朱艷雯，陳琭璐，劉 玲，顏廷才，檀德宏，白冰

（沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院 沈陽 110866）

蔥屬、菌菇類和藻類中所含的硫化物主要是硫取代的半胱氨酸衍生物[1-5]，它們包括3 類：烷基（烯基）半胱氨酸、烷基（烯基）半胱氨酸亞砜（蒜氨酸）和γ-谷氨酰-烷基（烯基）半胱氨酸肽類[6-7]，它們都是蔥屬植物（如大蒜、洋蔥、韭菜等）中風味硫的來源[8-11]，且具有生理活性[12]，如：降血糖[13-14]、降血脂[15]、抗菌[16]、抗腫瘤[17]、抗炎[18-19]、清除自由基[20]等。在食品工業(yè)或功能活性研究中定量分析蔥屬硫化物具有重要意義[21]。

目前，常用的毛細管電泳法（CE）[22-23]和氣相色譜法（GC）[24]僅局限于檢測半胱氨酸亞砜類物質(zhì)[25]，且需要衍生化處理，GC 還受含硫氨基酸衍生物不易氣化和高熱敏性的限制。液相色譜法（HPLC）檢測前需進行柱前衍生[26]（丹磺酰氯苯、鄰苯二甲醛/叔丁基硫醇、芴甲基氯甲酸酯等）處理，且僅有丹磺酰氯衍生處理才能同時實現(xiàn)樣品中半胱氨酸巰基取代物、亞砜類硫化物以及γ-谷氨酰-半胱氨酸衍生物的測定[27-29]。不論是CE、GC還是HPLC 均屬于大型儀器檢測法，不僅需要復雜的衍生化處理，還需要標準品定量。其它比色法，如用于檢測氨基酸的茚三酮法[30]，檢出限低（mg/mL），對含硫氨基酸（如Cys、Met）顯色差；DTNB法[31]只能測定含有二硫鍵或游離巰基的硫化物。因此，開發(fā)出一種簡單、快速、線性和重現(xiàn)性好、干擾小并能同時檢出總有機硫化物的方法是非常有意義的。

本文研究一種可用于檢測蔥屬硫化物的碘鉑酸鹽比色法，以谷胱甘肽（GSH）為標準品，對該比色法評價，指標包括：標準曲線、最低檢出限（LOD）、最低定量限（LOQ）、可重復性、摩爾消光系數(shù)（ε）、重現(xiàn)性、準確度、精密度。以國內(nèi)外公認的高效液相色譜-電噴霧電離-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLCESI-MS）技術(shù)[32]進行驗證，比較6 種蔥屬作物（白皮蒜、紫皮蒜、大蔥、韭菜、黃洋蔥及紫洋蔥）的總硫化物含量。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

白皮蒜、紫皮蒜、大蔥、韭菜、黃皮洋蔥、紫皮洋蔥，購于沈陽農(nóng)業(yè)大學農(nóng)貿(mào)市場；谷胱甘肽（GSH）、六氯鉑酸、碘化鉀、乙二胺四乙酸（EDTA）、四硼酸鈉、丹磺酰氯等，購于鼎國生物技術(shù)有限公司；12 種硫化物的標準品：S-甲基-L-半胱氨酸（SMC）、S-烯丙基-L-半胱氨酸（SAC）、S-丙基-L-半胱氨酸（SPC）、S-丁基-L-半胱氨酸（SBC）、S-甲基-L-半胱氨酸亞砜（MCSO）、S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜（ACSO）、S-丙基-L-半胱氨酸亞砜（PCSO）、S-丁基-L-半胱氨酸亞砜（BCSO）、γ-谷氨酰-S-甲基-L-半胱氨酸（GSMC）、γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸（GSAC）、γ-谷氨酰-S-丁基-L-半胱氨酸（GSBC）、γ-谷氨酰-S-丙基-L-半胱氨酸（GSPC），通過化學合成以及離子交換層析得到，經(jīng)過高效液相色譜-電噴霧電離-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-ESI-MS）、核磁共振氫譜（1H和13C NMR）以及圓二色譜檢測確定，其純度>95%[15-16]。

高效液相色譜-電噴霧電離-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent 公司；紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；臺式高速離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 硫化物標準溶液的配制 12 種硫化物標準品可劃分為3 類，S-烷基-L-半胱氨酸類（a類）：SMC（1a）、SAC（2a）質(zhì)量濃度范圍：10～60 μg/mL，SPC（3a）：10～100 μg/mL，SBC（4a）：5～30 μg/mL；S-烷基-L-半胱氨酸亞砜類（b 類）：MCSO（1b）、PCSO（3b）和BCSO（4b）質(zhì)量濃 度范圍 為10～20 μg/mL，ACSO（2b）：2～10 μg/mL；γ-谷氨酰-S-烷基-L-半胱氨酸類（c 類）：GSMC（1c）、GSAC（2c）、GSPC（3c）和GSBC（4c）質(zhì)量濃度范圍均為100～600 μg/mL，配置溶液為磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.0）。標準品GSH 質(zhì)量濃度范圍為0～30 μg/mL。

1.2.2 高效液相色譜-電噴霧電離-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-ESI-MS）

1.2.2.1 丹磺酰氯衍生 分別取大蒜（白皮、紫皮）、洋蔥（黃皮、紫皮）、韭菜、大蔥各10 g，浸于70%乙醇（80 mL），煮沸滅酶；冷卻后加入50 mL酸化甲醇（0.01 mol/L HCl）研磨至勻漿，酸化甲醇定容至150 mL 后進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（40 ℃）濃縮至10 mL，0.02 mol/L 硼酸鹽調(diào)節(jié)pH 值至9.2，并用酸化甲醇定容至25 mL，-20 ℃儲存。取100 μL 前處理樣液，加入250 μL 0.1 mol/L 丹磺酰氯-乙腈試劑和1.65 mL 0.020 mol/L 硼酸緩沖液（pH 9.2），充分振蕩后放置15 min。

1.2.2.2 液相質(zhì)譜色譜條件 HPLC-MS：Dikma C18（250 mm×4.6 mm ID，5 μm）；流動相：V（0.05mol/L醋酸鈉）∶V（甲醇）=70/30（0 min），60/40（35 min），25/75（60 min），25/75（65 min），70/30（70 min）；10 mg/mL；20 μL；0.9 mL/min；質(zhì)譜0.4 mL/min；35 ℃；250 nm；30 Pa；ESI-MS 負離子掃描模式[1]。

1.2.3 比色法樣品的前處理 取6 種蔥屬作物樣品（白皮蒜、紫皮蒜、大蔥、韭菜、黃皮洋蔥、紫皮洋蔥）各5 g，分別浸沒于乙醇（70%，80 mL），沸水浴加熱5 min，冷卻至室溫，勻漿，70%乙醇定容至100 mL，8 000 r/min 離心15 min，取上清液備用。

1.2.4 碘鉑酸鹽顯色劑的配置 50 μL，2×10-5mmol/L 的六氯鉑酸溶液與5 mL 0.33 mol/L 的碘化鉀溶液室溫下充分混合，放置12 h 后用1 mol/L的冰醋酸定容至50 mL，配成碘鉑酸鹽顯色劑備用。

1.2.5 比色法測定程序 取40 μL 上清液于試管中，40 ℃鼓風干燥箱烘干后冷卻至室溫，加入2 mL 磷酸緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 7.0）和1 mL 碘鉑酸鹽顯色劑室溫下混勻后于495 nm 下測定吸光度，同時作對照。

1.2.6 比色法的評價指標 比色法從線性指標、檢出限（LOD）、定量限（LOQ）、可重復性、摩爾消光系數(shù)（ε）這5 個指標進行評價。并利用上述提到的6 種蔥屬作物樣品從重現(xiàn)性、準確度和精確度驗證比色法。

1.2.6.1 標準曲線 標準曲線被定義為吸光值和濃度的比值，即（S/Q）i=（Si-a）/Qi，其中（S/Q）i 表示曲線中第i 個點的吸光值（S）與濃度（Q）的比值，即斜率，其中a 表示該曲線在y 軸的截距。

1.2.6.2 最低檢出限（LOD）和最低定量限（LOQ）最低檢出限（LOD）：檢測出的分析物的最低濃度，LOD=3.3 σ/S；最低定量限（LOQ）：能定量檢測出分析物的最低量，LOQ=10 σ/S，兩式中σ 表示對標準品進行3 次平行測定，所計算出的線性回歸方程在y 軸截距的標準偏差；S 表示標準曲線的斜率。

1.2.6.3 可重復性 可重復性由相對標準偏差的平均值來表示，即可重復性=（RSD）eve=（SD（i）/Mean（i））eve，SD 表示在吸光度的標準偏差；Mean 表示吸光度的平均值；i 表示標準品質(zhì)量濃度（μg/mL）。

1.2.6.4 摩爾消光系數(shù)（ε）摩爾消光系數(shù)ε=A/（c×l），式中：ε 的單位為cm2/μmol，A 表示吸光值；c 表示樣品濃度（μmol/cm3）；l 表示光徑（cm），本文選用光徑為1 cm 的石英比色皿，495 nm 比色。

1.2.6.5 重現(xiàn)性 在第1 天、第3 天和第7 天對蔥屬樣品一式3 份進行重現(xiàn)性檢測，重現(xiàn)性表示為相對標準偏差的平均值。

1.2.6.6 準確度 通過對被測定組分進行GSH（5，10，15 mg）回收試驗來評估其準確度。

1.2.6.7 精密度 精密度，即變異系數(shù)（CV%），計算方法為添加GSH 的同一樣品的3 個平行樣的標準偏差與平均值的比值。

1.2.6.8 溶劑干擾檢測 溶劑干擾因子（k）可以表示溶劑的干擾，k=ε1/ε2，式中：ε1表示GSH（5 μg/mL）在待測溶劑中的摩爾消光系數(shù)，ε2表示GSH（5 μg/mL）在水中的摩爾消光系數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 碘鉑酸鹽比色原理

碘鉑酸鹽中因含有深褐色的碘單質(zhì)而具有弱氧化性，與還原態(tài)的硫發(fā)生氧化還原反應生成無色的絡合物導致深褐色變淺。因此選用含巰基（-SH，還原態(tài)硫）的GSH 作為標準品來確定這個比色過程，如圖1。碘鉑酸鹽在495 nm 處有最大吸收，被還原后此處吸光值下降。

2.2 比色法的評價指標（標準曲線、LOD、LOQ、可重復性、重現(xiàn)性、準確度和精密度）

以GSH（0～30 μg/mL）作標準品，如圖2，比色法的標準曲線為y=0.54153-0.00798x，線性相關系數(shù)0.9997，說明此比色法線性關系良好，LOD 值（0.26 μg/mL）和LOQ 值（0.78 μg/mL）較低，檢出限0.39 g/kg，說明此比色法靈敏度較高及檢出限較低；可重復性數(shù)據(jù)90.4%，說明此比色法穩(wěn)定性較好。

第1 天、第3 天和第7 天以GSH 為標準品利用此比色法測定6 種蔥屬樣品（白皮蒜、紫皮蒜、大蔥、韭菜、黃洋蔥、紫洋蔥）的硫化物總含量，得出相對標準偏差的平均值分別為4.0%，4.6%，3.9%，4.5%，2.5%，2.8%，均小于5%，說明該方法具有良好的重現(xiàn)性。通過加入已知量的GSH 計算回收率和變異系數(shù)（表1），利用這兩個指標反映比色法的準確度和精密度，發(fā)現(xiàn)標準品GSH 的回收率均滿足80%～120%，變異系數(shù)均滿足0～5%，說明以GSH 為標準品的此方法具有優(yōu)良的準確度和精密度。

2.3 碘鉑酸鹽比色法測定6 種蔥屬樣品中總硫化物含量

以GSH 作為標準品，分別利用碘鉑酸鹽比色法測得6 種蔥屬樣品中硫化物總量，得到白皮蒜、紫皮蒜、大蔥、韭菜、黃洋蔥、紫洋蔥分別為（6.57±1.09）g，（13.87±1.23）g，（13.96±0.98）g，（2.34±1.09）g，（1.59±0.74）g，（1.77±0.35）g。為進一步驗證此方法實際應用中的準確性，引入HPLC-ESIMS 法進行校對。

2.4 HPLC-ESI-MS 法測定6 種蔥屬樣品中總硫化物含量

以12 種硫化物標準品為外標，經(jīng)HPLC-ES-I-MS 結(jié)合丹磺酰氯衍生測得6 種蔥屬作物（白皮蒜、紫皮蒜、大蔥、韭菜、黃皮洋蔥、紫皮洋蔥）中相應的硫化物含量。以白皮蒜樣品為例（圖3），總離子流圖中顯示出6 種有機硫化物，分別是GSPC（2c）、PCSO（3b）、SAC（2a）、SPC（3a）、GSMC（1c）、GSBC（4c），對應質(zhì)譜圖（圖3，ⅰ～ⅵ）。ESI-MS 正離子掃描模式下，GSPC（2c）對應質(zhì)譜信息如下：GSPC（2c，C11H18O5N2S，保留時間5.3 min，[M+H]+，m/z 290.9），并以外標法計算白皮蒜中含GSPC（0.50±0.17）mg/g；同理，PCSO（3b，C6H13O3NS），（0.86±0.06）mg/g；SAC（2a，C6H11O2NS），（3.86±0.29）mg/g；SPC（3a，C6H13O2NS），（1.25±0.12）mg/g；GSMC（1c，C9H16O5N2S），（0.91 ±0.23）mg/g；GSBC（4c，C12H22O5N2S），（0.78±0.22）mg/g，相加得到硫化物總量為（8.08±0.88）mg/g。其它5 種蔥屬樣品依次按照此方法得出相應硫化物含量及總量，結(jié)果如表2 所示。

2.5 HPLC-ESI-MS 法與碘鉑酸鹽比色法的對比分析

以HPLC-ESI-MS 法測得6 種蔥屬樣品的結(jié)果為依據(jù)，評價以GSH 為標準品時碘鉑酸鹽比色法瞬時檢出總有機硫化物結(jié)果的準確性。以GSH作標準品，比色法所得結(jié)果與HPLC-ESI-MS 法無顯著性差異。因此，碘鉑酸鹽比色法（GSH 為標準品）所得結(jié)果接近實際值（HPLC-ESI-MS 法），進一步證明檢測蔥屬總硫化物時此比色法可替代HPLC-ESI-MS 法。

本文推薦的碘鉑酸鹽比色法，具備操作簡便、穩(wěn)定性好、成本低廉、不需要衍生的預處理過程、可一次性檢出有機硫化物總量的優(yōu)點，適用于快檢分析。本比色法顯色快，且室溫下放置1 周不褪色，穩(wěn)定性好，適用于蔥屬硫化物檢測（>1 g/kg），同時也適用于硫化物含量低的豆類、菌類及十字花科類。本法可檢測多種硫化物，如半胱氨酸衍生物，γ-谷氨酰半胱氨酸衍生物和亞砜衍生物，抗干擾能力強，不受樣品中蛋白及氨基酸影響。

本比色法需注意的是碘鉑酸鹽在中性或酸性環(huán)境下穩(wěn)定，另外某些溶劑具有漂白性，也會影響比色結(jié)果。本文利用吸光值（495 nm）下降比以及溶劑干擾因子k 比較了幾種常見溶劑對比色法的影響，見表3。干擾作用越強，吸光下降越多；k 越接近1，說明溶劑的干擾效果越小。

表3 溶劑干擾因子k值Table 3 Solvent interference factor k value

3 結(jié)論

綜上可見，本比色法具有操作簡便、靈敏度高、適用范圍廣、利用GSH 作標準品時可一次性檢測有機硫化物總量等特點，可適用于現(xiàn)場樣品快速檢測分析，是大型儀器檢測分析的有益補充和替代方法。