孫震,程倩倩,季勤怡,朱鉬藍(lán),夏雨

(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)

D-阿洛酮糖作為一種稀有酮糖,是果糖的C-3差向異構(gòu)體,其甜度相當(dāng)于蔗糖的70%,能量?jī)H為蔗糖的0.3%,具有低卡、綠色、甜度高,口感和容積特性與蔗糖類(lèi)似的特點(diǎn),被認(rèn)為是蔗糖的理想替代甜味劑[1-2]。D-阿洛酮糖具有改善胰島素抵抗[3]、抗肥胖[4]和調(diào)節(jié)血脂代謝[5]等多種生理功能。除此之外,它還能改善產(chǎn)品品質(zhì),如提高明膠軟糖彈性和含水量,保持烘焙類(lèi)產(chǎn)品的濕度和硬度[6-7]等。因此,D-阿洛酮糖作為蔗糖的替代品和食品添加劑具有重要的開(kāi)發(fā)價(jià)值。由于D-阿洛酮糖的極其稀缺性和良好的生理功能,如何以較低的成本和簡(jiǎn)便的工藝生產(chǎn)出大量的D-阿洛酮糖是近年的研究熱點(diǎn)。與復(fù)雜繁瑣且產(chǎn)率低的化學(xué)合成法相比,綠色高效的生物合成法成為新的研究熱點(diǎn)。生物法合成D-阿洛酮糖目前最重要的途徑是利用D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(D-allulose 3-epimerase, DAEase)催化D-果糖在C-3進(jìn)行可逆的差向異構(gòu)化反應(yīng)獲得。近年來(lái)已有20余種不同微生物來(lái)源的DAEase在真核及原核表達(dá)系統(tǒng)中成功進(jìn)行異源表達(dá)的報(bào)道[8],轉(zhuǎn)化率普遍在20%～35%,具有較好的應(yīng)用前景。

對(duì)于純度要求較高的食品和藥品,后期的分離提純效率對(duì)其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。D-阿洛酮糖的工業(yè)化生產(chǎn)制備面臨著酶催化后D-阿洛酮糖與殘留底物分離的問(wèn)題,這使D-阿洛酮糖的生產(chǎn)成本大大增加。模擬移動(dòng)床技術(shù)(simulated moving bed,SMB)是一種可規(guī)模化生產(chǎn)的連續(xù)色譜分離技術(shù),可以將生物合成法得到的D-阿洛酮糖從混合糖液中分離出來(lái)[9],但是設(shè)備昂貴,操作繁瑣,目前尚未普及使用。色譜分離法是一種基于離子交換原理的成熟工藝,成本低廉,操作方便且分離效果較好,也被應(yīng)用于D-阿洛酮糖的料液分離。D-阿洛酮糖由于其較高的溶解度,且易吸潮,受熱易呈玻璃態(tài)[10],因此結(jié)晶難度大,難以用加熱干燥法制得最終的產(chǎn)品,嚴(yán)重限制了D-阿洛酮糖工業(yè)化生產(chǎn)?，F(xiàn)有的報(bào)道中多為乙醇結(jié)晶法[11],但是該工藝需要使用大量有機(jī)溶劑,存在潛在的安全隱患,且存在產(chǎn)品收率低,容易引入外來(lái)雜質(zhì),結(jié)晶困難,工藝不穩(wěn)定和成本過(guò)高等問(wèn)題,因此乙醇結(jié)晶法并不適合于工業(yè)化生產(chǎn)。而冷卻結(jié)晶法具備操作簡(jiǎn)單,設(shè)備要求低等優(yōu)點(diǎn),但已報(bào)道的冷卻工藝中仍存有結(jié)晶周期長(zhǎng)、晶粒不穩(wěn)定及回收率低等不足,需要進(jìn)一步優(yōu)化,以建立回收率高、能耗低的結(jié)晶方法。

與生物法轉(zhuǎn)化合成D-阿洛酮糖的上游產(chǎn)業(yè)研究相比,目前針對(duì)D-阿洛酮糖的分離純化、結(jié)晶等下游研究較少,為進(jìn)一步提高D-阿洛酮糖的生產(chǎn)效率,降低工業(yè)化生產(chǎn)D-阿洛酮糖的成本,簡(jiǎn)化下游的分離提純、結(jié)晶、干燥等工藝步驟的研究必不可少。因此,本研究通過(guò)在大腸桿菌中異源表達(dá)不同微生物來(lái)源的酮糖3-差相異構(gòu)酶,利用重組工程大腸桿菌獲得D-阿洛酮糖料液,并嘗試優(yōu)化D-阿洛酮糖的冷卻結(jié)晶工藝,完成D-阿洛酮糖從生物合成到分離純化,再到冷卻結(jié)晶的小試階段,為工業(yè)化生產(chǎn)稀有酮糖提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本實(shí)驗(yàn)中分別合成3種不同的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的目的基因片段,微生物來(lái)源分別為根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)、多爾氏菌(Doreasp. CAG317)、梭狀芽孢桿菌(ClostridiumscindensATCC 35704),分別命名為DAE01、DAE02、DAE03。重組大腸桿菌BL21(DE3,pET28a-DAE01)、BL21(DE3,pET28a-DAE02)、BL21(DE3,pET28a-DAE03)為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。引物合成、質(zhì)粒構(gòu)建及核酸測(cè)序由南京金斯瑞股份有限公司完成。宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)、質(zhì)粒pET28a(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基及主要試劑

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10、NaCl 10、酵母提取物5,121 ℃滅菌20 min,用于重組菌株的培養(yǎng)。T4 DNA連接酶、卡納霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG),生工生物工程(上海)股份有限公司;陽(yáng)離子交換樹(shù)脂001×7、陰離子交換樹(shù)脂313、DTF-Ca2+色譜分離樹(shù)脂,江蘇蘇青集團(tuán);質(zhì)粒小量提取試劑盒,上海捷瑞有限公司。D-阿洛酮糖標(biāo)品(色譜純),阿拉丁;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Waters 1525EF高效液相色譜儀、Sugar-PakTM1糖柱,美國(guó)Waters公司;HL-2B型數(shù)顯恒流泵、DBS-100自動(dòng)部分收集器,上海滬西分析儀器廠;ZQZY-70B振蕩培養(yǎng)箱,上海知楚儀器有限公司;Synergy H1多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)伯騰儀器有限公司;夾套結(jié)晶器,天津易普佳科技有限公司;YRE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;DZF-6096真空干燥箱,上海一恒儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組菌株的構(gòu)建

在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)上篩選得到3種不同微生物來(lái)源的編碼DAEase的基因序列,其中DAE01全長(zhǎng)870 bp,DAE02全長(zhǎng)870 bp,DAE03全長(zhǎng)867 bp,通過(guò)密碼子優(yōu)化后,將優(yōu)化后的3條基因序列交由南京金斯瑞公司合成。在C端整合6×His tag,同時(shí)在基因序列的5′端與3′端分別引入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn),通過(guò)限制性位點(diǎn)將修飾的序列整合到pET-28a(+)載體中,構(gòu)成重組質(zhì)粒pET28a-DAE01、pET28a-DAE02、pET28a-DAE03。將上述3個(gè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coilDH5α感受態(tài)細(xì)胞中,挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,接入帶有卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng),抽提質(zhì)粒。將獲得的3個(gè)pET28a-DAEase重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coilBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,過(guò)夜培養(yǎng),挑取單菌落驗(yàn)證。驗(yàn)證成功后,將菌液送上海生工公司測(cè)序,保存測(cè)序結(jié)果正確的重組菌。得到3株重組菌株E.coilBL21(DE3,pET28a-DAE01)、E.coilBL21(DE3,pET28a-DAE02)、E.coilBL21(DE3,pET28a-DAE03),圖1為質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。

圖1 重組DAEase質(zhì)粒構(gòu)建Fig.1 The construction of DAEase recombinant plasmid

1.2.2 誘導(dǎo)表達(dá)及驗(yàn)證

挑取驗(yàn)證成功的重組菌,接種到卡那霉素終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的LB培養(yǎng)液中,37 ℃,200 r/min,培養(yǎng)8～10 h,以1.0%(體積分?jǐn)?shù))接種量轉(zhuǎn)接至卡那霉素終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的1 L LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)條件為:IPTG終濃度為0.2～0.5 mmol/L,20 ℃,14～16 h。冰浴10 min停止誘導(dǎo),管式離心機(jī)收集濕菌體后,使用Tris-HCl破胞緩沖液洗滌菌體,使菌液質(zhì)量濃度控制在100 mg/mL,進(jìn)行超聲波破胞,破胞條件為:功率300 W,工作1 s,停2 s,15 min。12 000 r/min離心15 min,取上清液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)進(jìn)行蛋白驗(yàn)證。

1.2.3 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件優(yōu)化

將一定濃度的濕菌體與不同的緩沖體系(醋酸鹽緩沖液pH 5.0～6.0,磷酸鹽緩沖液pH 7.0～8.0,Tris-HCl緩沖液pH 9.0～10.0),充分混合得到的反應(yīng)混合物在15～65 ℃下反應(yīng),以確定3種不同重組菌全細(xì)胞反應(yīng)的最佳pH和溫度。接下來(lái),再分別將終濃度為5 mmol/L的MnSO4、CoCl2、ZnCl2、NiCl2、MgCl2或EDTA加入反應(yīng)混合物,反應(yīng)10 min,然后高溫煮沸5 min停止反應(yīng)。單位D-阿洛酮糖全細(xì)胞催化活力定義在全細(xì)胞反應(yīng)條件下單位時(shí)間(1 min)內(nèi)生成1 μmolD-阿洛酮糖所需要的全細(xì)胞的量,活力最高的值被確定為相對(duì)最高活力(100%)。在上述研究基礎(chǔ)上,分別將3株重組菌(濕菌體質(zhì)量濃度為20～120 mg/mL)在不同質(zhì)量濃度的D-果糖(50～750 g/L)下合成D-阿洛酮糖,在最佳的反應(yīng)體系下反應(yīng)5 h,以考察濕菌體濃度和底物濃度對(duì)全細(xì)胞反應(yīng)的影響。

1.2.4D-阿洛酮糖的色譜分離

全細(xì)胞轉(zhuǎn)化得到的反應(yīng)液使用陰、陽(yáng)離子大孔樹(shù)脂吸附分離其中的鹽離子,脫鹽脫色處理后得到的混合溶液使用DTF-Ca2+分離樹(shù)脂進(jìn)行分離純化。參考邢慶超等[12]的方法,具體參數(shù)為:DTF-Ca2+分離樹(shù)脂處理再生后裝填入型號(hào)為26 cm×100 cm帶夾套的層析柱中,填料體積為400 mL。待柱平衡后,將脫鹽處理后的D-果糖和D-阿洛酮糖混合溶液緩慢滴入到樹(shù)脂表面,一次進(jìn)樣量為10 mL。洗脫條件為:去離子水為流動(dòng)相,柱溫60 ℃,流速1 mL/min,用自動(dòng)收集器收集洗脫樣品,通過(guò)HPLC檢測(cè),與D-阿洛酮糖和D-果糖標(biāo)準(zhǔn)樣品比較,定性定量各管樣品中的D-果糖和D-阿洛酮糖的濃度。

1.2.5D-阿洛酮糖冷卻結(jié)晶工藝優(yōu)化

采取冷卻結(jié)晶法對(duì)D-阿洛酮糖的料液進(jìn)行結(jié)晶,利用HPLC檢測(cè)結(jié)晶率和純度來(lái)確定最優(yōu)的結(jié)晶條件?；痉椒?分離純化后得到的阿洛酮糖料液經(jīng)60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后,濃縮至一定的料液質(zhì)量濃度(1.1、1.2、1.3、1.4、1.5 g/mL),接著往體系中加入過(guò)篩的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%D-阿洛酮糖晶種,然后按照一定降溫速率(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ℃/h)降溫至終點(diǎn)溫度(5、10、15、20、25 ℃),終點(diǎn)溫度停留時(shí)間不超過(guò)2 h,攪拌速率分別為20、40、80、120,150 r/min,結(jié)晶析出晶體后,8 000 r/min離心過(guò)濾,4 ℃無(wú)水乙醇洗滌濾餅2～3次,50 ℃真空干燥至恒重。對(duì)料液濃度、終點(diǎn)溫度、降溫速率、攪拌速率等因素進(jìn)行工藝優(yōu)化。

1.2.6 HPLC定量分析

HPLC檢測(cè)條件[13]:Waters 600高效液相色譜儀、Sugar-pakTM1柱,Waters 2410示差遮光檢測(cè)器。流動(dòng)相為超純水,柱溫85 ℃,流速0.4 mL/min,進(jìn)樣量10 μL。D-阿洛酮糖標(biāo)樣質(zhì)量濃度為5 mg/mL。所有樣品均需用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾。D-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化率計(jì)算如公式(1)、公式(2)所示:

(1)

(2)

式中:R1,D-阿洛酮糖生物轉(zhuǎn)化率,%;R2,D-阿洛酮糖結(jié)晶率,%;CA,D-阿洛酮糖溶液質(zhì)量濃度,g/mL;CF,D-果糖溶液質(zhì)量濃度,g/mL;mA,D-阿洛酮糖結(jié)晶后的干重,g;VA,D-阿洛酮糖料液體積,mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 DAEase 的SDS-PAGE結(jié)果分析

由圖2的SDS-PAGE結(jié)果可知,誘導(dǎo)后的3株重組大腸桿菌破胞上清液均在25～35 kDa處有清晰可見(jiàn)的條帶,與目的蛋白的分子質(zhì)量大小一致,說(shuō)明3種酮糖3-差向異構(gòu)酶在E.coliBL21(DE3)中均能實(shí)現(xiàn)正確表達(dá),且為可溶性表達(dá),目的蛋白的表達(dá)量也較高,得到的粗酶液可以進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

圖2 重組大腸桿菌破胞上清液SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE analysis of the recombinant E.coli BL21(DE3) cell-free extractsM-蛋白Marker;1-誘導(dǎo)后的E. coli BL21(DE3,pET28a-DAE01)破胞上清液;2-誘導(dǎo)后的E. coli BL21(DE3,pET28a-DAE02)破胞上清液;3-誘導(dǎo)后的E. coli BL21(DE3,pET28a-DAE03)破胞上清液(3種目的蛋白分子質(zhì)量均約為32 kDa)

2.2 重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化能力分析及優(yōu)化

全細(xì)胞反應(yīng)可以一定程度上減少反應(yīng)的環(huán)境對(duì)游離酶的影響,在復(fù)雜的體系內(nèi),全細(xì)胞比游離酶更穩(wěn)定,同時(shí)全細(xì)胞反應(yīng)避免復(fù)雜的蛋白酶純化步驟[14]。構(gòu)建成功的3株重組大腸桿菌按照1.2.3節(jié)中所述方法進(jìn)行D-阿洛酮糖的全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化。為研究溫度對(duì)重組酮糖差相異構(gòu)酶催化活性的影響,分別在不同溫度(15～65 ℃)條件下進(jìn)行全細(xì)胞反應(yīng),結(jié)果如圖3-a所示。在一定范圍內(nèi)隨著反應(yīng)溫度的升高,3種不同重組全細(xì)胞的催化活性都逐步升高,這是因?yàn)楫?dāng)反應(yīng)溫度升高,可逆反應(yīng)的平衡向生成D-阿洛酮糖的方向移動(dòng),目的產(chǎn)物的產(chǎn)量越高,因此在較高的溫度下反應(yīng)有利于提高D-阿洛酮糖的生物轉(zhuǎn)化率。DAE01和DAE03在45～55 ℃時(shí)相對(duì)催化活性較高,都能保持在80%以上。當(dāng)溫度高于55 ℃時(shí),DAE01和DAE03重組菌的活力急劇下降,相對(duì)催化活性低于60%,原因是溫度過(guò)高,導(dǎo)致酮糖差相異構(gòu)酶的酶活性降低,從而使得重組大腸桿菌催化活性快速降低。在全細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化過(guò)程中,反應(yīng)溫度會(huì)通過(guò)影響酮糖差相異構(gòu)酶的催化活力,進(jìn)而顯著影響靜息細(xì)胞的催化活性。因此DAE01和DAE03重組菌的最適反應(yīng)溫度為45～55 ℃,而DAE02的最適溫度為65 ℃,是3種不同重組菌中耐熱性最好的。

a-反應(yīng)溫度;b-pH;c-底物質(zhì)量濃度;d-濕菌體質(zhì)量濃度圖3 不同因素對(duì)全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化能力的影響Fig.3 Effect of different factors on whole-cell bioconversion capacity

為研究pH對(duì)3株重組菌全細(xì)胞催化活性的影響,按照1.2.3節(jié)中所述,在不同pH條件的緩沖體系下分別進(jìn)行了全細(xì)胞反應(yīng)并測(cè)定了相對(duì)催化活力。由圖3-b可知,反應(yīng)環(huán)境的pH值會(huì)影響酶蛋白的構(gòu)象,同時(shí)影響活性中心殘基和底物分子的解離狀況,進(jìn)而影響全細(xì)胞的催化活性。DAE01的最適pH和大多數(shù)其他的酮糖差相異構(gòu)酶一樣是在偏堿環(huán)境下(pH 8.0)且當(dāng)pH低于6.0或高于9.0時(shí),幾乎失去了催化活性。DAE03在中性環(huán)境下呈現(xiàn)出其相對(duì)最高催化活力,而當(dāng)處于偏酸或偏堿的體系下,其催化活力顯著降低,這與DAE01存在明顯差異,而DAE02則展現(xiàn)了較寬的pH適應(yīng)性,其在弱酸條件下(pH 6.0)呈現(xiàn)最高的催化活性,并且在pH 7.0～8.0的反應(yīng)環(huán)境中相對(duì)催化活力均高于60%。

金屬離子也會(huì)對(duì)全細(xì)胞催化反應(yīng)產(chǎn)生一定的作用,金屬二價(jià)離子對(duì)重組菌相對(duì)催化活性的影響結(jié)果見(jiàn)表1。DAE01和DAE03為非離子依賴(lài)型酶,添加部分金屬離子可以提高其催化活性,如Co2+、Mn2+、Mg2+均有促進(jìn)作用,而其他的金屬離子則會(huì)強(qiáng)烈抑制全細(xì)胞的催化活性;DAE02為Co2+依賴(lài)型酶[15],只有添加了Co2+才可以充分發(fā)揮其催化活性,當(dāng)體系中未添加Co2+或是添加了其他金屬輔因子均會(huì)降低其催化活性。此外EDTA作為一種金屬螯合劑,添加到反應(yīng)體系中,使得3種不同的重組細(xì)胞的催化活性受到顯著抑制,3種重組菌的相對(duì)催化活性均低于10%。因EDTA在反應(yīng)體系中螯合了金屬離子,導(dǎo)致DAE02完全失去了催化活性?？紤]到添加過(guò)多的金屬離子,在生產(chǎn)中不僅會(huì)提高生產(chǎn)成本,也會(huì)為下游生產(chǎn)的分離純化造成困難,因此DAE03在這一方面表現(xiàn)出較好的生產(chǎn)潛力。

表1 金屬離子對(duì)重組菌催化活性的影響Table 1 Effect of metal ions on recombinant enzymes activity

在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,將3種重組全細(xì)胞在各自最佳的反應(yīng)溫度和pH下,添加合適的金屬輔離子,進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。研究不同底物濃度和濕菌體對(duì)于D-阿洛酮糖生物轉(zhuǎn)化率的影響。反應(yīng)5 h后取樣,離心并稀釋后過(guò)濾膜除菌,用HPLC檢測(cè)D-阿洛酮糖生成量并計(jì)算轉(zhuǎn)化率。結(jié)果如圖3-c和圖3-d所示。表達(dá)3種不同來(lái)源的DAEase的全細(xì)胞反應(yīng)轉(zhuǎn)化率都隨著底物濃度和濕菌體濃度的增加而升高,在到達(dá)反應(yīng)平衡后,不再持續(xù)增長(zhǎng)。由結(jié)果也可知,3種全細(xì)胞的D-阿洛酮糖生物轉(zhuǎn)化率基本在20%～32%,其中表達(dá)DAE01的全細(xì)胞在pH 8.0,45 ℃條件下進(jìn)行催化反應(yīng),在D-果糖達(dá)到600 g/L時(shí),反應(yīng)達(dá)到平衡后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率達(dá)到29.34%,反應(yīng)液中D-阿洛酮糖溶液質(zhì)量濃度約為176 g/L。表達(dá)DAE03的重組全細(xì)胞在pH 7.0,反應(yīng)溫度為45 ℃,D-果糖質(zhì)量濃度為750 g/L,添加濕菌體質(zhì)量濃度為100 mg/mL時(shí),達(dá)到最高的轉(zhuǎn)化效果,轉(zhuǎn)化率為32.19%。而表達(dá)DAE02的全細(xì)胞在pH 6.0,反應(yīng)溫度為65 ℃,濕菌體質(zhì)量濃度為120 mg/mL的條件下反應(yīng)5 h后,最高轉(zhuǎn)化率達(dá)到32.60%,HPLC結(jié)果見(jiàn)圖4。綜合以上分析和未來(lái)工業(yè)化生產(chǎn)潛力等多重因素的考慮,DAE02在耐熱性、嗜弱酸性以及催化活性等方面都展現(xiàn)出更好的生產(chǎn)價(jià)值,因此后續(xù)將以表達(dá)DAE02的重組全細(xì)胞為主要研究對(duì)象繼續(xù)下游的D-阿洛酮糖生產(chǎn)工藝研究。

圖4 全細(xì)胞反應(yīng)產(chǎn)物HPLC結(jié)果圖Fig.4 The HPLC analysis of whole-cell bioconversion

2.3 D-阿洛酮糖的色譜分離結(jié)果

色譜分離技術(shù)是利用不同物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中分配系數(shù)差異來(lái)分離混合物?；谏鲜鼋Y(jié)果,選擇全細(xì)胞轉(zhuǎn)化率最高的E.coliBL21(DE3,pET28a-DAE02)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),將所述的重組菌在最佳條件下反應(yīng),得到的反應(yīng)液按照1.2.4節(jié)所述方法,進(jìn)行脫鹽脫色及色譜分離后,由自動(dòng)收集器收集后的樣品通過(guò)HPLC檢測(cè),分別與標(biāo)品進(jìn)行比較,圖5為定量檢測(cè)每管洗脫樣品中的D-阿洛酮糖和D-果糖的濃度的結(jié)果。由圖5可知,實(shí)驗(yàn)成功除去了反應(yīng)體系中的鹽離子,并且實(shí)現(xiàn)了分離D-果糖和D-阿洛酮糖這兩種性質(zhì)接近的組分的目的,且分離效果較好,可以得到純度為98.10%的D-阿洛酮糖。

a-每管中D-果糖和D-阿洛酮糖兩種不同組分的濃度;b-分離后的樣品HPLC結(jié)果圖圖5 色譜分離結(jié)果Fig.5 Chromatographic separation results

2.4 D-阿洛酮糖冷卻結(jié)晶工藝的優(yōu)化結(jié)果分析

根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道,目前D-阿洛酮糖結(jié)晶產(chǎn)率最高的工藝是采用乙醇體系進(jìn)行結(jié)晶,通過(guò)優(yōu)化乙醇用量等提升結(jié)晶率,但該法需添加大量有機(jī)試劑且未對(duì)結(jié)晶過(guò)程進(jìn)行分析。而目前采用純水體系對(duì)D-阿洛酮糖進(jìn)行重結(jié)晶的方法包括減壓蒸發(fā)及線性降溫結(jié)晶法[16]。這些方法的突出缺點(diǎn)在于能耗大,結(jié)晶周期長(zhǎng),收率一般不高于50%。因此本研究在現(xiàn)有冷卻結(jié)晶工藝的基礎(chǔ)上,采用純水體系進(jìn)行D-阿洛酮糖的結(jié)晶,對(duì)關(guān)鍵因素進(jìn)一步優(yōu)化,提高結(jié)晶效率。

分別設(shè)置質(zhì)量濃度為1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5 g/mL的D-阿洛酮糖料液以研究料液對(duì)結(jié)晶率的影響,結(jié)果見(jiàn)圖6-a。隨著D-阿洛酮糖溶液的料液濃度的升高,結(jié)晶率也在不斷升高。當(dāng)料液質(zhì)量濃度低于1.2 g/mL時(shí),D-阿洛酮糖基本無(wú)法結(jié)晶析出,這與郭元亨等[11]的研究結(jié)果一致。說(shuō)明在D-阿洛酮糖冷卻結(jié)晶過(guò)程中,析出晶體的總重量受料液濃度影響,料液濃度越大,析出的D-阿洛酮糖晶體質(zhì)量越大。因?yàn)樵谝欢囟认?料液濃度越高,溶液的過(guò)飽和度越高,導(dǎo)致可析出的D-阿洛酮糖越多。但考慮到實(shí)際生產(chǎn)中,若要進(jìn)一步升高D-阿洛酮糖溶液的料液濃度,能耗會(huì)急驟升高,旋蒸濃縮耗費(fèi)時(shí)間也會(huì)顯著增加。另外,當(dāng)濃度過(guò)高時(shí),轉(zhuǎn)移濃縮的料液更為困難,物料損耗會(huì)很大,不利于工業(yè)生產(chǎn),因此最佳的料液質(zhì)量濃度應(yīng)在1.4～1.5 g/mL。

a-不同料液質(zhì)量濃度下結(jié)晶回收率;b-不同終點(diǎn)溫度下結(jié)晶回收率;c-不同降溫速率下結(jié)晶回收率;d-不同攪拌速率下晶體純度圖6 不同因素對(duì)D-阿洛酮糖冷卻結(jié)晶的影響Fig.6 Effect of different factors on the cooling crystallization of D-allulose

結(jié)晶的終點(diǎn)溫度同樣對(duì)D-阿洛酮糖的結(jié)晶過(guò)程影響顯著,計(jì)算D-阿洛酮糖在不同終點(diǎn)溫度的結(jié)晶率結(jié)果見(jiàn)圖6-b,在5～20 ℃區(qū)間內(nèi),隨著終點(diǎn)溫度的升高,結(jié)晶率也在顯著增加,而終點(diǎn)溫度低于25 ℃后,結(jié)晶率迅速降低,最適宜的結(jié)晶終點(diǎn)溫度應(yīng)該選擇為20～25 ℃區(qū)間內(nèi)。分析原因可能是體系中加入D-阿洛酮糖的晶種后,隨著晶體的長(zhǎng)大,料液濃度逐漸下降;此時(shí)溫度下降又會(huì)導(dǎo)致料液的過(guò)飽和度增加量,大于晶體生長(zhǎng)引起的過(guò)飽和度降低量,導(dǎo)致溶液絕對(duì)過(guò)飽和度不斷變大,使體系處于不穩(wěn)定區(qū),從而引發(fā)二次成核。當(dāng)然終點(diǎn)溫度的升高可降低料液的黏度,提升溶質(zhì)分子的擴(kuò)散速率,從而提高晶體的生長(zhǎng)速率,進(jìn)而顯著降低介穩(wěn)區(qū)寬度,促進(jìn)成核發(fā)生[17]。而終點(diǎn)溫度過(guò)高時(shí),料液的溶解度進(jìn)一步增大,反而抑制了晶核的生長(zhǎng),不利于晶體的析出。

圖6-c為降溫速率對(duì)結(jié)晶的影響,料液冷卻的降溫速率越大,最終的結(jié)晶產(chǎn)率越低。這是因?yàn)槔鋮s速率越大,料液的最終過(guò)飽和度也越大,整個(gè)結(jié)晶周期耗時(shí)越短,而晶體生長(zhǎng)速度是保持一定的,所以冷卻速率越快,D-阿洛酮糖的有效結(jié)晶時(shí)間越短,結(jié)晶出來(lái)的物質(zhì)越少。而另一方面降溫速率過(guò)低,結(jié)晶周期過(guò)長(zhǎng),會(huì)增加結(jié)晶過(guò)程的能耗成本。因此綜合結(jié)晶率和結(jié)晶周期的時(shí)間成本兩方面因素,最佳的降溫速率2～2.5 ℃/h。

攪拌轉(zhuǎn)速也是結(jié)晶過(guò)程中的重要因素之一,利用HPLC測(cè)定不同攪拌轉(zhuǎn)速下D-阿洛酮糖結(jié)晶晶體純度,檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6-d,結(jié)晶過(guò)程中攪拌速率越高,最終的晶體純度會(huì)越低,當(dāng)轉(zhuǎn)速為20 r/min時(shí),產(chǎn)品的純度最高,達(dá)到98.70%。攪拌速率越高,導(dǎo)致結(jié)晶的推動(dòng)力過(guò)大,易在體系中形成大量微晶,難以附著在晶核上,在溶液中直接以微晶形式存在,致使在離心過(guò)程中晶體微小無(wú)法從黏液中分離,也容易吸附雜質(zhì)離子,導(dǎo)致產(chǎn)品的純度降低。

使用優(yōu)化后的冷卻結(jié)晶工藝進(jìn)行D-阿洛酮糖的結(jié)晶,其結(jié)晶率達(dá)到77.43%,得到D-阿洛酮糖結(jié)晶產(chǎn)品。由生物法轉(zhuǎn)化得到的D-阿洛酮糖和D-果糖混合料液經(jīng)脫鹽脫色、色譜分離純化及濃縮后,再通過(guò)優(yōu)化的冷卻結(jié)晶工藝得到的D-阿洛酮糖結(jié)晶產(chǎn)品沒(méi)有發(fā)生黏結(jié)現(xiàn)象、晶體粒度較為均一,且在全過(guò)程中均未發(fā)生美拉德反應(yīng),未產(chǎn)生結(jié)晶產(chǎn)品的褐變,產(chǎn)品品質(zhì)較佳。

3 結(jié)論與展望

本研究成功構(gòu)建了pET28a-DAE01、pET28a-DAE02、pET28a-DAE03重組質(zhì)粒,并在E.coliBL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá),進(jìn)一步對(duì)不同全細(xì)胞反應(yīng)條件進(jìn)行探究,對(duì)比發(fā)現(xiàn)來(lái)源于Doreasp.CAG317的DAE02的相對(duì)催化活性更高,最高轉(zhuǎn)化率達(dá)到32.60%。與此同時(shí)對(duì)D-阿洛酮糖的下游生產(chǎn)工藝進(jìn)行探索開(kāi)發(fā),總結(jié)出D-阿洛酮糖最佳結(jié)晶工藝條件為:D-阿洛酮糖料液質(zhì)量濃度為1.4～1.5 g/mL,結(jié)晶終點(diǎn)溫度區(qū)間為20～25 ℃,降溫速率和攪拌速率分別為2～2.5 ℃/h和20 r/min。在此最佳條件下進(jìn)行冷卻結(jié)晶,結(jié)晶率最高為77.43%。此工藝簡(jiǎn)單易行,且不需要添加有機(jī)溶劑,可行性高。在之后的研究中仍需對(duì)D-阿洛酮糖的結(jié)晶動(dòng)力學(xué)進(jìn)行深入研究,獲得更為確切的晶體參數(shù)和結(jié)晶動(dòng)力學(xué)方程,探究更穩(wěn)定的工業(yè)化D-阿洛酮糖結(jié)晶工藝?yán)碚撘罁?jù),降低生產(chǎn)成本。