田方,徐詠菁,孫志棟,周琦,王志遠,華鎮(zhèn)南,蔡路昀*

1(浙江海洋大學 食品與藥學學院,浙江 舟山,316022)2(浙江省海產品健康危害因素關鍵技術研究重點實驗室,浙江 舟山,316022)3(浙江大學寧波研究院,生物系統(tǒng)工程與食品科學學院,浙江 寧波,315100)

獼猴桃是我國的傳統(tǒng)水果,海沃德為主栽品種之一,占我國獼猴桃種植面積的80%～90%[1]。獼猴桃被譽為“維生素C之王”,含有豐富的糖、鞣質、果膠、葡萄糖酸以及鉀、鈣、鋅等微量礦物質元素,因其營養(yǎng)豐富,酸甜可口而備受消費者青睞[2-3]。獼猴桃加工成鮮切產品不僅方便食用,而且可提高其附加值[4]。然而,鮮切水果經修整、去皮、切割等加工處理后,其生理衰老、營養(yǎng)損失、風味下降等進程加速,果實表面也更易被微生物侵染,大大縮短了貨架期,同時可能導致食源性疾病的發(fā)生[5]。

常用于鮮切水果的殺菌保鮮技術可分為熱殺菌和非熱殺菌。熱殺菌技術包括巴氏殺菌、瞬時高溫滅菌、適度熱處理結合其他殺菌方式等,這類殺菌方法在處理鮮切水果時會因為產熱而破壞果蔬中的熱敏性營養(yǎng)成分并且影響風味[6-7]。而非熱殺菌技術則能有效保證鮮切水果原有的色、香、味及營養(yǎng)成分,且殺菌效果良好,已成為果蔬保鮮殺菌研究領域的熱點。其中,低溫等離子體(cold plasma, CP)作為新興的非熱殺菌保鮮技術,具有殺菌效果好、破壞性小、不產生有毒有害物質、短時無殘留等優(yōu)點,主要是利用由氣體分子電離所形成的一種包括自由電子、帶電離子、原子、原子團和分子等組成的正負電荷總量相等的離子化氣狀混合物,其中包括多種活性物質,如活性氧、自由基、紫外光子等,對食品的表面及內部進行殺菌,從而達到延長貨架期的目的[8-10]。與常規(guī)的紫外殺菌技術相比,CP處理可有效抑制細菌生長,對食品的殺菌效果更好,品質影響更小[11]。

目前,低溫等離子體技術在果蔬保鮮領域的應用研究較為廣泛。研究發(fā)現(xiàn),CP處理可使鮮切獼猴桃片在一定貯藏期內保持良好的保鮮效果,并延長貨架期,經CP處理后,不同的貯藏溫度也會對鮮切獼猴桃片的某些品質特性(色差、脆性、維生素C含量及菌落總數(shù))產生顯著影響,并且可以利用品質指標和菌落總數(shù)建立貨架期預測模型[12-13]。RAMAZZINA等[14]研究表明,冷等離子處理可以有效延緩鮮切獼猴桃的腐敗時間。王照琪等[15]采用介質阻擋放電(dielectric barrier discharge, DBD)、滑動電弧放電2種不同等離子體放電技術處理鮮切獼猴桃,結果發(fā)現(xiàn)2種處理對鮮切獼猴桃均有良好的保鮮效果。TAPPI等[16]發(fā)現(xiàn)CP處理后,哈密瓜、菊苣切片等樣品的儲存時間明顯延長,且其品質及外觀變化甚可忽略。LI等[9]利用60 kV的CP處理鮮切火龍果300 s,發(fā)現(xiàn)樣品中的好氧菌數(shù)顯著降低,同時該處理促進了火龍果中的酚類物質積累及抗氧化活性的提高。低溫等離子體是一種有效抑制鮮切果蔬中微生物生長繁殖,提高其貯藏品質并延長貨架期的殺菌保鮮技術,該技術發(fā)展迅猛,市場應用潛力巨大,但有關低溫等離子體對鮮切獼猴桃片微觀結構影響的研究仍較鮮見[17]。因此,本研究以鮮切獼猴桃片為材料,研究DBD低溫等離子體的處理電壓及時間對鮮切獼猴桃片微觀結構及理化特性的影響,進一步豐富了CP技術用于鮮切獼猴桃片殺菌保鮮的理論研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海沃德獼猴桃,陜西周至。三氯乙酸、乙二胺四乙酸二鈉、鄰苯二酚、NaOH標準溶液、草酸、抗壞血酸、醋酸、愈創(chuàng)木酚、鄰苯二酚、Na2HPO4、NaCl、無水CH3COONa、NaH2PO4等,上海滬試國藥集團化學試劑有限公司;以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

BK130/36低溫等離子體,美國PHENIX科技有限公司;U-5100可見光分光光度計,日本HITACHI公司;CS-210精密色差儀,杭州彩譜科技有限公司;Mira 3 XH場發(fā)射高分辨掃描電子顯微鏡,捷克TESCAN公司;Q150T ES PLUS高真空離子濺射鍍膜儀,英國QUORUM公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 獼猴桃樣品預處理

選取成熟程度一致、大小相近且表面無機械損傷、無病蟲害的獼猴桃若干個,清洗表面后去除表皮,切成厚度約為10 mm的獼猴桃片。將獼猴桃片裝入保鮮盒,每盒90 g左右,每盒4片,放一層,然后用PE自封袋包裝。

1.3.2 低溫等離子體處理

將預處理獼猴桃片分為對照組和處理組,對照組不作任何處理,將處理組進行CP處理,條件為:40 kV 90 s、40 kV 120 s、50 kV 90 s、50 kV 120 s。將所有組置于4 ℃冰箱冷藏以模擬超市真實貯藏環(huán)境,每天取樣測定鮮切獼猴桃片的各項指標,每個指標重復測定3次,共測定7 d。

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 菌落總數(shù)

參照GB 4789.2—2022《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》測定。

1.3.3.2 微觀結構觀察

參照TAGLIENTI等[18]的方法進行測定。樣品首先用體積分數(shù)1%的鋨酸溶液固定1～2 h,倒掉固定液,用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液漂洗3次,每次15 min。用梯度濃度(30%、50%、70%、80%、90%和95%,體積分數(shù))的乙醇溶液對樣品進行脫水處理,每種濃度處理15 min,再依次用100%的乙醇和純丙酮分別處理20 min。最后將脫水樣品噴金(電流15 mA,噴金30 s),上機測試(測試電壓5 kV,工作距離10 mm),得到反映試樣表面形貌的二次電子圖像。

1.3.3.3 亮度測定

參考SELCUK等[19]的方法,用色差儀(CS-210)測量鮮切獼猴桃片的L*值。

1.3.3.4 失重率測定

參照吳瓊[20]的方法測定,每天測量對照組和處理組樣品的質量,測量前使用吸水紙吸去散失在表面以及盒子上的水分,失重率(W)的計算如公式(1)所示:

(1)

式中:m,試驗當天質量,g。

1.3.3.5 可滴定酸(titratable acid, TA)測定

參照侯瑩等[21]的方法:稱取50 g鮮樣研磨后離心,取3 mL上清液加5 mL蒸餾水,再滴加3～4滴酚酞溶液,用1 g/L NaOH溶液進行滴定,至出現(xiàn)淡紅色,記下NaOH溶液的用量,重復測定3次。

1.3.3.6 pH值測定

參照AZADBAKHT等[22]的方法,用PHS-3C精密pH計測定,每組平行測定3次。

1.3.3.7 可溶性固形物含量(soluble solid content, SSC)測定

參照PAULAUSKIENE等[23]的方法測定。每組樣品混合打漿后于5 000 r/min離心5 min,取上清液測定2個平行,每個處理重復4次。

1.3.3.8 維生素C含量測定

參考曹建康等[24]的方法,用紫外可見分光光度計在243 nm處測定吸光度值,重復測定3次。

1.3.3.9 丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量測定

參照曹建康等[24]的方法,略微修改,5 g樣品用20 mL三氯乙酸(50 g/L)均質。在95 ℃加熱15 min后,快速冷卻,12 000 r/min離心15 min。在450、532、600 nm處測定其吸光度值,重復3次。

1.3.3.10 多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)及過氧化物酶(peroxidase, POD)活性測定

參照文獻[25-26]的方法并加以改進,用6 mL 100 mmo1/L(pH 7.8)(內含1.0 mmo1/L EDTA、50 g/L PVP、10 mL/L Triton X-100)的磷酸緩沖液,提取上清液。PPO采用磷酸鹽緩沖液2 mL(pH 6.8)、100 mmo1/L 4-甲基鄰苯二酚1 mL和上清液2 mL進行測定;POD采用0.5 mL上清液、2.9 mL磷酸緩沖液(pH 6.8)、1 mL體積分數(shù)0.08%H2O2和2 mL體積分數(shù)0.1%愈創(chuàng)木酚進行測定。

1.4 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)平行測定3次,結果表示為平均值±標準差,利用Excel統(tǒng)計數(shù)據(jù),SPSS對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析(顯著水平為P<0.05),Origin 2018軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 低溫等離子體處理對鮮切獼猴桃片菌落總數(shù)的影響

如圖1所示,在整個貯藏期間,對照組鮮切獼猴桃片的菌落總數(shù)呈顯著增長的趨勢(P<0.05),各處理組樣品的菌落總數(shù)顯著低于對照組(P<0.05)。貯藏第1天,對照組樣品的菌落總數(shù)為2.54 lg CFU/g,經不同電壓和時間的CP處理(40 kV 90 s、40 kV 120 s、50 kV 90 s、50 kV 120 s)后,各處理組樣品的菌落總數(shù)依次下降了0.28、0.43、0.59、0.52 lg CFU/g。貯藏末期(第6天),對照組樣品菌落總數(shù)高達5.94 lg CFU/g,接近果蔬產品菌落總數(shù)的最低限值(6 lg CFU/g)[4],而不同處理組的菌落總數(shù)值在第7天時仍遠遠低于該限值,分別為5.38、5.33、4.52、4.51 lg CFU/g。可見不同條件的CP處理對鮮切獼猴桃片均有一定的殺菌作用,能夠最大限度地延長鮮切獼猴桃片的貨架期。

圖1 低溫等離子體處理對鮮切獼猴桃片菌落總數(shù)的影響Fig.1 Effect of cold plasma treatment on the total number of colonies of fresh-cut kiwifruit slices注:大寫字母不同表示同一處理在不同貯藏時間內有顯著差異;小寫字母不同表示不同處理在相同貯藏時間內有顯著差異(P<0.05)(下同)。

2.2 低溫等離子體處理對鮮切獼猴桃片亮度和失重率的影響

鮮切獼猴桃片亮度常用L*值的變化表示,該值可以表征果實的褐變程度。由圖2-a可知,在貯藏期間,所有樣品的L*值均有所減小。其中,對照組樣品L*值下降幅度最大,小于各處理組,7天內從64.31降至55.49;貯藏第7天,對照組L*值顯著小于所有的處理組(P<0.05)。L*值越小表明鮮切獼猴桃片色澤越暗淡,這可能是因為CP處理可抑制POD、抗壞血酸過氧化物酶及葉綠素降解酶活性,減緩葉綠素降解,從而減小亮度損失,使得處理組L*值更高[13]。陳月圓等[12]同樣采用低溫等離子體處理鮮切獼猴桃片,L*值的變化趨勢與本研究大致相同。這些研究結果說明CP處理能夠明顯改善鮮切獼猴桃片的褐變,有效延緩色澤變暗,但不同的處理電壓及時間對樣品亮度無顯著性影響(P>0.05)。

由圖2-b可知,整個貯藏期間,所有組別樣品的失重率均呈現(xiàn)逐漸上升趨勢,對照組鮮切獼猴桃片的失重率明顯上升且高于處理組。果實采后貯藏期間仍進行呼吸作用等新陳代謝活動,不斷消耗能量,導致果實質量減少,而經CP處理后,鮮切獼猴桃片的呼吸作用受到抑制,使得水分散失減少,因而處理組樣品的失重率低于對照組[27]。貯藏至第4天,40 kV 120 s、50 kV 90 s和50 kV 120 s處理組的失重率均為0.5%。貯藏末期(第7天),處理組鮮切獼猴桃片的失重率顯著低于對照組(P<0.05),其中,相同處理電壓,不同處理時間的組別之間呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。隨著處理時間的延長,鮮切獼猴桃片的失重率不斷上升,與任翠榮等[28]研究在常壓低溫等離子體處理下,不同處理時間草莓失重率變化的結果相似?？偟膩碚f,在50 kV電壓下處理90 s更有利于減少果實損傷并抑制其失重率增加。

2.3 低溫等離子體處理對鮮切獼猴桃片TA含量、pH值、SSC含量的影響

TA是衡量果實營養(yǎng)品質的指標之一,會影響果實的食用風味[29]。從整體看,所有組別樣品的TA含量隨著貯藏時間的延長而逐漸降低。TA主要由多種有機酸構成,隨著果實成熟度增加,有機酸分解,導致TA含量下降,有機酸的降解速率可反映其呼吸作用的強弱[30]。由圖3-a可知,貯藏前5 d,對照組TA含量呈顯著降低趨勢(P<0.05),在此期間TA不斷分解為呼吸作用供能,后期有所回升,可能是因為鮮切水果具有代謝活性,在貯藏過程中依然進行著新陳代謝活動[31]。貯藏結束時,處理組樣品TA含量顯著高于對照組(P<0.05),50 kV 90 s和120 s處理組的TA含量變化趨勢與40 kV 90 s處理組相似,它們在貯藏后期均略高于40 kV 120 s處理組。這表明CP處理能較有效地延緩果實TA含量的下降,保持較好的風味和可食用性。

a-TA;b-pH;c-SSC圖3 低溫等離子體處理對鮮切獼猴桃片TA含量、pH值和SSC含量的影響Fig.3 Effect of cold plasma treatment on TA content, pH value, and SSC content in fresh-cut kiwifruit slices

測定貯藏過程中果蔬的pH值變化對研究其各項指標有著重要的意義,TA下降會表現(xiàn)為水果pH值上升[32]。如圖3-b所示,整個貯藏期內,所有組別鮮切獼猴桃片的pH值不斷升高。貯藏末期,各處理組pH值顯著小于對照組(P<0.05),其中50 kV 90 s處理組的pH值最低,但各處理組間差異不明顯。結合TA的變化趨勢可知,50 kV處理90 s可有效抑制有機酸分解,維持TA,減緩pH值升高?？偟膩砜?CP處理可以一定程度上延緩鮮切獼猴桃片pH值的升高。

SSC不僅是果實風味的重要影響因素,也是呼吸代謝的主要底物,SSC含量的變化能反映果實的衰老情況[33]。由圖3-c可知,整個貯藏期間,所有組別鮮切獼猴桃片的SSC含量基本呈上升趨勢?？赡苁且驗殡S著貯藏期延長,鮮切獼猴桃片的成熟程度增加,呼吸代謝增強,淀粉分解為單糖,果實軟化,導致SSC含量上升[31]。經CP處理的樣品SSC含量大多高于對照組,且基本維持在較穩(wěn)定水平,其中50 kV 90 s處理組的SSC含量一直高于其他各組樣品,表明CP處理有助于維持果實中SSC含量的穩(wěn)定,有可能是由于CP處理過程中產生的活性氧對獼猴桃的呼吸具有抑制作用,因而減緩了SSC含量的變化[13]。

2.4 低溫等離子體處理對鮮切獼猴桃片維生素C和MDA含量的影響

如圖4-a所示,貯藏期間,所有鮮切獼猴桃片的維生素C含量均呈現(xiàn)下降趨勢,但經CP處理鮮切獼猴桃片的維生素C含量在貯藏期內各階段都顯著高于對照組,這與陳月圓等[12]的研究結果相似。40與50 kV處理鮮切獼猴桃片均能延緩果實中維生素C含量下降,經50 kV低溫等離子體處理90 s后,鮮切獼猴桃片維生素C含量顯著高于其他試驗組(P<0.05),貯藏7 d后其維生素C含量高出對照組56.67 mg/100 g。任翠榮等[28]研究發(fā)現(xiàn)一定范圍內的CP處理時間與電壓對草莓中的維生素C有良好的保護作用,能夠降低其中維生素C含量的損失,與本試驗結果相似。CP處理能夠減少貯藏期間鮮切獼猴桃片維生素C含量的損失,50 kV 90 s的CP處理最有利于維持維生素C含量,維生素C含量越高,表明果蔬越新鮮,其抗氧化能力越強,果實的營養(yǎng)品質可能也更佳。

MDA是組織膜脂過氧化產物,其含量高低是衡量組織衰老水平的重要指標[34]。由圖4-b可知,未經CP處理的鮮切獼猴桃片在貯藏期間的MDA含量呈現(xiàn)迅速上升趨勢,顯著高于其他各組(P<0.05),這說明CP處理能夠有效延緩鮮切獼猴桃片膜脂氧化,有助于維持細胞膜的通透性,保持其抗氧化能力。但處理電壓相同,處理時間延長會使CP處理產生的活性物質與鮮切獼猴桃片接觸過久,破壞細胞的膜結構,從而產生不良品質變化。本實驗結果表明,50 kV 90 s條件下,CP處理能夠保護鮮切獼猴桃片的膜結構,減少MDA的累積,與其他各組相比效果顯著(P<0.05)。

2.5 低溫等離子體處理對鮮切獼猴桃片PPO和POD活性的影響

PPO是植物中廣泛存在的催化酚類物質氧化的酶類,其活性的增加是果實內部組織開始走向衰老的重要特征[35-36]。圖5-a表明,各處理組鮮切獼猴桃片PPO活性的變化趨勢基本一致,前3 d呈現(xiàn)顯著地快速上升趨勢(P<0.05),隨后均有所下降,在貯藏后期又有所回升,這應該是因為鮮切獼猴桃片步入衰老期,對外抵抗下降,導致PPO活性增加[35]。貯藏后期(6～7 d),經CP處理鮮切獼猴桃片的PPO活性均顯著低于對照組(P<0.05),表明CP處理能夠在一定程度上延緩鮮切獼猴桃片的衰老,其中處理條件為50 kV 90 s時,鮮切獼猴桃片貯藏期間的PPO活性變化更為穩(wěn)定。

POD是植物在逆境條件下酶促防御系統(tǒng)產生的一種關鍵酶,其作用是清除細胞內的活性氧,同時能避免活性氧在植物體內的產生和積累[36]。如圖5-b所示,5組鮮切獼猴桃片的POD活性基本呈先上升后下降的趨勢,可能是在貯藏前期(1～5 d),隨著貯藏時間的增加,鮮切獼猴桃片中的H2O2增多,細胞膜脂質過氧化,低濃度的H2O2刺激POD活性增強,而貯藏后期(5～7 d),H2O2積聚更多,濃度升高,從而抑制了POD活性[37]。從整體來看,處理組鮮切獼猴桃片的POD活性低于對照組,應該是CP處理所產生的活性粒子,清除了鮮切獼猴桃片體內所產生的H2O2,延緩了細胞衰老,從而更有助于降低POD活性[13]。

2.6 低溫等離子體處理對鮮切獼猴桃片微觀結構的影響

利用掃描電子顯微鏡對不同CP處理鮮切獼猴桃片的微觀結構進行觀察。由圖6-a和圖6-b可知,貯藏第1天,對照組鮮切獼猴桃片的微觀結構較為平整,而CP處理后的樣品內部組織出現(xiàn)了輕微的褶皺。隨著貯藏期延長至第7天,與對照組相比,處理組鮮切獼猴桃片的微觀結構略微粗糙,褶皺程度變高。這可能是因為CP處理一定程度上導致了細胞結構的損傷,使鮮切獼猴桃片的細胞膜破裂,溶質流失,從而產生了些許褶皺[38]。此外,依圖6-c和圖6-d所示,在貯藏初期,所有組鮮切獼猴桃片中的淀粉顆粒表面光滑飽滿,貯藏至第7天時,淀粉顆粒干癟或形態(tài)不完整,與對照組相比,CP處理組樣品中的淀粉顆粒整體變化差異不大,但隨著CP處理時間的增加,淀粉顆粒更加干癟?？赡苁且驗殡S著貯藏時間的增加,淀粉顆粒原本就發(fā)生了不同程度的消化和破碎,這是淀粉降解的痕跡,而CP處理時間的延長可能也在一定程度上加速了淀粉的降解[39]。結合鮮切獼猴桃片的L*值、MDA含量變化以及PPO、POD活性的變化趨勢,可以看出,CP處理對鮮切獼猴桃片的理化性質有較好的維持作用,因此雖然CP處理對鮮切獼猴桃片的微觀結構有一定的影響,但總體來看影響不大。總之,在貯藏期間,CP處理時間的增加會對鮮切獼猴桃片的微觀結構產生一定影響,而不同處理電壓對其影響較小。由此可知,適當?shù)腃P處理對鮮切獼猴桃片的微觀結構和形態(tài)影響不大。

3 結論

本文研究了貯藏期間,不同電壓及時間CP處理對鮮切獼猴桃片的微觀結構及相關理化特性的影響,得出以下結論:

隨著貯藏時間的延長,CP處理對鮮切獼猴桃片有較好的殺菌作用,有效延長了鮮切獼猴桃片的貨架期,同時鮮切獼猴桃片的失重率、pH值、SSC以及MDA含量呈上升趨勢,而L*值、TA和維生素C含量減少,PPO、POD活性則呈先上升后下降的趨勢。隨著CP處理時間的增加,鮮切獼猴桃片的失重率,MDA含量不斷上升,維生素C含量有所下降;而不同CP處理電壓對果實理化特性的影響較小。利用SEM觀察鮮切獼猴桃片的微觀結構和形態(tài),發(fā)現(xiàn)隨著貯藏時間的增加,果實內部組織出現(xiàn)少許褶皺,淀粉顆粒因降解而發(fā)生消化或破碎,與對照組相比,CP處理未對鮮切獼猴桃片的微觀結構及形態(tài)產生嚴重影響,造成損傷,合適的CP處理可基本維持其形態(tài)結構的完整。

對樣品的微觀結構和理化特性變化進行綜合分析發(fā)現(xiàn),鮮切獼猴桃片經50 kV電壓處理90 s后殺菌效果較好,微觀結構所受影響較小,維生素C含量最高且顯著高于對照組(P<0.05),且MDA含量、PPO和POD活性變化也較平緩。因此,利用適當時間和電壓的CP處理鮮切獼猴桃片,對于減緩其產品品質的劣變、延長貨架期具有重要意義。本研究為CP技術應用于鮮切獼猴桃片及其他鮮切果蔬的貯藏保鮮提供了理論支撐,同時為鮮切果蔬新型貯藏保鮮技術的研發(fā)提供了參考。