(biāo)儀,美國(guó)美谷分子儀器有限公司;SX700高壓蒸汽滅菌器,日本多美數(shù)字生物公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;IN612C低溫培養(yǎng)箱,日本雅馬拓科技株式會(huì)社;L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀、SU810掃描電子顯微鏡,日本株式會(huì)社日立制作所。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的貯藏

將即食海參樣品分為8組,每組10只,在4 ℃條件下貯藏14 d,每2 d取一次樣,拍照記錄海參形態(tài)。

1.3.2 質(zhì)量損失率的測(cè)定

將樣品放入培養(yǎng)皿中,分別測(cè)定樣品總質(zhì)量、體壁質(zhì)量和液體質(zhì)量,質(zhì)量損失率按公式(1)計(jì)算:

(1)

式中:M,質(zhì)量損失率,%;m1,液體質(zhì)量,g;m,樣品總質(zhì)量,g。

1.3.3 水分含量的測(cè)定

采用快速水分測(cè)定儀對(duì)樣品水分進(jìn)行測(cè)定。稱取3.0 g樣品,采用標(biāo)準(zhǔn)升溫程序在105 ℃條件下進(jìn)行干燥,每組做3個(gè)平行。

1.3.4 菌落總數(shù)的測(cè)定

采用GB 4789.2—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》中的方法進(jìn)行,25 g樣品加入225 mL無(wú)菌生理鹽水,均質(zhì)后進(jìn)行梯度稀釋,取1 mL稀釋液加入平板并倒入20 mL平板計(jì)數(shù)瓊脂,混勻,待瓊脂凝固后將平板倒置于30 ℃條件下培養(yǎng)72 h后進(jìn)行計(jì)數(shù),按公式(2)計(jì)算:

(2)

式中:N,樣品中菌落總數(shù), CFU/g;∑C,平板菌落數(shù)之和;n1,第一稀釋度平板個(gè)數(shù):n2,第二稀釋度平板個(gè)數(shù);d,稀釋因子。

1.3.5 pH值的測(cè)定

采用GB 5009.237—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測(cè)定》中的方法,稱取10 g絞碎樣品,加入新煮沸后冷卻的水至100 mL,搖勻,浸漬30 min,6 000 r/min離心10 min,取50 mL上清液于100 mL燒杯中測(cè)定pH值。

1.3.6 組織蛋白酶L活力的測(cè)定

采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定樣品組織蛋白酶活性。將樣品用生理鹽水稀釋并搗碎后,于3 000 r/min離心10 min,將一定濃度的上清液加入預(yù)先包被組織蛋白酶抗體的微孔中,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體,37 ℃孵育60 min,加入顯色劑,37 ℃避光孵育15 min,加入終止液,在450 nm處測(cè)定OD值,按曲線方程計(jì)算樣品濃度。

1.3.7 質(zhì)構(gòu)的測(cè)定

取海參背部中間一塊表面積1.5 cm×1.5 cm的體壁,將表面的疣足修理平整后進(jìn)行測(cè)定。選用P/0.5柱形探頭,形變量50%,感應(yīng)力5 g。測(cè)前、測(cè)中、測(cè)后速度均為0.5 mm/s。

1.3.8 揮發(fā)性物質(zhì)的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取3 g勻漿后的樣品置于40 mL的頂空瓶?jī)?nèi),加蓋密封,37 ℃孵育30 min后進(jìn)行測(cè)定,每組3個(gè)平行。樣品采集時(shí)間120 s、自動(dòng)調(diào)零時(shí)間10 s、樣品準(zhǔn)備時(shí)間5 s、進(jìn)樣流量300 mL/min,傳感器清洗時(shí)間200 s。

1.3.9 膠原蛋白含量的測(cè)定

參考PROCKOP等[10]的方法。樣品水解過濾后,蒸至剩余約1滴后進(jìn)行定容,加入氯胺T與顯色劑,在558 nm處測(cè)定吸光值,計(jì)算羥脯氨酸的含量,并最終換算成膠原蛋白的含量,換算系數(shù)為11.1。

1.3.10 氨基酸含量的測(cè)定

游離氨基酸含量參考張?zhí)K平等[11]的方法。取一定量樣品,加入少量0.02 mol/L 鹽酸溶解并定容至25 mL,超聲波提取20 min,6 000 r/min離心10 min,上清液過0.22 μm膜后,采用全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定。

氨基酸總量的測(cè)定采用GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》中酸水解方法。樣品加入6 mol/L 鹽酸后,110 ℃條件下水解22 h,經(jīng)過濾、定容、濃縮后,采用全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.11 掃描電鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)

取海參背部中間1 mm×1 mm×3 mm左右大小樣品,2.5%戊二醛固定12 h后,0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗。乙醇梯度脫水(30%、50%、70%、80%、100%),二氧化碳臨界點(diǎn)干燥,離子噴金鍍膜后在掃描電子顯微鏡下觀察[12]。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS Statistics 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和顯著性差異分析,P<0.05為顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 即食海參貯藏過程中形態(tài)的變化

如圖1所示,貯藏0 d時(shí),海參肉質(zhì)飽滿、疣足挺拔、表皮完整、彈性較好,有少量汁水。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),體壁內(nèi)液體不斷析出,同時(shí)體積縮小,但在整個(gè)貯藏期內(nèi)形態(tài)均較為完整。在貯藏1周后,體積縮小明顯,汁水大量析出,雜質(zhì)變多。貯藏10 d后,體壁上的疣足開始分解,出現(xiàn)部分殘缺,14 d時(shí)表皮開始變軟、變黏,色澤變化不大。

圖1 即食海參4 ℃貯藏期間形態(tài)變化Fig.1 Changes in body wall morphology of instant sea cucumber during storage at 4 ℃

2.2 即食海參貯藏過程中質(zhì)量損失率的變化

如圖2所示,新鮮即食海參質(zhì)量約為50 g,隨著汁液的不斷流失,貯藏8 d質(zhì)量降至40 g以下,而后迅速下降并在12 d后降至30 g左右。加工過程中的高溫加熱會(huì)使海參體壁的膠原蛋白變性,使膠原纖維形成交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[13],內(nèi)部出現(xiàn)氣孔[14],泡發(fā)過程中,這些結(jié)構(gòu)會(huì)不斷吸水使海參體積不斷增大,吸水能力增加。即食海參的初始質(zhì)量損失率約為6.59%,4 ℃條件下,體壁蛋白降解,組織內(nèi)水分的流動(dòng)性增強(qiáng),組織對(duì)水分的束縛力逐漸減弱,質(zhì)量損失率迅速增加,在貯藏6 d時(shí)質(zhì)量損失率達(dá)21.85%,在貯藏14 d時(shí)達(dá)到40.27%。

圖2 即食海參4 ℃貯藏期間質(zhì)量損失率的變化Fig.2 Mass loss rate changes of instant sea cucumber during storage at 4 ℃

2.3 即食海參貯藏過程中水分含量的變化

如圖3所示,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),體壁含水量呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì),從96.32%降至93.62%。體壁內(nèi)游離水增加、結(jié)合水降低[15],可溶性成分隨水從漲發(fā)變大的組織間隙流出,導(dǎo)致海參組織劣化。

圖3 即食海參4 ℃貯藏期間水分含量的變化Fig.3 Water content changes of instant sea cucumber during storage at 4 ℃

2.4 即食海參貯藏過程中菌落總數(shù)的變化

如圖4所示,貯藏2 d時(shí)菌落總數(shù)與新鮮海參相差不大,維持在6×105CFU/g左右,而后部分微生物在冷藏和高水分條件下開始恢復(fù)代謝,加速生長(zhǎng),在貯藏6 d時(shí)增加到2.3×106CFU/g,已知細(xì)菌總數(shù)105CFU/cm2的魚體在0 ℃條件下保質(zhì)期約為6 d,即食海參在貯藏1周后食用價(jià)值也大大降低。當(dāng)菌落總數(shù)大于5×106CFU/g時(shí)表示肉已變質(zhì)[16],在貯藏14 d時(shí),菌落總數(shù)增加了約5倍,達(dá)到3.7×106CFU/g,體壁黏軟有異味。

圖4 即食海參4 ℃貯藏期間菌落總數(shù)的變化Fig.4 Total number of bacterial colony changes in instant sea cucumber during storage at 4 ℃

2.5 即食海參貯藏過程中pH的變化

如圖5所示,一般食品中pH變化多呈V字形改變,在腐敗開始時(shí)略微降低,隨后由于微生物對(duì)蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)生氨類和三甲胺等堿性物質(zhì)導(dǎo)致pH上升[17]。即食海參的pH值在貯藏期內(nèi)從初始的8.73降到6.88,并未出現(xiàn)升高,表明產(chǎn)品并未出現(xiàn)嚴(yán)重腐敗現(xiàn)象。

圖5 即食海參4 ℃貯藏期間pH值的變化Fig.5 pH value changes of instant sea cucumber during storage at 4 ℃

2.6 即食海參貯藏過程中組織蛋白酶L活力的變化

研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)源酶中的組織蛋白酶對(duì)肉制品的品質(zhì)變化有重要影響[8]。海參因含有豐富的內(nèi)源酶而具有較強(qiáng)的自溶能力[18],新鮮海參的組織蛋白酶L活力通常在3 000 U/mg以上。已有研究表明組織蛋白酶L會(huì)間接影響膠原蛋白的降解[19]。如圖6所示,本研究中的即食海參樣品的組織蛋白酶在貯藏期內(nèi)均維持在很低的水平,從初始的149.28 U/mg緩慢降至113.11 U/mg,變化不大。推測(cè)其已經(jīng)在加工過程中遭到破壞,考慮其并不是引起即食海參品質(zhì)變化的主要因素。

圖6 即食海參4 ℃貯藏期間組織蛋白酶L活力的變化Fig.6 Cathepsin L activity changes of instant sea cucumber during storage at 4 ℃

2.7 即食海參貯藏過程中質(zhì)構(gòu)特性的變化

選用柱形探頭對(duì)樣品進(jìn)行2次擠壓來(lái)模擬人嘴巴的咬合動(dòng)作,探究貯藏過程中即食海參被咀嚼時(shí)的變化。如表1所示,共檢測(cè)出硬度、彈性、內(nèi)聚性、膠黏性、咀嚼性、回復(fù)性6個(gè)指標(biāo),脆性、粘連性和黏性3個(gè)指標(biāo)未測(cè)出,說明即食海參體壁在擠壓過程中沒有出現(xiàn)破碎,同時(shí)也沒有和探頭產(chǎn)生粘連現(xiàn)象。結(jié)果顯示,海參的硬度、膠黏性和咀嚼性與貯藏時(shí)間總體呈負(fù)相關(guān),彈性和內(nèi)聚性與貯藏時(shí)間則呈正相關(guān)。

表1 即食海參4 ℃貯藏期間質(zhì)構(gòu)特性的變化Table 1 Texture properties changes of instant sea cucumber during storage at 4 ℃

硬度從很大程度上決定了海參的口感,硬度過大,不易咀嚼和消化吸收,硬度過小,肉質(zhì)綿軟,沒有勁道。貯藏前即食海參硬度為(1 276.31±342.71) g,前4 d硬度變化不顯著,6 d時(shí)下降顯著(P<0.05)而后緩慢下降至(748.98±235.06) g。咀嚼性是彈性與膠黏性的乘積,表示咀嚼即食海參所需的能量,在貯藏期間呈緩慢下降的趨勢(shì)但差異不顯著(P>0.05)。林琳等[20]的研究表明,貯藏過程中即食海參的硬度和咀嚼性均呈下降趨勢(shì)。彈性是指海參體壁變形后恢復(fù)原狀的能力。內(nèi)聚性是使體壁聚在一起的能力,貯藏0 d時(shí),海參體壁擠壓后能恢復(fù)到原來(lái)的84%,內(nèi)聚性為0.78,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),汁液不斷流失,彈性和內(nèi)聚性緩慢上升,貯藏14 d時(shí)可恢復(fù)到原來(lái)的91%,內(nèi)聚性升高到0.90,可見持水力的降低對(duì)即食海參貯藏過程中的彈性有較大影響。加工方式和復(fù)水條件都對(duì)持水力有較大的影響[21]?；貜?fù)性在某種程度上可以理解為韌性,是指第一次下壓時(shí),樣品原面積與形變之后面積的比值?；貜?fù)性在0～2 d較為穩(wěn)定,在貯藏4 d和10 d時(shí)出現(xiàn)顯著增加(P<0.05)。

2.8 即食海參貯藏過程中揮發(fā)性物質(zhì)的變化

海參蛋白質(zhì)含量豐富,其腐敗變質(zhì)主要以蛋白質(zhì)的分解為特征,分解產(chǎn)物多數(shù)具有揮發(fā)性,因此通過電子鼻模擬嗅覺系統(tǒng)測(cè)定揮發(fā)物質(zhì)的變化,收集氣味指紋數(shù)據(jù),能夠從氣味角度了解蛋白降解情況[22]。含硫化合物的閾值和濃度對(duì)水產(chǎn)品的氣味特征有重要影響[23]。由圖7可知,即食海參在貯藏前6 d的主要揮發(fā)性物質(zhì)為無(wú)機(jī)硫化物,還含有少量的有機(jī)硫化物和氮氧化合物。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),海參中的蛋白質(zhì)在微生物的作用下發(fā)生降解,生成醛、酮、酸和含硫的小分子化合物[24],并不斷積累,從8 d開始,含甲基類化合物、無(wú)機(jī)硫化物和醇類、酮類物質(zhì)逐漸增多,氮氧化合物則相應(yīng)減少。

W1C-芳香成分,苯類;W5S-氮氧化合物;W3C-芳香族成分,氨類;W6S-氫化物;W5C-短鏈烷烴芳香成分;W1S-甲基類;W1W-硫化物;W2S-醇類、酮類;W2W-芳香成分,有機(jī)硫化物;W3S-長(zhǎng)鏈烷烴圖7 即食海參4 ℃貯藏期間揮發(fā)性物質(zhì)的變化Fig.7 Volatile substances changes of instant sea cucumber during storage at 4 ℃

2.9 即食海參貯藏過程中膠原蛋白含量的變化

在14 d貯藏期內(nèi),各組樣品的膠原蛋白含量為27.27%～31.15%(表2),無(wú)明顯規(guī)律。顯著性分析結(jié)果表明,貯藏時(shí)間對(duì)膠原蛋白含量的影響不顯著。趙園園等[9]研究表明即食海參體壁膠原蛋白在15 d后開始快速降解。膠原蛋白含量的測(cè)定是通過測(cè)定樣品中羥脯氨酸的含量進(jìn)而換算出膠原蛋白含量,說明各組樣品的膠原蛋白未發(fā)生明顯水解或降解為多肽或羥脯氨酸階段而未進(jìn)一步降解。

表2 即食海參4 ℃貯藏期間膠原蛋白含量(干基)Table 2 Collagen content changes of in instant sea cucumber during storage at 4 ℃(dry basis)

2.10 即食海參貯藏過程中氨基酸種類及含量的變化

以游離狀態(tài)存在的氨基酸的種類和含量的變化能夠反映出蛋白質(zhì)降解的水平和程度[25]。如表3所示,氨基酸種類和含量在貯藏期內(nèi)均呈現(xiàn)不斷增加的趨勢(shì)。在貯藏前6 d,主要檢測(cè)到以Glu、Phe和Gly為主的7～9種氨基酸,在貯藏12 d時(shí)氨基酸種類增加到16種。游離氨基酸總量在0～10 d以平均每2 d 10 mg/100 g的速度遞增。10 d以后游離氨基酸總量迅速增加,14 d時(shí)達(dá)到(107.73±1.21) mg/100 g,說明樣品在貯藏10 d后開始加速分解。

表3 即食海參4 ℃貯藏期間游離氨基酸種類及含量的變化(干基) 單位:mg/100 g

樣品經(jīng)酸水解后共檢測(cè)到17種氨基酸(表4),氨基酸總量為68.52～77.21 g/100 g,其中以Glu和Gly含量最高,其次為Asp和Pro,氨基酸總量沒有明顯變化規(guī)律。

表4 即食海參4 ℃貯藏期間氨基酸總量含量的變化(干基) 單位:g/100 g

2.11 掃描電鏡觀察結(jié)果

鮮活刺參中含有粗細(xì)不等的束狀纖維,纖維束間孔隙度較大[26]。即食海參加工過程中長(zhǎng)時(shí)間的加熱處理,會(huì)使束狀纖維發(fā)生熱收縮、卷曲、凝聚,纖維間孔隙度減小,纖維排列緊密。隨著蛋白質(zhì)變性程度不斷增強(qiáng),膠原纖維斷裂,肌肉組織中的纖維變性成明膠狀物質(zhì),部分纖維會(huì)聚集形成片狀結(jié)構(gòu)[27]。從電鏡觀察結(jié)果來(lái)看(圖8),即食海參的纖維結(jié)構(gòu)已經(jīng)不是很清晰,0 d時(shí)能觀察到大致的纖維結(jié)構(gòu),而后主要以凝膠狀和片狀結(jié)構(gòu)為主,未觀察到明顯變化。

a-貯藏0 d;b-貯藏2 d;c-貯藏4 d;d-貯藏6 d;e-貯藏8 d;f-貯藏10 d;g-貯藏12 d;h-貯藏14 d圖8 即食海參4 ℃貯藏期間掃描電鏡觀察結(jié)果(×1 500)Fig.8 Scanning electron microscope observation results of instant sea cucumber during storage at 4 ℃ (×1 500)

3 結(jié)論

即食海參在4 ℃冷藏保存6 d后品質(zhì)下降明顯,表現(xiàn)為體積縮小、硬度降低、氣味變化、游離氨基酸種類增多等。影響即食海參體壁品質(zhì)劣變的主要因素是微生物作用,水分的流失也對(duì)其貯藏期間的品質(zhì)變化有重要影響。目前市場(chǎng)上絕大多數(shù)的即食海參產(chǎn)品均需冷凍保存,解凍后方能食用,不能做到冷藏保存、常溫保存、開袋即食。因此,關(guān)于提高即食海參常溫條件下貯藏穩(wěn)定性的相關(guān)研究具有重要意義。