齊婷婷,逄建龍,張新軍,王新怡,張一敏,毛衍偉*

1(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 泰安,271018)2(諸城市畜牧業(yè)發(fā)展中心,山東 諸城,262200)3(國(guó)家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系中衛(wèi)實(shí)驗(yàn)站,寧夏 中衛(wèi),755000)

顏色和嫩度是牛肉品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo),是影響消費(fèi)者購(gòu)買欲望的重要因素。動(dòng)物屠宰放血后,由于缺氧、缺血的內(nèi)源環(huán)境變化導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species,ROS)在胴體內(nèi)積累,通過(guò)促進(jìn)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化影響肉色和嫩度。為了維持ROS的動(dòng)態(tài)平衡,細(xì)胞乃至整個(gè)機(jī)體進(jìn)化出了完整的抗氧化系統(tǒng)(酶類抗氧化系統(tǒng)、非酶類抗氧化系統(tǒng)),能夠有效地調(diào)節(jié)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除,維持氧化還原平衡[1]。

過(guò)氧化物還原酶6(peroxiredoxin 6,Prdx6)屬于過(guò)氧化物酶家族,能夠保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷[2]。Prdx6具有3種酶活性:非硒依賴谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性(non-selenium glutathione peroxidase,NSGPx)、磷脂酶A2活性和溶血磷脂酰轉(zhuǎn)移酶活性。研究表明,Prdx6的過(guò)表達(dá)可以保護(hù)小鼠免受氧化應(yīng)激的損傷以及保護(hù)細(xì)胞免受磷脂過(guò)氧化物介導(dǎo)的膜損傷[3];敲除Prdx6基因的小鼠對(duì)體內(nèi)外的氧化應(yīng)激都很敏感[4]。因此,Prdx6在維持氧化還原穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用。動(dòng)物宰后肉的品質(zhì)與機(jī)體內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)密切相關(guān),而Prdx6作為一種關(guān)鍵的抗氧化酶,在宰后肌肉向食用肉轉(zhuǎn)變的過(guò)程中,對(duì)肉品質(zhì)的形成具有重要的影響。

前期研究發(fā)現(xiàn),Prdx6在肉色穩(wěn)定的牛排中表達(dá)量更高[5],且與a*值呈正相關(guān)關(guān)系[6]。此外,GAGAOUA等[7]還發(fā)現(xiàn),在嫩度不同的牛肉之間,Prdx6的表達(dá)量有顯著差異,且Prdx6的表達(dá)與μ-鈣蛋白酶呈顯著的正相關(guān)關(guān)系,而已知μ-鈣蛋白酶可以通過(guò)降解細(xì)胞骨架蛋白促進(jìn)肉的嫩化。但目前的研究對(duì)Prdx6在肉嫩化中的作用并不一致,另有研究發(fā)現(xiàn)背最長(zhǎng)肌與半膜肌中Prdx6的表達(dá)量與嫩度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,當(dāng)Prdx6表達(dá)量過(guò)低時(shí),會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡和蛋白質(zhì)降解的發(fā)生,從而對(duì)嫩度產(chǎn)生積極影響[8]。

諸多研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定出Prdx6可能是影響牛肉品質(zhì)的關(guān)鍵蛋白,但其NSGPx活性在宰后牛肉品質(zhì)形成中的具體作用尚未闡明。因此,本實(shí)驗(yàn)采用巰基琥珀酸(mercaptosuccinic acid,MA)處理牛背最長(zhǎng)肌以抑制Prdx6的NSGPx活性,探究其NSGPx活性在宰后牛肉品質(zhì)形成過(guò)程中的作用;借助蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步探究其調(diào)控牛肉品質(zhì)的關(guān)鍵蛋白及相關(guān)通路,以便完善Prdx6在宰后牛肉品質(zhì)形成中的作用及機(jī)制,為調(diào)控牛肉品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取6頭飼養(yǎng)方式、生長(zhǎng)環(huán)境、胴體重量相似的西門塔爾雜交閹割公牛(山東菏澤曹縣商都恒昌清真肉類有限公司,20月齡,胴體重約為360 kg)作為實(shí)驗(yàn)樣本,且肉牛宰后24 h的極限pH值均在5.4～5.8。

MA,Sigma-Aldrich;生理鹽水,辰欣藥業(yè)股份有限公司;總谷胱甘肽過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑盒(S0058)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑盒(S0056),上海碧云天生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒,江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司。

HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋,常州國(guó)華電器有限公司;TA-XT2i型質(zhì)構(gòu)儀,英國(guó)Stable Micro System公司;SP62型便攜式色差計(jì),愛(ài)色麗儀器有限公司;BioTek Epoch2型酶標(biāo)儀,美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

肉牛經(jīng)商業(yè)流程屠宰后,在放血30 min內(nèi)取左半胴體背最長(zhǎng)肌,將牛的第12～13肋骨間肉樣迅速切分為2.54 cm厚的牛排(用于肉色和剪切力指標(biāo)的測(cè)定)和1 cm×1 cm×0.5 cm大小均勻的肉塊,并將30 g肉樣立即浸入液氮冷凍作為0 h樣本。剩余肉樣隨機(jī)分為2組,按照肉液比1∶1(g∶mL),分別浸泡在10 mmol/L MA(抑制Prdx6的非硒依賴谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性組)和0.9%生理鹽水(對(duì)照組)中,在16 ℃下孵育至6 h后(避免冷收縮),繼續(xù)在4 ℃孵育至12、24、72、168 h。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定肉色及剪切力指標(biāo),并在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)留取肉樣在液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱保存,用于后續(xù)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.2 Prdx6的NSGPx活性的測(cè)定

NSGPx活性的測(cè)定采用碧云天公司的總谷胱甘肽過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑盒(S0058)和硒依賴谷胱甘肽過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑盒(S0056)進(jìn)行測(cè)定。使用預(yù)冷的生理鹽水漂洗組織樣品,防止血液對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。稱取80 mg肉樣置于0.8 mL樣品勻漿液中冷凍研磨3次(4 ℃,45 Hz,每次45 s),后于4 ℃下12 000 ×g離心10 min,取上清液并用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)試劑盒配制工作液(含3.125 mmol/L NADPH和3.75 mmol/L谷胱甘肽)和30 mmol/L的過(guò)氧化物試劑。取50 μL上清液和40 μL工作液混勻,室溫下孵育15 min后加入10 μL的過(guò)氧化物試劑,立即于340 nm處測(cè)定吸光值,此時(shí)為0 min吸光值。將樣品在25 ℃下孵育,每隔1 min測(cè)定一次吸光值,共測(cè)定6 min。NSGPx活性=總谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性-硒依賴谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性。

1.2.3 肉色指標(biāo)測(cè)定

在貯藏的第12、24、72、168 h,打開(kāi)包裝后去除表面殘留液體,并使用便攜式色差計(jì)避開(kāi)表面筋腱及脂肪測(cè)定牛排表面的CIEL*(亮度值)、a*(紅度值)、b*(黃度值),每塊牛排測(cè)定6次,取其平均值。

1.2.4 剪切力的測(cè)定

將宰后0、24、72、168 h的牛排樣品置于真空包裝袋中,于80 ℃水浴條件下加熱至中心溫度達(dá)到70 ℃,樣品冷卻至室溫后放置于0～4 ℃過(guò)夜。用空心取樣器(直徑為1.27 cm)沿肌纖維方向取肉柱(避開(kāi)脂肪和筋腱),使用TA-XT2i型質(zhì)構(gòu)儀的HDP/BSW探頭進(jìn)行測(cè)定。牛排的剪切力值(N)為該牛排各個(gè)肉柱測(cè)定結(jié)果的平均值。

1.2.5 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

1.2.5.1 蛋白質(zhì)提取和肽段酶解

采用SDT裂解法裂解肌肉樣品并提取蛋白質(zhì),使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量。采用Filter aided sample preparation(FASP)法取200 μg蛋白質(zhì)樣品加入30 μL SDT緩沖液[4% SDS,150 mmol/L Tris HCl,100 mmol/L dithiothreitol(DTT),pH 8.0]進(jìn)行裂解,使用尿素緩沖液(8 mol/L尿素,150 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0)重復(fù)超濾去除洗滌劑、DTT和其他低分子質(zhì)量組分后,加入100 μL 100 mmol/L碘乙酰胺溶液,避光孵育30 min。使用100 μL 尿素緩沖液洗滌3次,再用100 μL 25 mmol/L NH4HCO3緩沖液洗滌2次后,蛋白懸液用4 μg胰蛋白酶在40 μL NH4HCO3緩沖液中消化,37 ℃過(guò)夜酶解,收集肽段濾液。采用C18 Cartridges對(duì)樣品肽段濾液脫鹽凍干,并取40 μL甲酸溶液以復(fù)溶凍干的肽段樣品。用紫外光譜密度在280 nm處按照氨基酸(色氨酸和酪氨酸)出現(xiàn)頻率對(duì)蛋白質(zhì)肽含量進(jìn)行定量計(jì)算。

1.2.5.2 TMT標(biāo)記及RP分級(jí)

各個(gè)樣品分別取100 μg肽段,按照Thermo公司TMT標(biāo)記試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記好的肽段等量混合,通過(guò)高pH反向肽分級(jí)試劑盒(High pH Reversed-Phase Peptide Fractionation Kit)進(jìn)行分級(jí)。采用0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三氟乙酸酸化,并將混合的標(biāo)記肽段樣品加載到高pH值的反相分餾旋轉(zhuǎn)柱中,低速離心水洗并進(jìn)行脫鹽處理。采用濃度梯度依次增加高pH洗脫溶液中乙腈濃度,對(duì)柱結(jié)合的肽段洗脫成10個(gè)不同的餾分,離心收集。收集的組分真空干燥后用12 μL 0.1%三氟乙酸復(fù)溶凍干樣品,在280 nm處測(cè)定肽段濃度。

1.2.5.3 LC-MS/MS數(shù)據(jù)采集

每份樣品采用nL流速的HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進(jìn)行分離。色譜柱以95%的緩沖液A(0.1%甲酸水溶液)平衡,樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器到上樣柱(Thermo Scientific Acclaim PepMap100,100 μm×2 cm,nanoViper C18),經(jīng)過(guò)分析柱(Thermo scientific EASY column,長(zhǎng)10 cm,內(nèi)徑75 μm,樹(shù)脂3 μm,C18-A2)以緩沖液B(84%乙腈-0.1%甲酸)進(jìn)行線性梯度分離,流速為300 nL/min。

樣品經(jīng)色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。檢測(cè)方式為正離子,母離子掃描范圍300～1 800m/z,一級(jí)質(zhì)譜分辨率為70 000(200m/z),automatic gain control(AGC)target為1e6,Maximum IT為50 ms,動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為60.0 s。多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集:每次全掃描后采集20個(gè)碎片圖譜(MS2 scan),MS2 Activation Type為HCD,Isolation window為2m/z,二級(jí)質(zhì)譜分辨率17 500 (200m/z),Normalized Collision Energy為30 eV,Underfill為0.1%。

1.2.5.4 蛋白質(zhì)鑒定和定量分析

質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)采用軟件Proteome Discoverer 1.4和MASCOT(Matrix Science, London, UK;version 2.2)進(jìn)行查庫(kù)鑒定及定量分析,序列數(shù)據(jù)庫(kù)為uniprot_Bos_taurus.fasta。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SAS 9.0軟件中的混合模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,使用Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖。在鑒定出的所有蛋白質(zhì)中,以差異倍數(shù)(fold change,FC)絕對(duì)值>1.2,P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異蛋白質(zhì)。使用KAAS(KEGG Automatic Annotation Server)軟件對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)集合進(jìn)行KEGG通路注釋。

2 結(jié)果分析

2.1 MA處理對(duì)宰后牛肉成熟過(guò)程中Prdx6的NSGPx活性的影響

如圖1所示,MA處理組中NSGPx的活性隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)降低,且在成熟時(shí)間內(nèi)顯著低于對(duì)照組(P<0.05),表明MA處理顯著抑制了Prdx6的NSGPx活性。王路鹿[9]研究表明,MA可以使Prdx6的半胱氨酸殘基高度硫醇化從而抑制其NSGPx活性,同時(shí)其磷脂酶A2活性不受影響。對(duì)照組中NSGPx的活性在成熟期間呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢(shì),在宰后24 h達(dá)到最大值,這可能是宰后前24 h,機(jī)體自適應(yīng)的提高其NSGPx活性以對(duì)抗氧化應(yīng)激,維持宰后初期的氧化還原平衡。宰后成熟24 h后,其NSGPx活性不斷降低。O’FLAHERTY等[10]的研究解釋了這一變化,研究表明氧化應(yīng)激可以使Prdx6的半胱氨酸殘基高度硫醇化,從而降低Prdx6的NSGPx活性。

圖1 MA處理對(duì)宰后牛肉成熟過(guò)程中Prdx6的NSGPx活性的影響Fig.1 Effect of MA treatment on Prdx6 NSGPx activity of beef during postmortem aging注:a-c表示同一處理方式,不同成熟時(shí)間的肉色差異達(dá)到顯著水平(P<0.05);x-y表示同一時(shí)間,不同處理方式的肉色差異達(dá)到顯著水平(P<0.05),下同。

2.2 MA處理對(duì)宰后牛肉成熟過(guò)程中肉色的影響

由表1可知,處理方式與成熟時(shí)間對(duì)L*值無(wú)交互作用(P>0.05),但處理方式與成熟時(shí)間的主效應(yīng)分別影響顯著(P<0.05)。在整個(gè)成熟期間,2組牛肉的L*值均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。先前的研究表明,隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng),牛肉中蛋白質(zhì)降解程度增加,弱化了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),導(dǎo)致光折射增加,進(jìn)而表現(xiàn)為較高的L*值[11]。MA組的L*值顯著高于對(duì)照組(P<0.05),這可能是由于MA處理后,氧化應(yīng)激的程度增加導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解增多所致。

表1 MA處理對(duì)宰后牛肉成熟過(guò)程中肉色的影響Table 1 Effect of MA treatment on beef color during postmortem aging

a*值表示肉樣的紅度值,相較于L*值和b*值,a*值通常是反映肉色最重要的指標(biāo),a*值越大表示肉色越鮮紅。由表1可知,處理方式與成熟時(shí)間對(duì)a*值的影響無(wú)交互作用(P>0.05),但處理方式與成熟時(shí)間的主效應(yīng)分別影響顯著(P<0.05)。隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng),2組牛肉的a*值均呈現(xiàn)下降趨勢(shì),這可能是由于成熟過(guò)程中生成了較多的高鐵肌紅蛋白,使肉色劣變。此外,宰后牛肉線粒體活性的降低導(dǎo)致高鐵肌紅蛋白還原能力降低也會(huì)造成肉色劣變。MA組的a*值顯著低于對(duì)照組(P<0.05),在宰后成熟第72 h和第168 h,MA組的a*值分別是對(duì)照組的71.02%和57.39%,說(shuō)明MA處理抑制NSGPx活性后,加快了宰后成熟過(guò)程中a*值的降低。黃琳琳[12]研究發(fā)現(xiàn),抑制NSGPx活性可以加速蛋白質(zhì)氧化、細(xì)胞凋亡等過(guò)程,而蛋白質(zhì)氧化會(huì)對(duì)肉色產(chǎn)生不利影響,且孫志昶等[13]的研究也表明細(xì)胞凋亡率與a*值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,這與本研究的結(jié)果一致。

處理方式與成熟時(shí)間的交互作用對(duì)b*值有顯著影響(P<0.05)。在宰后成熟的72 h內(nèi),2組的b*值均無(wú)顯著變化(P>0.05),72至168 h時(shí)顯著增大(P<0.05),且在168 h時(shí)MA組的b*值顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。這與VERGARA等[14]的b*值隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng)而增加的研究結(jié)果一致,這可能與高鐵肌紅蛋白的形成有關(guān)。

2.3 MA處理對(duì)宰后牛肉成熟過(guò)程中剪切力的影響

剪切力是衡量牛肉嫩度的重要指標(biāo)。如圖2所示,MA處理組的牛肉剪切力值持續(xù)下降,而對(duì)照組的剪切力值呈先升高后下降的趨勢(shì),且在宰后成熟第24 h和72 h,MA處理組的剪切力值均顯著低于對(duì)照組(P<0.05),分別為對(duì)照組的78.88%、76.55%,表明MA處理加快了宰后牛肉成熟過(guò)程中的嫩化速度。

圖2 MA處理對(duì)宰后牛肉成熟過(guò)程中剪切力的影響Fig.2 Effect of MA treatment on shear force of beef during postmortem aging

2.4 MA處理后的蛋白質(zhì)組學(xué)變化

表2列出了MA組和對(duì)照組宰后24 h樣品的主要差異蛋白,通過(guò)分析,這些差異蛋白共富集到39條KEGG通路中,由圖3可以看出,大部分差異蛋白參與了細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、碳水化合物代謝以及能量代謝等通路。這些富集結(jié)果表明抑制Prdx6的NSGPx活性會(huì)影響細(xì)胞凋亡、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和機(jī)體的代謝循環(huán)等過(guò)程。

表2 MA處理組vs對(duì)照組的主要差異蛋白質(zhì)Table 2 Main differential proteins of MA group vs Control

為了進(jìn)一步確定抑制Prdx6的NSGPx活性對(duì)宰后牛肉品質(zhì)的影響,我們對(duì)主要的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了分析。這些差異表達(dá)蛋白按照功能主要分為結(jié)構(gòu)蛋白、代謝酶類、呼吸電子傳遞鏈相關(guān)蛋白、熱休克蛋白、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白等,其具體信息如表2所示。

2.4.1 結(jié)構(gòu)蛋白的變化

在差異表達(dá)蛋白中,結(jié)構(gòu)蛋白所占比例最高。其中肌球蛋白輕鏈6(myosin light chain 6,MYL6)、肌球蛋白-2(myosin-2,MYH2)、肌鈣蛋白-T(troponin T, fast skeletal muscle,TNNT3)、α-輔肌動(dòng)蛋白1(α-actinin-1,ACTN1)以及伴肌動(dòng)蛋白(nebulin,NEB)等結(jié)構(gòu)蛋白與肉的嫩度密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示在MA處理組中這些蛋白表達(dá)量均顯著下調(diào),表明MA處理加劇了肌球蛋白、肌鈣蛋白以及肌動(dòng)蛋白的降解,破壞了肌原纖維的完整性,加速了牛肉嫩化。

肌球蛋白結(jié)合蛋白H(myosin binding protein H,MYBPH)是脊椎動(dòng)物骨骼肌重要的肌原纖維蛋白成分,其功能是調(diào)節(jié)肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白間的相互作用。研究表明MYBPH可以被內(nèi)源性蛋白酶(如μ-鈣蛋白酶)降解,引起肌肉超微結(jié)構(gòu)變化,不僅影響肉的嫩度,還會(huì)通過(guò)光散射的作用影響肉色[9]。本研究中,與對(duì)照組相比,MA處理組的MYBPH表達(dá)量顯著上調(diào),這可能是由于Prdx6的NSGPx活性被抑制后,ROS含量升高,加劇內(nèi)源性蛋白酶(如μ-鈣蛋白酶)氧化失活,從而使MYBPH降解量減少。且該組的剪切力值低于對(duì)照組,這與GUILLEMIN等[8]研究發(fā)現(xiàn)MYBPH在嫩度較好的肌肉類型中表達(dá)量更高的結(jié)果一致。

肌球蛋白輕鏈3(myosin light chain 3,MYL3)是一種結(jié)構(gòu)蛋白,參與肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育等過(guò)程。LPEZ-PEDROUSO 等[15]發(fā)現(xiàn),在嫩度較差的鹿肉中MYL3表達(dá)量更高,且MYL3與剪切力呈顯著正相關(guān)關(guān)系。KONING等[16]研究發(fā)現(xiàn),缺氧條件下會(huì)導(dǎo)致MYL3表達(dá)量上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn),在MA處理組中MYL3表達(dá)量顯著上調(diào),這可能與MA組受到更大的氧化應(yīng)激有關(guān)。

膠原蛋白α-1(I)鏈(Collagen alpha-1(I) chain,COL1A1)和膠原蛋白α-2(I)鏈(Collagen alpha-2(I) chain,COL1A2)均屬于膠原蛋白家族成員。本研究結(jié)果顯示,COL1A1和COL1A2被顯著富集到細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)-受體相互作用通路。ZHAO等[17]研究發(fā)現(xiàn),敲除COL1A1后,抗凋亡相關(guān)因子BCL-2顯著下調(diào),促凋亡相關(guān)因子Bax顯著上調(diào),凋亡程度顯著增加。FU等[18]等抑制牛卵丘細(xì)胞中COL1A1的表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加,凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活,這表明COL1A1可能是重要的抗凋亡因子。本研究MA處理組中COL1A1的高表達(dá)量,可能是由于氧化應(yīng)激環(huán)境促進(jìn)了凋亡的發(fā)生,機(jī)體自適應(yīng)提高COL1A1的表達(dá)量以對(duì)抗凋亡。此外,氧化應(yīng)激條件下缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)過(guò)表達(dá),刺激COL1A2的激活,這也與本研究中MA組COL1A2表達(dá)量上調(diào)的結(jié)果一致。研究結(jié)果表明,抑制Prdx6的NSGPx活性促進(jìn)了膠原蛋白的降解,破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性,使牛肉嫩度提高。

肌原纖維蛋白表達(dá)量的顯著變化表明Prdx6的NSGPx活性對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性以及肌肉收縮能力有較大的影響,可能通過(guò)該途徑進(jìn)一步影響宰后牛肉的嫩度。

2.4.2 代謝酶類的變化

在鑒定出的代謝酶中,2-氧代異戊酸脫氫酶β亞基(2-oxoisovalerate dehydrogenase subunit beta, mitochondrial,BCKDHB)和丙酮酸脫氫酶E1組分α亞基(Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit alpha,PDHA2)等蛋白顯著富集在碳水化合物代謝通路。其中丙酮酸脫氫酶參與糖酵解過(guò)程,催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH),生成的NADH可以參與高鐵肌紅蛋白的還原,有助于維持肉色及其穩(wěn)定性。本研究中發(fā)現(xiàn),MA處理組PDHA2表達(dá)量下調(diào),可能是其肉色較差的原因。JOSEPH等[19]在不同肌肉類型的差異蛋白研究中發(fā)現(xiàn)丙酮酸脫氫酶與a*值呈正相關(guān)關(guān)系,與本研究結(jié)果一致。

?；o酶A氧化酶(Acyl-coenzyme A oxidase,ACOXL)是過(guò)氧化物酶體中脂肪酸β氧化的關(guān)鍵酶,作為脂質(zhì)代謝中的重要調(diào)節(jié)劑,可以引發(fā)長(zhǎng)鏈脂肪酸的氧化代謝,最終被氧化為乙酰輔酶A,生成的乙酰輔酶A參與三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)[20]。在敲除ACOXL基因的小鼠中發(fā)現(xiàn)H2O2水平顯著升高,此外,KONG等[21]研究發(fā)現(xiàn)采用棕櫚酸酯誘導(dǎo)ROS水平升高后,ACOXL表達(dá)量顯著升高。因此ACOXL不僅可以維持脂質(zhì)穩(wěn)態(tài),參與TCA循環(huán),還在調(diào)節(jié)ROS代謝方面發(fā)揮重要作用。本研究MA處理組中,ACOXL表達(dá)量顯著上調(diào),表明抑制了Prdx6的NSGPx活性促進(jìn)了ACOXL的表達(dá),且高表達(dá)的ACOXL很可能通過(guò)促進(jìn)脂質(zhì)代謝以及TCA循環(huán)等過(guò)程參與了肉色及其穩(wěn)定性的形成。

2-磷酸-D-甘油酸水解酶(2-phospho-D-glycerate hydro-lyase,ENO2)是一種參與糖酵解中間步驟的烯醇化酶,催化2-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸。ENO2具有與氧化應(yīng)激和熱休克蛋白相關(guān)的功能,可以和HSP70相互作用以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷[22]。JOVé等[23]研究表明,ENO2是脂肪氧化受損后的關(guān)鍵靶標(biāo)。本研究檢測(cè)到抑制Prdx6的NSGPx活性后,ENO2表達(dá)量下調(diào),推測(cè)可能是MA組受到氧化應(yīng)激,發(fā)生脂肪氧化導(dǎo)致的。而ENO2的下調(diào)會(huì)進(jìn)一步阻礙糖酵解進(jìn)程,減少了中間代謝物的產(chǎn)生和積累,進(jìn)而影響了肉色及其穩(wěn)定性。此外,JOSEPH等[19]研究也表明烯醇化酶因其在糖酵解代謝中的作用,可以使肉色穩(wěn)定性得到改善。

以上代謝酶均是參與糖酵解和代謝循環(huán)的重要酶類,影響NADH的生成并進(jìn)一步影響宰后肉中高鐵肌紅蛋白的還原。在宰后初期表達(dá)量的改變表明Prdx6的NSGPx活性與能量代謝存在潛在關(guān)聯(lián),且可能通過(guò)影響代謝途徑進(jìn)一步影響牛肉的肉色及其穩(wěn)定性。

2.4.3 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的變化

在差異表達(dá)蛋白中,細(xì)胞色素c和組蛋白H2A被顯著富集到細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡通路。

細(xì)胞色素c是線粒體電子傳遞鏈的主要電子載體,可以將細(xì)胞色素還原酶血紅素基團(tuán)上的電子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞色素氧化酶復(fù)合體上,參與線粒體介導(dǎo)的高鐵肌紅蛋白還原。此外,作為重要的凋亡相關(guān)因子,它可以通過(guò)激活Bax等促凋亡因子引發(fā)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng),加速凋亡進(jìn)程。與對(duì)照組相比,MA處理組細(xì)胞色素c水平顯著下調(diào),這可能通過(guò)阻礙線粒體電子傳遞鏈的進(jìn)程,抑制高鐵肌紅蛋白的還原,導(dǎo)致該組肉色及其穩(wěn)定性降低。

組蛋白H2A(histone H2A,H2AFX)是組蛋白核心的重要組成部分,容易受到氧化損傷,與壞死性凋亡密切相關(guān)。研究表明,過(guò)量的ROS會(huì)導(dǎo)致組蛋白H2A泛素化,更易受到由蛋白酶體所介導(dǎo)的降解,最終導(dǎo)致細(xì)胞炎癥和凋亡的發(fā)生[24]。本研究發(fā)現(xiàn)MA處理組H2AFX水平顯著下調(diào),這可能是由于抑制Prdx6的NSGPx活性后,過(guò)量的ROS持續(xù)積累導(dǎo)致的。

凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化進(jìn)一步表明Prdx6的NSGPx活性可能通過(guò)影響凋亡途徑影響牛肉的品質(zhì)。

2.4.4 呼吸電子傳遞鏈相關(guān)蛋白的變化

細(xì)胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase,COX)是線粒體呼吸電子傳遞鏈的末端蛋白質(zhì)復(fù)合物Ⅳ,將電子從細(xì)胞色素c轉(zhuǎn)移到氧分子,再將分子氧還原成水,參與線粒體電子傳遞過(guò)程以及ROS的生成,在能量代謝中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞色素c氧化酶亞基7A1(cytochrome c oxidase subunit 7A1, mitochondrial,COX7A1)是其中的一個(gè)同工酶亞基,可以調(diào)控COX在線粒體內(nèi)膜中的裝配過(guò)程并調(diào)控COX的活性。MISHRA等[25]研究認(rèn)為COX7A1的過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究MA組中COX7A1表達(dá)量顯著上調(diào),表明抑制Prdx6的NSGPx活性可以通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體呼吸電子傳遞鏈途徑影響牛肉品質(zhì)。

2.4.5 熱休克蛋白的變化

熱休克蛋白β-8(heat shock protein bate-8,HSPB8)是一種在缺血缺氧條件下表達(dá)量上調(diào)的應(yīng)激蛋白,防止細(xì)胞受到氧化或凋亡損傷。HSPB8過(guò)表達(dá)后會(huì)增加線粒體產(chǎn)生NO的能力,而NO可以減少宰后線粒體的O2消耗和ROS的產(chǎn)生從而為應(yīng)激的細(xì)胞提供保護(hù),因此通常將HSPB8作為缺血缺氧后保護(hù)線粒體功能的潛在指標(biāo)。本研究抑制Prdx6的NSGPx活性后HSPB8表達(dá)量的上調(diào),可能反應(yīng)了宰后初期肌細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的自我防御能力。

3 結(jié)論

Prdx6作為動(dòng)物體內(nèi)關(guān)鍵的抗氧化防御酶,面對(duì)宰后初期缺氧缺血的應(yīng)激環(huán)境時(shí),機(jī)體在短時(shí)間內(nèi)自適應(yīng)提高其NSGPx活性來(lái)抵御氧化應(yīng)激。本研究中,MA處理顯著抑制了Prdx6的NSGPx活性,且抑制其NSGPx活性后肉色及其穩(wěn)定性顯著降低,嫩度顯著提高,表明Prdx6的NSGPx活性會(huì)延緩宰后牛肉肉色的劣變,但對(duì)牛肉的嫩化產(chǎn)生不利影響。采用差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),差異表達(dá)蛋白主要為結(jié)構(gòu)蛋白、代謝酶類、呼吸電子傳遞鏈相關(guān)蛋白、熱休克蛋白、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白等。其中在MA組中肌球蛋白輕鏈6、肌球蛋白-2、肌鈣蛋白-T、α-輔肌動(dòng)蛋白1以及伴肌動(dòng)蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)量顯著下調(diào),表明抑制Prdx6的NSGPx活性可能加劇肌球蛋白、肌鈣蛋白以及肌動(dòng)蛋白的降解,加速牛肉嫩化;2-氧代異戊酸脫氫酶亞基β、?；o酶A氧化酶和2-磷酸-D-甘油酸水解酶等代謝酶表達(dá)量的變化表明:抑制Prdx6的NSGPx活性影響了糖酵解和TCA循環(huán)等代謝過(guò)程,并進(jìn)一步影響牛肉的肉色及其穩(wěn)定性。此外,組蛋白H2A(H2AFX)和細(xì)胞色素c氧化酶亞基7A1(COX7A1)等蛋白質(zhì)表達(dá)量的差異表明抑制Prdx6的NSGPx活性還影響了細(xì)胞凋亡和呼吸電子傳遞鏈等過(guò)程,并可能是影響牛肉品質(zhì)的潛在因子。綜上所述,Prdx6的NSGPx活性影響了宰后牛肉的品質(zhì),其具體作用機(jī)制值得進(jìn)一步探究。