陸靜，申甜甜，焦艷娜，崔鳳云，朱紹華，成婧，易錫，付善良*

（1 長沙海關技術中心 食品安全科學技術湖南省重點實驗室 長沙410004 2 中國海關科學技術研究中心 北京 100026）

二噁英類（Dioxins，DXNs）污染物是一類具有相似化學結構和理化性質及生物效應的多氯代三環(huán)芳烴類化合物的統稱，在結構上分別為多氯代二苯并對二噁英（PCDDs，75 種異構體），氯代二苯并呋喃（PCDFs，135 種異構體）和共平面多氯聯苯（Co-PCB）[1-2]。美國在越戰(zhàn)中使用2，4-滴和2，4，5-涕等落葉劑所造成的危害后果及日本米糠油事件引發(fā)的災難之后，人們開始認識到作為人類社會最為有毒、有害的一類化學物質，DXNs 不僅具有難分解高生物蓄積性，還具有生殖毒性、神經毒性、內分泌毒性和免疫毒性效應等，被國際社會公認為環(huán)境內分泌干擾物[1，3-5]。其中，2，3，7，8-四氯代苯并二噁英（TCDD）是迄今為止發(fā)現毒性最強的化合物，比氰化鉀要毒100 倍以上，被世界衛(wèi)生組織判定為一級致癌物。二噁英類物質毒性的另一個特點是，二噁英為脂溶性化合物，易積累在生物體的脂肪組織中，不易被降解和排出，可在人和動物體內不斷蓄積達到較高濃度，在生物體表現出明顯的癥狀之前有一個漫長的潛伏過程[6-9]。目前，國內還沒有二噁英類物質的限量標準，根據（EC）No 1881-2006 歐盟食品污染物限量標準[10]，食品中二噁英總和的最高限量值為6 pg/g，多氯聯苯的最高限值為12 pg/g。

DXNs 分析屬于超痕量、多組分分析，其分析測定必須具備有效的采樣技術，定量提取和凈化技術，異構體的高效分離，準確的定性和定量，以及良好的質量管理等技術條件[11-12]。且同位素稀釋內標法是國際上通用的測定食品、飼料及環(huán)境樣品中二噁英質量濃度的方法[13-15]。在食品安全受到廣泛關注下，我國修改并采用了美國EPA 1613和EPA 1668A，提出適合我國食品中二噁英以及類似物檢測的標準[16]。在該項標準中，應用高分辨氣相色譜-高分辨質譜聯用（HRGC-HRMS）技術，在質譜分辨率大于10 000 的條件下，通過精確質量測量、監(jiān)測目標化合物的兩個離子，獲得目標化合物的特異性響應。HRGC-HRMS 分析靈敏度高、抗基質干擾強，檢出限可達到fg 級別。然而其運行和維護成本較高，對人員的操作水平也有較高要求。自2014 年6 月起，GC-MS/MS 成為歐盟委員會（EU）規(guī)程2017/644 中的一項確證方法[17]。目前，GC-MS/MS 法已廣泛用于食品、飼料及環(huán)境樣品中二噁英及二噁英類多氯聯苯（PCDD/Fs 和DL-PCBs）的檢測[18-21]。不少學者和專家對比研究了該兩種儀器在檢測PCDD/Fs 的區(qū)別。Palmiotto等[22]采集環(huán)境土樣，研究了GC-MS/MS 和HRGCHRMS 測定同一份樣品的處理后溶液中PCDD/Fs濃度的差異，結果發(fā)現在22 個樣品中，PCDD/Fs的檢出濃度為0.33～14.11 pg WHO-TEQ/g，當樣品的PCDD/Fs 的最低濃度為1 pg WHO-TEQ/g時，兩種儀器的測定偏差＜20%；當樣品的PCDD/Fs 的最低濃度為3 pg WHO-TEQ/g 時，兩種儀器的測定偏差為＜4%。Sun[23]對魚、牛肉以及玉米飼料3 種基質中的PCDD/Fs 濃度進行GC-MS/MS 和HRGC-HRMS 儀器比對檢測，檢出濃度為0.9～9.0 pg/g，兩種儀器的測定偏差為0.7%～14%。

綜上所述，開發(fā)一種適合動物源性食品中PCDD/Fs 和DL-PCBs 的GC-MS/MS 方法是可行的[13，24]。目前發(fā)達國家均以此為技術堡壘，我國必須加快此類方法的標準化研究，建立國際認可的二噁英超痕量分析實驗室，以應對分析技術的挑戰(zhàn)[25-26]。該方法的建立和優(yōu)化能夠有力地保障關區(qū)動物源性食品的順利出口。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

二氯甲烷（農殘級）、甲苯（農殘級）、乙酸乙酯（農殘級）、正己烷（農殘級），iMagiLab 公司；硅膠（農殘級），加拿大Silicycle 公司；濃硫酸（分析純）、無水硫酸鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；硅藻土，美國ThermoFisher 公司。多層硅膠柱、堿性氧化鋁柱、活性炭柱，FMS 美國FMS 公司。

分離度檢查標準溶液，同位素標記定量內標標準溶液、回收率內標標準溶液；含有天然和同位素標記的系列校正標準曲線標準溶液均從Wellington Laboratories（加拿大）公司購買，濃度同國家標準中規(guī)定[16]，臨用時取20 μL 于進樣小瓶中，備用。

硅膠使用前先用甲醇和二氯甲烷活化，晾干后在600 ℃下至少烘烤12 h，再以濃硫酸酸化（44%）。

魚肉樣品為從當地市場購買的草魚，去除內臟、魚骨，肉樣攪碎后以冷凍干燥機干燥，混勻備用。

氣相色譜-三重四極桿串聯質譜儀（Shimadzu GC-MSTQ8050 型），日本島津公司；快速溶劑萃取儀（E-916）、旋轉蒸發(fā)儀（R-300），瑞士步琦公司；全自動樣品凈化系統（JF-602），北京普立泰科公司；冷凍干燥機（Yamato DC801），日本雅馬拓公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理方法

1.2.1.1 提取 稱取5.0 g 冷凍干燥后的樣品于陶瓷研缽中，研磨后與適量硅藻土混合均勻，轉移至40 mL 的萃取池中，加入PCDD/Fs 和DL-PCBs回收率和精密度檢查標準溶液（B.4×10 和B.11×100）各50 μL，13C12-PCDD/Fs和13C12-DL-PCBs 標記的定量內標溶液（B.2 和B.8×10）各20 μL，密閉后置于加速溶劑萃取儀上提取，提取條件如下：提取溶劑正己烷：二氯甲烷（1∶1，體積比）；壓力10.3 MPa；溫度150 ℃；第1 次、2 次、3 次循環(huán)靜態(tài)提取時間分別為10，5，2 min；共計循環(huán)3 次。

1.2.1.2 除脂 將提取液轉移至圓底燒瓶中，旋轉蒸發(fā)濃縮至近干，加入100 mL 正己烷，50 g 酸化硅膠，用旋轉蒸發(fā)儀在70 ℃條件下旋轉加熱20 min。靜置8～10 min 后，將正己烷倒入圓底燒瓶中。殘渣再用50 mL 正己烷洗滌，重復3 次，合并正己烷溶液，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至2～5 mL。

1.2.1.3 凈化 將多層硅膠柱、堿性氧化鋁柱和活性炭柱按順序接在全自動樣品凈化系統上，按程序配好各洗脫溶液并連接好管路，將上述試樣轉移到進樣管中。按照洗脫程序順序洗脫，對樣品進行凈化、分離，分別收集含PCDD/Fs 和DLPCBs 組分的洗脫液，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至3～5 mL。

1.2.1.4 濃縮 將上述濃縮液轉移至KD 濃縮管中，氮吹濃縮到1～2 mL，氮氣流下轉移至微量進樣小瓶中，用正己烷洗滌KD 管，一并轉入進樣瓶濃縮到約100 μL。加入PCDD/Fs 回收率內標標準溶液（B.3）10 μL 和DL-PCBs 回收率內標標準溶液（B.10×100，異辛烷）40 μL，繼續(xù)在微小氮氣流下濃縮至約20 μL，供GC-MS/MS 測定。如果樣品當日不進行儀器分析，則于-10 ℃下避光保存。

1.2.2 儀器分析條件 PCDD/Fs 測定條件：色譜柱：SHIMADZU SH-Rxi-5Sil MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm 膜厚）；柱升溫程序：初始溫度120 ℃，保持1.0 min，以43 ℃/min 升溫至220 ℃，保持15 min，再以2.3 ℃/min 升溫至250 ℃，以0.9 ℃/min升溫至260 ℃，以20 ℃/min 升溫至310 ℃，保持9 min；接口溫度290 ℃，載氣為氦氣（純度不小于99.999%），流量為1 mL/min，恒流模式；離子源：電子轟擊源（EI），溫度230 ℃，電離能量70 eV。進樣量1 μL；燈絲電流0.5 kV；溶劑延遲時間4.5 min。

DL-PCBs 測定條件：色譜柱SHIMADZU SHRxi-5Sil MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm 膜厚）；柱升溫程序：初始溫度80 ℃，保持2.0 min，以15 ℃/min 升溫至150 ℃，以2.5 ℃/min 升溫至270 ℃，保持3 min，以15 ℃/min 升溫至310 ℃，保持3 min；接口溫度290 ℃，載氣為氦氣（純度不小于99.999%），流量為1.2 mL/min，恒流模式；離子源：電子轟擊源（EI），溫度230 ℃，電離能量70 eV。進樣量1 μL；燈絲電流0.5 kV；溶劑延遲時間6.0 min。

采集方式：多反應離子監(jiān)測模式（MRM），母離子/子離子對及其碰撞能量見表1。

2 結果與分析

2.1 色譜柱及儀器檢測條件的選擇

色譜分離時，固定液種類的不同極大地影響目標化合物在色譜柱上的保留時間和分離。本試驗對2，3，7，8-TCDF 異構體的分離進行了探討，結果如下。選用了Agilent J&W HP88（100 m×0.25 mm，膜厚0.20 μm）、Agilent DB-5（50 m×0.32 mm，膜厚1.2 μm）、RTX-2330（60 m×0.25 mm，膜厚0.1 μm）3 種不同型號及規(guī)格的毛細管色譜柱，來考察TCDD/TCDFs 的分離度和時間窗口。當選用HP-88、DB-5 色譜柱時，2，3，7，8-TCDF 的分離度達不到標準要求，目標物的出峰不明顯，因此都無法確定目標物的保留時間。當選用RTX-2330色譜柱時，2，3，7，8-TCDF 分離效果較好，因此進一步優(yōu)化氣相的方法，以達到最優(yōu)的分離度。接下來對進樣口溫度（260，280 ℃），起始柱溫（80，90，100，110，120 ℃），進樣量（1，2 μL）進行了研究，結果發(fā)現，進樣口溫度和進樣量對分離度的影響不大，而起始柱溫影響2，3，7，8-TCDF 的分離，在上述設定的5 種溫度下，結果發(fā)現120 ℃下，2，3，7，8-TCDF 的峰形較好，能夠達到規(guī)定的分離度。

圖1、2 分別為PCDD/Fs 和DL-PCBs 校正標準溶液的MRM 色譜圖（CS3）。

圖1 PCDD/Fs 校正標準溶液的MRM 色譜圖（CS3）Fig.1 Chromatograms of PCDD/Fs solvents（CS3）

圖2 DL-PCBs 校正標準溶液的MRM 色譜圖（CS3）Fig.2 Chromatograms of DL-PCBs solvents（CS3）

2.2 樣品前處理過程探討

因魚肉脂肪含量較低，且水產品為關區(qū)主要的檢測樣品類型，因此，首先選取魚肉為樣品基質，采取快速溶劑萃取儀進行提取，得到提取液，然后以全自動樣品凈化系統進行凈化，在凈化過程中，發(fā)現提取、凈化步驟、洗脫液等主要影響因素[27-28]，分析如下：

當提取循環(huán)1 次時，樣品提取不完全，因此，為了增加目標物的回收率，增加了提取的循環(huán)次數和時間，這和文獻報道的結論一致[29-30]。

根據標準[16]，在同一批樣品分析之前，應首先進行分析過程的精密度和回收率試驗，樣品中同位素內標的回收率需達到25%～150%。結果發(fā)現，77L 和81L 的回收率分別為16.3%，13.5%。因此接下來對這兩個內標的損失來源進行了探討。取B.8×10 溶液20 μL，加入正己烷100 mL 混勻，然后對此溶液分別只進行酸化硅膠凈化、全自動凈化儀凈化。結果發(fā)現，經過酸化硅膠凈化后77L 和81L 的回收率分別為73.1%，73.8%，經過全自動凈化儀凈化后77L 和81L 的回收率分別為38.4%，31.5%，由此可見，全自動凈化儀對目標物的損失影響較大。接下來考察凈化儀的凈化步驟[30]。

凈化步驟如表2 所示，多層硅膠、堿性氧化鋁柱和活性炭柱經過正己烷預潤洗，50%乙酸乙酯/50%甲苯、50%二氯甲烷/50%正己烷、正己烷等活化后，上樣，用正己烷淋洗多層硅膠柱和鋁柱后，以二氯甲烷/正己烷、乙酸乙酯/甲苯洗脫DLPCBs 后，最后活性炭柱經反沖，用甲苯洗脫PCDD/Fs。在初始凈化步驟20～24 步中，系統流出溶液直接排至廢液，對DL-PCBs 的回收率造成較大損失，可能跟DL-PCBs 在管路中的殘留以及在乙酸乙酯/甲苯溶液中有較大溶解性有關。因此，調整洗脫步驟，20～24 步全部收集到DL-PCBs 的接收液中。同時對上樣后每步的淋洗和洗脫液分別進行收集，研究77L 和81L 的損失情況，具體收集情況如下：進樣前空運行一次收集液（S0）、進樣后收集正己烷洗脫液（S1）、收集2%二氯甲烷/98%正己烷洗脫液（S2）、收集50%二氯甲烷/50%正己烷洗脫液（S3）、收集50%乙酸乙酯/50%甲苯洗脫液（S4）、收集正己烷洗脫液（S5）、收集甲苯洗脫液（S6）、收集再運行一次甲苯洗脫液（S7）。如圖3 所示，77L 和81L 主要收集在S4 步驟中，回收率＞60%。而在S5 步驟中也有少量洗脫，約為20%。在S0 和S7 步驟中只有微量的目標物出現，可忽略不計。為了進一步增加77L 和81L 的回收率，增加了50%乙酸乙酯/50%甲苯洗脫液的體積，當增加其洗脫體積由16 mL 至30 mL 時，目標物的回收率增加至80%，同時在S5 環(huán)節(jié)的殘留只有1%，基本可以忽略。然而，新的問題又出現了，因為PCDD/Fs 主要集中在S6 步驟的洗脫液中，當增加S4 的洗脫體積后，最后在以甲苯洗脫PCDD/Fs時，13C12-1，2，3，4，6，7，8-HpCDF、13C12-1，2，3，4，6，7，8-HpCDD、13C12-1，2，3，4，7，8，9-HpCDF、13C12-OCDD 的回收率均小于55%，如圖4 所示。前述幾種目標物有部分損失，可能是在用50%乙酸乙酯/50%甲苯洗脫DL-PCBs 時，PCDD/Fs 同時也被沖到炭柱前端，從而影響PCDD/Fs 的甲苯反沖洗脫，因此，最后還是選擇4 mL 的體積，而增加1次甲苯洗脫，對PCDD/Fs 的回收率影響不大，最終舍去該步驟。

圖3 DL-PCBs 在凈化步驟中的洗脫情況Fig.3 Elution of DL-PCBs in purification step

圖4 PCDD/Fs 在S6 和S7 步驟中的洗脫情況Fig.4 Elution of PCDD/Fs in purification step of S6 and S7

在初始的凈化步驟中，20～24 步溶液沒有收集，PCDD/Fs 的測定峰形較好，當收集此部分溶液后，發(fā)現PCDD/Fs 的測定峰形變差，容易受DLPCBs 干擾。因此，在后續(xù)試驗中，分開收集DLPCBs 和PCDD/Fs，分開測定。當測定完成PCDD/Fs 后，將其和DL-PCBs 的溶液合并，氮吹至約20 μL，達到完整收集和測定DL-PCBs 的目的，可以提高DL-PCBs 的回收率。77L 和81L 的回收率分別為93.0%，97.6%，滿足方法要求。

在上述方法考察中發(fā)現，S0 步驟中目標物的含量可以忽略不計，這也從側面印證了儀器基本不存在殘留和交叉污染問題。但是試驗發(fā)現，全自動凈化儀在程序運行期間如有停電、故障等原因造成的停機、死機時，則容易導致目標物的殘留，出現交叉污染情況，則需要用空白溶劑反復循環(huán)多次才能消除系統污染。因此，在儀器運行期間，需要保證儀器的正常運行。

2.3 方法的線性、檢出限和回收率

將PCDD/Fs 校正標準溶液和DL-PCBs 校正標準溶液分別按濃度由低到高的順序注入GCMS/MS 中，得到峰面積。以目標物的含量為橫坐標，峰面積為縱坐標，根據內標法定量，繪制標準曲線，求出線性相關方程，各物質的線性方程見表3，線性相關系數R2＞0.999，表明該方法在較寬的濃度范圍內色譜峰面積與含量呈較好的線性關系。從表3 可知，儀器測定時，各化合物的相對保留時間為1.000～1.001，符合國家標準的要求。同時，表3 還列出了CS1 測定時的S/N 值，可見S/N值＞3，符合檢出限的計算法則，因此本方法能夠達到國家標準中的限量要求[16]。

表3 PCDD/Fs 和DL-PCBs 的線性方程Table 3 The line equation of PCDD/Fs and DL-PCBs

以魚肉為例，進行分析過程的精密度和回收率（OPR）試驗，加入PCDD/Fs 和DL-PCBs 回收率和精密度標液（B.4×10 和B.11×100）各50 μL，按上述方法進行樣品前處理并分析測定，采用內標法定量，設3 組平行試驗，得到的內標回收率結果見表4，目標物的回收率結果見表5。內標的回收率為63.3%～106.8%，RSD 為0.4%～9.6%；目標物的回收率為93.6%～114.5%，RSD 為0.9%～9.2%。因此，該方法準確可靠，符合標準的要求，可以滿足實際魚肉樣品中PCDD/Fs 和DL-PCBs 的測定要求[16]。

表4 魚肉樣品中PCDD/Fs 和DL-PCBs 的內標回收率和相對標準偏差（n=3）Table 4 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of PCDD/Fs 和DL-PCBs in fish（n=3）

表5 魚肉樣品中PCDD/Fs 和DL-PCBs 的回收率和相對標準偏差（n=3）Table 5 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of PCDD/Fs and DL-PCBs in fish（n=3）

3 結論

本文對采用GC-MS/MS 法測定魚肉樣品中PCDD/Fs 和DL-PCBs 的測定步驟進行了方法優(yōu)化和探討，給前處理及儀器方法提供了更為詳細的解說。試驗結果表明，方法回收率和精密度、各化合物的方法檢出限等都符合國家標準要求，方法具有普適性，為保障食品安全提供了很好的技術支持。