曲濤,程勇,王璐瀟,王召君,陳秋銘,曾茂茂,秦昉,陳潔,何志勇*

1(煙臺(tái)新時(shí)代健康產(chǎn)業(yè)有限公司,山東 煙臺(tái),264000)2(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122)

可可是錦葵科可可屬常綠喬木,歷史悠久,適宜在西非地區(qū)尼日利亞等國的熱帶地區(qū)種植。可可果實(shí)及種子中蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)成分含量較高,同時(shí)富含多酚等活性成分,經(jīng)發(fā)酵和烘焙等工藝后可制得可可粉及巧克力[1]?？煽啥喾?cocoa polyphenol,CP)是從可可豆中提取出來的天然成分,約占其干重的6%～8%[2]。CP的種類非常豐富,主要為原花青素(proanthocyandin,PC)、酚酸以及黃酮類化合物[3],其中PC的含量最高。CP具有很好的抗氧化能力,可抑制低密度脂蛋白膽固醇和脂質(zhì)的氧化、過氧化,增強(qiáng)人體內(nèi)的抗氧化應(yīng)激能力,對(duì)預(yù)防心血管、炎癥、代謝紊亂和癌癥等疾病具有積極作用[4]。此外,CP可為食品提供巧克力香氣、風(fēng)味與色澤,因而被廣泛添加到各類食品中,如可可飲料、巧克力冰淇淋、巧克力蛋糕等?？煽娠嬃鲜且钥煽啥埂⒖煽煞蹫樵?添加或不添加其他食品原輔料和食品添加劑,經(jīng)加工制成的飲料[5]。

多酚生物可及性是指經(jīng)胃腸道消化后,從食品基質(zhì)中釋放且可以被人體吸收的多酚物質(zhì)所占的比例,它可以反映多酚的消化穩(wěn)定性。此外,生物可及性是生物利用性的重要部分,生物利用性的高低決定著多酚在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮健康功能的效應(yīng)[6]。因此,探究多酚生物可及性對(duì)優(yōu)化食品加工工藝和為人們提供合理膳食建議具有重要意義?？煽娠嬃鲜窍M(fèi)者喜愛的飲料產(chǎn)品,提高該產(chǎn)品中CP生物可及性和營養(yǎng)健康性、優(yōu)化相關(guān)配方、改善加工方法,最終可以提高其市場經(jīng)濟(jì)價(jià)值。CP健康功能的發(fā)揮與其生物可及性和加工條件及食品組分對(duì)它的影響密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道,乳清蛋白(whey protein,WP)占牛乳蛋白的20%,含有亮氨酸、異亮氨酸等必需氨基酸,營養(yǎng)價(jià)值高,同時(shí)具有改善腦力、防御病菌等功能,且溶解性較優(yōu),易被人體吸收[7]。日常生活中,大多數(shù)飲料通過添加WP來增加蛋白質(zhì)含量和產(chǎn)品營養(yǎng)價(jià)值。然而,在熱加工可可飲料中,乳蛋白添加對(duì)CP生物可及性的影響及乳蛋白與CP的相互作用,目前尚不清楚。

因此,本研究以可可粉與WP混合溶液構(gòu)建可可飲料模擬體系,通過體外模擬消化實(shí)驗(yàn),探討不同熱處理?xiàng)l件下WP的添加對(duì)模擬體系中CP生物可及性的影響,然后選擇β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)與CP中的主要成分PC,通過圓二色光譜和熒光光譜技術(shù)進(jìn)一步探究不同熱處理?xiàng)l件下二者間的相互作用及其與CP生物可及性變化的關(guān)系。研究結(jié)果對(duì)于優(yōu)化可可飲料加工方法和配方,以及提升CP生物利用性和產(chǎn)品健康功能品質(zhì)具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PC(純度≥99%),南京春秋生物工程有限公司;可可粉,無錫華東可可食品股份有限公司;WP(純度≥90%),河北百味生物科技有限公司;胰酶,北京百靈威科技有限公司;β-LG(純度≥95%),美國Sigma公司;甲醇、福林酚試劑、Na2CO3、KCl、CaCl2、KH2PO4、NaHCO3、NaCl、MgCl2、(NH4)2CO3(均為分析純),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SB-4200DTD超聲波清洗機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;Chirascan V100圓二色光譜儀,英國應(yīng)用光物理公司;Fluoromax-4型熒光光譜儀,日本HITACHI公司;SevenEasy pH計(jì)、EL204電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;冷凍離心機(jī),美國Sigma-Aldrich公司;UV 5300PC型紫外-可見分光光度計(jì),上海元析儀器有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CP的制備

稱取1 g可可粉,加入15 mL體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇水溶液(含體積分?jǐn)?shù)0.5%的甲酸),于25 ℃下超聲波輔助提取30 min。提取液4 000×g離心10 min,收集上清液,殘?jiān)僦貜?fù)提取2次,合并上清液并定容至50 mL,得到CP的提取液樣品。

1.3.2 總酚含量測定

采用MOHD ROSLI等[8]的方法進(jìn)行總酚含量測定,略作修改,具體如下:取500 μL樣品置于離心管中,加入500 μL 100 g/L的福林酚試劑,渦旋振蕩混勻,放置2 min。加入4 mL 50 g/L的Na2CO3溶液,渦旋混勻樣品,40 ℃水浴20 min。之后冰浴冷卻,在765 nm測定吸光度。以20～100 mg/L的PC繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,總酚含量表示為PC當(dāng)量(mg/L)。

1.3.3 可可飲料模擬體系構(gòu)建

按照可可粉15 g/L、WP 5.6 g/L配制可可飲料模擬體系。常溫組:體系混合均勻后備用;85 ℃熱處理組:將混合均勻后的體系于85 ℃水浴中加熱30 min,加熱結(jié)束后立即置于冰水浴中冷卻;121 ℃熱處理組:將混合均勻后的體系于高壓蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行121 ℃/15 min處理,加熱結(jié)束后立即置于冰水浴中冷卻。以上制備獲得的樣品用于后續(xù)體外模擬消化實(shí)驗(yàn);另外,從其中取部分樣品在10 000 r/min離心10 min,取上清液進(jìn)行消化前體系中總酚含量測定。

1.3.4 體外模擬消化

按表1配制模擬口腔唾液、胃消化液和腸消化液。采用INFOGEST 2.0[9]進(jìn)行體外模擬消化實(shí)驗(yàn),分別對(duì)人體消化過程中口腔、胃、腸三個(gè)階段進(jìn)行模擬。

表1 體外模擬消化溶液的制備Table 1 Preparation of in vitro simulated digestion solutions

移取5.0 mL模擬體系于50 mL離心管中,加入4.0 mL 口腔唾液、25 μL 0.3 mol/L CaCl2以及975 μL超純水混合均勻并于37 ℃消化2 min?？谇浑A段模擬消化結(jié)束后,向離心管中加入8.0 mL胃消化液、1.6 mL胃蛋白酶溶液、5 μL 0.3 mol/L CaCl2、0.2 mL 1 mol/L HCl(調(diào)節(jié)pH至3.0)以及0.195 mL水,并將離心管在37 ℃水浴中振蕩消化2 h,之后,迅速將樣品置于冰浴冷卻。10 min后冷卻結(jié)束,向離心管中加入8.5 mL腸消化液、5.0 mL胰酶溶液、2.5 mL 160 mmol/L膽汁鹽溶液、40 μL 0.3 mol/L CaCl2、0.15 mL 1 mol/L NaOH(調(diào)節(jié)pH至7.0)以及3.81 mL水,之后再次將離心管于37 ℃水浴中振蕩消化2 h,之后,迅速將樣品置于冰浴冷卻。10 min后結(jié)束冷卻,在10 000 r/min下冷凍離心10 min,取上清液進(jìn)行總酚含量測定。以模擬體系消化液生物可及中多酚的含量表示體系中CP的絕對(duì)生物可及性,單位為mg/L。

1.3.5 圓二色譜

參照QIE等[10]的方法,略作修改。用pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液配制20 μmol/L β-LG和100 μmol/L PC的混合溶液,同時(shí)制備相同濃度的單獨(dú)β-LG和PC溶液作為對(duì)照,并同上述1.3.3節(jié)一樣進(jìn)行常溫、85 ℃/30 min和121 ℃/15 min的熱處理,冰浴冷卻后的樣品進(jìn)行圓二色譜檢測,設(shè)置帶寬1.0 nm,采樣時(shí)間間隔0.5 s,掃描范圍190～250 nm。

1.3.6 熒光淬滅光譜

參照YIN等[11]的方法,略作修改。使用pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液分別配制20 μmol/L的β-LG溶液(于4 ℃過夜水合)和1.0 mmol/L的PC溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。分別配制7個(gè)濃度梯度的PC-β-LG樣品,其中β-LG濃度均10 μmol/L,PC濃度梯度為0、10、25、40、50、80、100 μmol/L,并分別進(jìn)行如1.3.3節(jié)一樣的常溫、85 ℃/30 min和121 ℃/15 min熱處理,加熱結(jié)束后立即進(jìn)行冰浴冷卻,然后分別在25 ℃(298 K)、35 ℃(308 K)和45 ℃(318 K)恒溫條件下對(duì)每組樣品進(jìn)行熒光分析。熒光光譜測定條件:激發(fā)波長280 nm,狹縫波長5 nm,在300～450 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,并以相同濃度CP的緩沖溶液作為空白。

通過Stern-Volmer方程和雙對(duì)數(shù)Stern-Volmer方程分析PC對(duì)β-LG的熒光猝滅機(jī)理、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù),計(jì)算公式如公式(1)、公式(2)所示:

(1)

(2)

式中:F0,蛋白質(zhì)熒光體分子的熒光強(qiáng)度;F,蛋白質(zhì)熒光體分子與猝滅劑(PC)結(jié)合后的熒光強(qiáng)度;Kq,生物大分子猝滅過程中的速率常數(shù);τ0,熒光分子在無猝滅劑情況下的壽命常數(shù)(約為10-8s);KSV,動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù);[Q],猝滅劑濃度;KA和n分別代表猝滅劑與熒光分子相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

根據(jù)Van’t Hoff方程計(jì)算配體與蛋白質(zhì)間的熱力學(xué)參數(shù),計(jì)算如公式(3)所示:

ΔG=-RTlnKA

(3)

ΔG=ΔH-TΔS

式中:T,絕對(duì)溫度(K);KA,溫度T時(shí)的結(jié)合常數(shù);ΔH,結(jié)合焓變;ΔG,結(jié)合自由能變化;ΔS,結(jié)合熵變;R,氣體常數(shù)[8.314 J/(mol·K)]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。數(shù)據(jù)結(jié)果采用Statistix 9.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,并采用最小顯著性差異法分析平均值之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同熱處理?xiàng)l件下WP對(duì)CP提取物中總酚含量的影響

由圖1可知,CP和添加WP的CP體系在經(jīng)過熱處理(85 ℃/30 min和121 ℃/15 min)后總酚含量明顯增加。據(jù)ZZAMAN等[12]報(bào)道,熱處理會(huì)導(dǎo)致可可中酚類物質(zhì)含量明顯下降,但由于可可粉中含有蛋白質(zhì)、纖維素等物質(zhì),在常溫下與CP呈結(jié)合狀態(tài),而隨著溫度的升高,蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)發(fā)生降解,結(jié)合態(tài)的CP逐漸被釋放出來,同時(shí)溫度升高也會(huì)導(dǎo)致CP的溶解性增加,這會(huì)導(dǎo)致體系內(nèi)游離態(tài)CP增加的量大于其熱損失減少的量,故經(jīng)熱處理后總酚含量有所增加[13]。此外,在常溫和85 ℃/30 min條件下,WP的加入對(duì)CP體系內(nèi)游離總酚含量無顯著影響,但在121 ℃/15 min處理?xiàng)l件下,加入WP使CP中游離總酚含量下降13.43%。出現(xiàn)此現(xiàn)象的可能原因是在常溫和85 ℃條件下,CP與WP間的相互作用不顯著,但在121 ℃熱處理?xiàng)l件下,CP與WP間存在非常強(qiáng)烈的相互作用,因此使CP中游離總酚含量顯著下降。

圖1 熱處理對(duì)添加/不添加WP的CP提取物中總酚含量的影響Fig.1 Effects of heat treatment on the total phenolic contents of CP with/without WP addition注:不同字母表示不同組間存在顯著性差異(P<0.05)(下同)。

2.2 不同熱處理?xiàng)l件下WP對(duì)CP生物可及性的影響

由圖2可知,未添加WP時(shí),與常溫對(duì)照組相比,經(jīng)85 ℃/30 min和121 ℃/15 min處理后CP絕對(duì)生物可及性分別增加66.34%和219.63%。添加WP后,經(jīng)不同熱處理,與常溫對(duì)照組相比,經(jīng)85 ℃/30 min和121 ℃/15 min后CP絕對(duì)生物可及性分別增加39.46%和120.07%。CP的生物可及性顯著提高是由于熱處理導(dǎo)致CP從可可大分子中釋放并溶于水體系中的含量高于熱損失的含量[14]。

圖2 熱處理對(duì)添加/不添加WP的CP絕對(duì)生物可及性的影響Fig.2 Effects of heat treatment on the total phenolic bioaccessibility of CP with/without WP addition

在常溫和85 ℃/30 min處理?xiàng)l件下,WP加入后CP中總酚的生物可及性分別提高34.02%和12.37%,這說明在體外消化過程中WP的加入對(duì)CP具有保護(hù)作用。CP與WP結(jié)合形成的絡(luò)合物,對(duì)于不同消化階段的酸堿抵抗性增加,經(jīng)消化后其損失量將減少。此外,在常溫和85 ℃下,CP與WP的結(jié)合強(qiáng)度可能較低,容易與蛋白解離再次以游離形式進(jìn)入體系中,因此WP的加入會(huì)呈現(xiàn)保護(hù)作用大于削弱作用的情況。而在121 ℃/15 min處理下,加入WP會(huì)導(dǎo)致CP總酚的絕對(duì)生物可及性下降7.73%,這是由于經(jīng)121 ℃處理后,CP可能會(huì)與蛋白發(fā)生非常強(qiáng)烈的相互作用,從而與消化道體系中懸浮的顆粒物相結(jié)合,以結(jié)合態(tài)的形式存在,導(dǎo)致游離酚含量的下降[13-14]。

2.3 熱處理?xiàng)l件下可可飲料體系中β-乳球蛋白與原花青素相互作用

2.3.1 圓二色譜

由圖3可知,熱處理對(duì)于β-LG的圓二色性有較強(qiáng)影響,而PC的影響相對(duì)不明顯。由圓二色譜得到的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息如表2所示,與常溫相比,85 ℃/30 min會(huì)使β-LG的α-螺旋和無規(guī)則卷曲含量增加、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量降低,而121 ℃/15 min處理使β-LG的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量增加、β-折疊含量降低,這說明熱處理會(huì)使β-LG的結(jié)構(gòu)變得松散。此外,不同熱處理?xiàng)l件下PC的加入對(duì)β-LG二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響整體不大,呈現(xiàn)α-螺旋結(jié)構(gòu)稍微下降無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)輕微上升的趨勢,說明加入PC后由于多酚結(jié)合作用使β-LG的結(jié)構(gòu)變得松散[15]。

圖3 不同處理?xiàng)l件下β-LG的圓二色譜圖Fig.3 Circular dichroism spectra of β-LG with different treatments

表2 不同處理?xiàng)l件下β-LG的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量 單位:%

2.3.2 熒光光譜

2.3.2.1 熒光淬滅分析

從圖4中可知,β-LG在85 ℃和121 ℃加熱后熒光強(qiáng)度顯著增加,這可能與它在中性環(huán)境的變性溫度在65～68.5 ℃有關(guān)[16],在常溫下β-LG主要以二聚體形式存在,當(dāng)熱處理溫度高于變性溫度時(shí),β-LG二聚體會(huì)發(fā)生變性解體,同時(shí)熒光自消滅的Trp會(huì)減少,從而使得β-LG熒光強(qiáng)度增大。PC對(duì)β-LG的熒光具有明顯猝滅作用,且PC濃度越高,對(duì)β-LG熒光的猝滅效果越強(qiáng)烈。

β-LG在常溫條件下的最大發(fā)射波長(λmax)為332 nm,而β-LG在不同處理溫度下經(jīng)不同濃度PC作用后,其λmax幾乎不變,這說明PC對(duì)β-LG的Trp殘基的環(huán)境無明顯改變。當(dāng)PC濃度為100 μmol/L時(shí),PC在常溫、85 ℃以及121 ℃處理?xiàng)l件下(298K)對(duì)β-LG熒光值的猝滅率分別為73.03%、86.85%、97.42%,可見隨熱處理溫度的增加猝滅率增高,這可能與PC受熱氧化后,結(jié)構(gòu)改變,對(duì)β-LG的猝滅能力增強(qiáng)有關(guān)[17]。同時(shí),在高溫條件下,尤其是121 ℃處理下,PC濃度增加對(duì)β-LG猝滅程度的增加的效果越發(fā)明顯。這與徐潔瓊[18]測得的表沒食子酸兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯等茶多酚單體對(duì)β-LG的熒光猝滅情況相比,PC具有更高的猝滅率,這可能與PC具有多羥基的結(jié)構(gòu)且是低聚體有關(guān)[19]。

2.3.2.2 熒光淬滅機(jī)理

由圖5可知,PC與β-LG的Stern-Volmer方程是非直線的,尤其是85 ℃和121 ℃下其非直線性更加明顯,可以說明PC對(duì)β-LG的猝滅作用是靜態(tài)猝滅作用和動(dòng)態(tài)猝滅作用共同發(fā)生導(dǎo)致的[18]。Stern-Volmer曲線斜率KSV代表動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù),且由表3可以看出,PC與β-LG的KSV值隨溫度增加而增加,但其Kq值在1012～1013L/(mol·s)數(shù)量級(jí),遠(yuǎn)大于最大動(dòng)態(tài)猝滅的Kq值[2×1010L/(mol·s)]。總的來說,在線性范圍內(nèi),PC對(duì)β-LG的猝滅作用是靜態(tài)猝滅,即β-LG的熒光猝滅是由于新復(fù)合物形成引起的。

a-常溫;b-85 ℃/30 min;c-121 ℃/15 min圖5 不同熱處理?xiàng)l件下β-乳球蛋白與原花青素在298、308和318 K下的Stern-Volmer曲線Fig.5 Stern-Volmer curves of PC-β-LG at 298, 308, and 318 K under different heat treatments

表3 不同熱處理下原花青素與β-乳球蛋白的猝滅常數(shù)Table 3 Quenching constants of PC-β-LG with different heat treatments

2.3.2.3 結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

從圖6可知,其雙對(duì)數(shù)曲線都呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系,并根據(jù)直線的斜率和截距可分別得到n和KA,結(jié)果如表4所示。常溫下PC與β-LG的結(jié)合常數(shù)KA為2.63×105L/mol,85 ℃熱處理下PC與β-LG的結(jié)合常數(shù)KA為74.28×105L/mol,121 ℃熱處理下PC與β-LG的結(jié)合常數(shù)KA為4 973.22×105L/mol。常溫下PC與β-LG的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n略大于1,說明常溫下β-LG提供一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)與PC結(jié)合。當(dāng)熱處理溫度升高時(shí),PC與β-LG的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n增加,121 ℃熱處理下PC與β-LG的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n接近2,說明121 ℃下β-LG提供2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)與PC結(jié)合。

a-常溫;b-85 ℃/30 min;c-121 ℃/15 min圖6 不同熱處理?xiàng)l件下β-乳球蛋白與原花青素在298、308和318 K下的雙對(duì)數(shù)回歸曲線Fig.6 Double logarithmic regression curves of PC-β-LG at 298, 308, and 318 K under different heat treatments

表4 原花青素與β-乳球蛋白的結(jié)合常數(shù)KA、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n及熱力學(xué)參數(shù)Table 4 Binding constants, numbers of binding sites, and thermodynamic parameters of PC-β-LG

由上述結(jié)果可以看出,隨著溫度的增加,PC與β-LG的結(jié)合強(qiáng)度增加,這是因?yàn)棣?LG的結(jié)構(gòu)易受溫度影響,當(dāng)其經(jīng)20～60 ℃熱處理時(shí),會(huì)從二聚體解聚成為單體,同時(shí)結(jié)構(gòu)會(huì)稍作展開[20]。但當(dāng)其經(jīng)受80 ℃以上熱處理時(shí)會(huì)發(fā)生不可逆的變性,同時(shí)內(nèi)部的疏水側(cè)鏈會(huì)暴露到表面[21],因此其與多酚等小分子物質(zhì)的結(jié)合將變得更加強(qiáng)烈。PC與β-LG在不同熱處理下相互作用的變化與上述研究中CP生物可及性的變化呈現(xiàn)很好的相關(guān)性,這也一定程度上解釋了為何出現(xiàn)WP在常溫和85 ℃熱處理下可以提高CP的生物可及性,而在121 ℃熱處理下卻降低了CP的生物可及性。

2.3.2.4 熱力學(xué)常數(shù)及結(jié)合力類型

從表4可知,PC與β-LG結(jié)合過程的吉布斯自由能變化ΔG<0,這表明PC與β-LG是自發(fā)結(jié)合的。對(duì)于β-LG與PC在常溫下的結(jié)合反應(yīng),其ΔH<0、ΔS>0,表明兩者之間的相互作用主要為靜電相互作用;β-LG與PC經(jīng)85 ℃熱處理后,其ΔH<0、ΔS<0,表明兩者之間主要存在范德華作用和氫鍵作用;而121 ℃熱處理后,其ΔH>0、ΔS>0,表明兩者主要以疏水相互作用發(fā)生結(jié)合[22-23]。

3 結(jié)論

本文研究了可可飲料體系中WP的添加對(duì)不同熱處理?xiàng)l件下CP生物可及性的影響,并通過圓二色譜和熒光光譜技術(shù)研究β-LG和PC的之間的相互作用。結(jié)果表明,常溫和85 ℃熱處理?xiàng)l件下,添加WP對(duì)消化前CP總酚含量無明顯影響,但在體系進(jìn)行121 ℃熱處理后,CP總酚含量明顯下降13.43%。常溫和85 ℃熱處理下,加入WP后CP生物可及性分別提高34.02%和12.37%,但121 ℃熱處理下,WP的加入使CP生物可及性下降7.73%。可可飲料體系中的PC與β-LG在熱處理?xiàng)l件下發(fā)生不同程度的相互作用,常溫和85 ℃熱處理下,PC與β-LG分別以靜電相互作用、范德華和氫鍵相互作用為主,強(qiáng)度相對(duì)較弱;經(jīng)121 ℃熱處理后它們以疏水相互作用為主,結(jié)合作用很強(qiáng)(KA為4.97×108L/mol)。可可飲料體系中CP生物可及性和多酚-蛋白質(zhì)相互作用強(qiáng)度有關(guān),在常溫和85 ℃熱處理下,一定強(qiáng)度的蛋白-多酚相互作用對(duì)CP有保護(hù)效果,可提高CP的生物可及性,但121 ℃熱處理后,蛋白-多酚相互作用強(qiáng)度過大,乳蛋白反而降低CP生物可及性。