張延杰，胡志高，席興軍，衛(wèi)曉，劉靄莎，李汴生，陳益勝，5*

（1 咀香園健康食品（中山）有限公司 廣東中山528414 2 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院 北京100191 3 江南大學(xué)食品學(xué)院 江蘇無(wú)錫214122 4 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 廣州510641 5 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山西太谷 030801）

茶鮮葉中富含多酚類(lèi)物質(zhì)，其含量約占茶鮮葉干質(zhì)量的18%～36%，其中兒茶素含量最高，約占多酚總量的70%。兒茶素化合物屬于黃烷醇類(lèi)，其基本結(jié)構(gòu)是2-苯基苯并吡喃。從茶葉中分離鑒定的兒茶素多為表型兒茶素，主要有4 種，表兒茶素（EC）、表沒(méi)食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG），其中EGCG 在兒茶素中含量最高[1-4]，占兒茶素總量的50%～80%，具有重要的保健功效。

近年來(lái)，諸多研究證明綠茶的健康促進(jìn)作用主要?dú)w因于EGCG[5-6]。EGCG 具有抗氧化、殺菌、抑病毒、消炎、減肥等多種功效[7-12]。Azambuja等[13]研究表明，綠茶EGCG 具有抗炎活性，其作用機(jī)制為兒茶素可以清除體內(nèi)活性氧，調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)通路，抑制炎癥發(fā)生。茶提取物尤其是綠茶提取物和茶多酚可以抑制動(dòng)物模型中不同器官腫瘤的形成和發(fā)展。有研究表明，茶多酚特別是EGCG，可抑制酶活性和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而抑制細(xì)胞增殖和增強(qiáng)細(xì)胞凋亡，并抑制細(xì)胞入侵[14]。Suzuki等[15]研究表明，綠茶具有抗癌、抗肥胖、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗糖尿病、抗菌、抗病毒等活性，這些活性與EGCG的功效密切關(guān)聯(lián)。Al-Basher等[16]研究表明，EGCG可以通過(guò)抑制肝臟鐵蓄積來(lái)改善鐵超負(fù)荷引起的大鼠肝毒性、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，改善肝臟抗氧化能力[17]。此外，通過(guò)測(cè)定EGCG 含量，可以進(jìn)行茶葉分級(jí)，茶葉處理工藝合理性判斷，茶飲料質(zhì)量辨析等[18]，具有重要的應(yīng)用意義。

目前，已有多種方法用于測(cè)定茶葉及茶飲料中的兒茶素，如高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)（HPLC-DAD）[19]、高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）[20]，衍生后的氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）[21]等。最常用的方法始終基于HPLC 分離[22-25]，然而，基于HPLC的方法存在分析時(shí)間長(zhǎng)和溶劑浪費(fèi)的局限性。需要建立一種通量和性?xún)r(jià)比高的方法來(lái)直觀地表征茶產(chǎn)品中的EGCG。

在前期研究中，曾提出以HPTLC 為平臺(tái)，結(jié)合光密度檢測(cè)對(duì)顯色結(jié)果進(jìn)行掃描定量分析的方法[26-27]。然而，此方法在實(shí)際應(yīng)用中存在儀器（光密度掃描儀）單價(jià)昂貴和通用性差的問(wèn)題。使用數(shù)碼相機(jī)對(duì)HPTLC 色譜結(jié)果進(jìn)行數(shù)字化成像，是其它色譜工具不具備的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。這一分析方法不僅為分析者提供了直觀的視覺(jué)定量結(jié)果，而且使得基于像素分析定量替代昂貴的光密度掃描定量成為可能[28-29]。

本文以HPTLC 為分離檢測(cè)平臺(tái)，經(jīng)FeCl3原位衍生顯影和薄層成像后將衍生后的色譜板聯(lián)用光密度掃描定量建立以HPTLC 為分離-分析一體化平臺(tái)的檢測(cè)方法，此外再聯(lián)用數(shù)字化處理軟件ImageJ 對(duì)薄層成像后的圖片進(jìn)行模擬掃描定量，建立一種高效、經(jīng)濟(jì)、可視化薄層色譜像素分析篩檢方法，并將兩種方法進(jìn)行對(duì)比。具體操作：將樣品進(jìn)行點(diǎn)樣、展開(kāi)和分離；使用光密度或成像系統(tǒng)和ImageJ 進(jìn)行平行定量分析，采用目測(cè)檢視法進(jìn)行定性分析；最后使用3 種茶飲料來(lái)驗(yàn)證方法的實(shí)際應(yīng)用能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶飲料樣品，無(wú)錫歐尚超市。EGCG（純度98.0%），阿拉丁公司；無(wú)水乙醇、氯仿、丙酮、甲酸、甲醇、三氯化鐵（均為分析純），Sigma 公司；薄層色譜板，G60 F254 硅膠板，硅膠層厚0.2 mm，規(guī)格10 cm×20 cm，德國(guó)Merck 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ChromaSpray I 型點(diǎn)樣儀；薄層色譜半自動(dòng)點(diǎn)樣儀、薄層色譜全自動(dòng)展開(kāi)儀、薄層色譜浸漬器、薄層色譜掃描儀，瑞士CAMAG 公司；ProVidoc System-DD70 薄層成像系統(tǒng)，德國(guó)Biostep 公司；電子天平（MB104E 型），瑞士Mettler-Toledo 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液及衍生溶液制備 EGCG 標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱(chēng)取10.0 mg（精確至0.1 mg）EGCG 標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL 燒杯中，用適量甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻，得到1 mg/mL EGCG 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。在4 ℃冰箱中恒溫避光保藏，使用時(shí)按比例稀釋至所需倍數(shù)，有效期為1 周。

FeCl3衍生溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g 無(wú)水三氯化鐵標(biāo)準(zhǔn)品，加入100 mL 無(wú)水乙醇，混合均勻后，4 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品預(yù)處理 取3 種茶飲料10 mL 于離心管中，過(guò)0.45 μm 水系濾膜后得到樣品溶液，所得溶液可直接用于HPTLC 點(diǎn)樣，或?qū)⑵浞庞? ℃冰箱中冷藏備用。

1.3.3 硅膠板預(yù)洗 試驗(yàn)用所有硅膠板，使用前均需進(jìn)行預(yù)洗前處理。取10 cm×20 cm 的硅膠板置于ADC-2 薄層色譜全自動(dòng)展開(kāi)儀中，將10 mL色譜級(jí)甲醇從儀器上部?jī)蓚?cè)槽中注入展開(kāi)缸，以其作為流動(dòng)相進(jìn)行展開(kāi)預(yù)洗，展開(kāi)至硅膠板頂端后取出，最后用TLC 加熱器III 在120 ℃條件下干燥20 min，降至室溫后，用錫紙包裝，保存于密封袋中。

1.3.4 HPTLC 色譜展開(kāi) 采用0.5 MPa 氮?dú)鉃檩d體，用ChromaSpray I 型點(diǎn)樣儀精確點(diǎn)樣于10 cm×20 cm 的薄層板上，點(diǎn)樣參數(shù)為：點(diǎn)樣的條帶長(zhǎng)度6 mm，條帶距離底部10 mm，距離左端25 mm，條帶間距自動(dòng)計(jì)算。具體操作：將1～25 μL 標(biāo)準(zhǔn)溶液和10 μL 樣品溶液，以100 nL/s 速度和0.2 μL 預(yù)排體積于硅膠板上噴涂。每次取樣前，注射器用甲醇和超純水手動(dòng)清洗3 次。點(diǎn)樣結(jié)束后用薄層色譜全自動(dòng)展開(kāi)儀展開(kāi)，展開(kāi)前需在儀器的兩側(cè)槽內(nèi)分別注入10 mL 相應(yīng)的流動(dòng)相，展開(kāi)參數(shù)為：氯仿/丙酮/甲酸（12.5/7.5/2.2，體積比），預(yù)平衡5 min，上行展開(kāi)距離80 mm，展開(kāi)完成后系統(tǒng)自動(dòng)結(jié)束。之后將展開(kāi)完成的硅膠板置于60 ℃TLC 加熱器III 上充分干燥5 min，以揮發(fā)去除薄層板上殘留的有機(jī)溶劑，這對(duì)獲得干凈的背景至關(guān)重要。

1.3.5 FeCl3變色反應(yīng)及色譜結(jié)果成像 將完成色譜分離的硅膠板通過(guò)自動(dòng)浸漬裝置浸入FeCl3衍生液中，移動(dòng)速度3 mm/s，停留時(shí)間3 s。然后，將蘸有FeCl3衍生液的硅膠板置于薄層色譜加熱器上50 ℃加熱。當(dāng)硅膠板黃棕色背景出現(xiàn)明顯的黑色斑點(diǎn)后，使用配備佳能EOS 700D 相機(jī)的成像系統(tǒng)對(duì)衍生后的硅膠板進(jìn)行成像記錄，相機(jī)參數(shù)設(shè)定為：白光底部透射光源，自動(dòng)對(duì)焦和校正。

1.3.6 熒光光密度掃描定量分析方法 使用TLC Scanner 3 薄層色譜掃描儀進(jìn)行光密度掃描定量，檢測(cè)參數(shù)：吸光模式，氘燈和鎢燈，激發(fā)波長(zhǎng)620 nm，光柵4.00 mm×0.30 mm（Micro），掃描速度20 mm/s，分辨率100 μm/step。色譜設(shè)備、數(shù)據(jù)采集和處理均使用WinCATS 軟件（1.4.4 版）。

1.3.7 圖像數(shù)字化處理軟件定量分析方法 對(duì)色譜分離結(jié)果的分析，使用ImageJ 軟件（1.52a 版）中像素灰度轉(zhuǎn)化-積分功能對(duì)數(shù)字化圖像進(jìn)行模擬掃描定量。具體操作是：首先將目標(biāo)條帶區(qū)域裁剪并保存為PC 兼容格式（.tif 文件），然后應(yīng)用ImageJ 軟件中的“Image-Color-Split Channels”功能，將原始圖片拆分為3 個(gè)顏色通道（紅色、藍(lán)色、綠色），選出最佳顏色通道后，將該通道下裁剪好的目標(biāo)區(qū)域，使用“Analyze-Gels”功能定義一個(gè)覆蓋目標(biāo)條帶起始線(xiàn)和結(jié)束線(xiàn)的矩形，然后提取這些矩形在垂直方向上的像素灰度值，并用“Plot Lanes”功能進(jìn)行輪廓分析，然后將圖形結(jié)果轉(zhuǎn)換為可積分色譜圖；最后通過(guò)“Straight option”選項(xiàng)繪制基線(xiàn)，使用積分工具“Wand tool”定義色譜圖中峰的面積，所獲取的數(shù)據(jù)峰面積可直接用于定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPTLC-光密度檢測(cè)方法的建立

在HPTLC 分離中，對(duì)硅膠板分離效果評(píng)估的方法一般是目測(cè)檢視法。使用0.1 mg/mL EGCG標(biāo)準(zhǔn)溶 液依次點(diǎn)樣1.5，2，3，5，8，12，17，25 μL，EGCG 標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)HPTLC 分離，用FeCl3浸漬，F(xiàn)eCl3均勻分布于整塊薄層板上，含有EGCG 的區(qū)域（圖1a 各軌道的變色區(qū)域）由黃棕色變?yōu)楹谏?，而其它區(qū)域保持黃棕色不變。使用不同流動(dòng)相進(jìn)行HPTLC 分離條件優(yōu)化，結(jié)果表明：流動(dòng)相為氯仿/丙酮/甲酸時(shí)，EGCG 的比移值（Rf）為0.21，同一軌道上的目標(biāo)物質(zhì)與干擾雜質(zhì)能夠?qū)崿F(xiàn)良好的分離。將分離浸漬干燥后的結(jié)果圖用薄層色譜掃描儀掃描8 個(gè)軌道，結(jié)果見(jiàn)圖1b，發(fā)現(xiàn)視覺(jué)極限值為2 號(hào)軌道分離斑點(diǎn)，因此標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作舍棄1 號(hào)軌道分離斑點(diǎn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2 所示，選擇2～8 號(hào)軌道的7 個(gè)點(diǎn)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=3.1762x-178.26，R2=0.9974。選擇2～6 號(hào)軌道的5 個(gè)點(diǎn)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=3.5009x-358.67，R2=0.9997。最終選擇2～6 號(hào)軌道5 個(gè)點(diǎn)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其線(xiàn)性關(guān)系好，能夠滿(mǎn)足定量要求。

圖1 （a）薄層色譜分離衍生（b）光密度掃描結(jié)果圖Fig.1 （a）Thin layer chromatography separation derivation（b）optical density scan result graph

圖2 光密度掃描分析所得EGCG 標(biāo)曲圖Fig.2 EGCG reticlegation obtained by optical density scanning analysis

選取優(yōu)化后的流動(dòng)相進(jìn)行色譜分離，得到分離結(jié)果見(jiàn)圖3a。將樣品板分離結(jié)果在吸光模式下測(cè)量密度。為了確定最佳檢測(cè)波長(zhǎng)，預(yù)先分析HPTLC 板上EGCG 的全波長(zhǎng)掃描光譜。如圖3b所示，顯然EGCG 標(biāo)準(zhǔn)品在620 nm 處有最大光吸收，同時(shí)樣品軌道中的EGCG 條帶顯示相同的光譜輪廓，表明潛在基質(zhì)對(duì)EGCG 吸光光譜的影響不顯著。此外，評(píng)估了不同光源的性能，包括氘燈、鎢燈、氘燈和鎢燈及汞燈。通過(guò)比較，選擇氘燈和鎢燈，因?yàn)樗粌H提供最高的峰強(qiáng)度，而且有助于色譜圖平滑，如圖3c 所示。因此，將620 nm 光（氘燈和鎢燈）用于定量測(cè)定。

圖3 沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)品（200，400 和800 ng/斑點(diǎn)）和茶飲料樣品提取物的HPTLC 分離和密度測(cè)定Fig.3 HPTLC separation and density determination of gallocatechin gallate standards（200,400 and 800 ng/zone）and rice flour sample extracts

2.2 HPTLC-光密度方法驗(yàn)證

2.2.1 HPTLC-光密度方法的定量性能 為進(jìn)一步評(píng)估優(yōu)化后光密度的定量性能，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的基礎(chǔ)上確定方法的檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）。EGCG 在200～1 200 ng/斑點(diǎn)范圍具有良好的線(xiàn)性關(guān)系（R2=0.9997）。根據(jù)德國(guó)DIN32645方法[30]，以至少95%的置信區(qū)間確定方法的LOD和LOQ。通過(guò)計(jì)算得出EGCG 的LOD 和LOQ 分別為25 ng/斑點(diǎn)和50 ng/斑點(diǎn)。將樣品提取物的上樣量固定在10 mL，這相當(dāng)于茶飲料樣品中EGCG的LOD 和LOQ 分別為2.5 mg/kg 和5 mg/kg。如果需要，就可通過(guò)使用更大的上樣量來(lái)增加檢測(cè)能力。任何情況下，即使在極低水平下，該檢測(cè)能力應(yīng)足以定量檢測(cè)EGCG，因?yàn)椴栾嬃现胁瓒喾樱▋翰杷仡?lèi)約占20%）的含量一般50～80 mg/kg[30]。同時(shí)該方法也取得非常高的精密度（RSD<8.2%），因此建立的HPTLC-光密度方法用于測(cè)定EGCG 含量具有很強(qiáng)的實(shí)用性。

2.2.2 HPTLC-光密度方法的準(zhǔn)確性 為進(jìn)一步評(píng)估優(yōu)化后HPTLC-光密度方法的準(zhǔn)確性，選取3種茶飲料進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)。在選取的茶飲料1、茶飲料2、茶飲料3 樣品中分別添加20，40，80 mg/kg 的EGCG 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果見(jiàn)表2。添加不同濃度的EGCG 的標(biāo)準(zhǔn)溶液后，茶飲料1、茶飲料2、茶飲料3 的回收率分別在103.5%～110.8%，95.3%～111.2%，99.3%～111.2%之間，表明HPTLC-光密度方法測(cè)定樣品中的EGCG 具有較高的準(zhǔn)確性。因此，以上結(jié)果證明所建立的方法可以用于篩檢茶飲料中EGCG 的含量，這對(duì)一款茶飲料價(jià)值的評(píng)估起到積極作用。

表1 HPTLC-光密度的準(zhǔn)確性和精密度評(píng)估Table 1 Accuracy and precision evaluation of HPTLC-densitometometric analysis

表2 HPTLC-ImageJ 的準(zhǔn)確性和精密度評(píng)估Table 2 Accuracy and precision evaluation of HPTLC-ImageJ

表3 方法對(duì)比Table 3 Method comparison

2.3 HPTLC-ImageJ 定量方法的建立

經(jīng)ImageJ 軟件將HPTLC 分離結(jié)果圖拆分為“藍(lán)、紅、綠”3 個(gè)顏色通道，如圖4 所示，（a）“藍(lán)色”通道下目標(biāo)斑點(diǎn)不顯現(xiàn)，于是，選擇“紅，綠”兩種顏色通道制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。如圖5 所示，取2～6軌道的5 個(gè)點(diǎn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，在“紅色”通道下，200～1 200 ng/斑點(diǎn)范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=11.87x-1 961.2，R2=0.9983；在“綠色”通道下，200～1 200 ng/斑點(diǎn)范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=14.535x-1 619.9，R2=0.9995，因此選擇相關(guān)性更高的綠色通道下得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)做后續(xù)分析。

圖4 經(jīng)ImageJ 拆分成3 個(gè)顏色通道Fig.4 Split into three color layers by ImageJ

圖5 （a）紅色和（b）綠色通道下的EGCG 的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖Fig.5 Standard curves of EGCG under the red layer（a）and the green layer（b）

2.4 HPTLC-ImageJ 方法驗(yàn)證

2.4.1 HPTLC-ImageJ 定量方法驗(yàn)證 在200～1 200 ng/斑點(diǎn)范圍，綠色顏色通道下，EGCG 具有良好的線(xiàn)性關(guān)系（R2=0.9995）。根據(jù)德國(guó)DIN32645方法[31]，以至少95%的置信區(qū)間確定方法的LOD和LOQ。通過(guò)計(jì)算得出EGCG 的LOD 和LOQ 分別為34 ng/斑點(diǎn)和68 ng/斑點(diǎn)。將樣品提取物的上樣量固定在10 mL，這相當(dāng)于茶飲料樣品中EGCG的LOD 和LOQ 分別為3.4 mg/kg 和6.8 mg/kg。如果需要，可使用更大的上樣量來(lái)增加檢測(cè)性能。

2.4.2 HPTLC-ImageJ 方法的準(zhǔn)確性 在選取的茶飲料1、茶飲料2、茶飲料3 樣品中分別添加20，40 mg/kg 和80 mg/kg 的EGCG 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果見(jiàn)表2。添加不同濃度的EGCG 標(biāo)準(zhǔn)溶液后，茶飲料1、茶飲料2、茶飲料3 的回收率分別在102.4%～110.8%，102.3%～118.8%，100.3%～113.5%之間，表明HPTLC-光密度掃描對(duì)樣品中EGCG 的測(cè)定有較高的準(zhǔn)確性。3 次平行分析所得RSD<6.7%，證明所建方法具有良好的精密度。

2.5 兩種方法對(duì)比

HPTLC-ImageJ 和HPTLC-光密度的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)相差不大且均在0.999 以上。兩種方法的回收率均滿(mǎn)足要求，具有良好的準(zhǔn)確性。兩種方法的精密度相差不大，HPTLC-ImageJ 略?xún)?yōu)于HPTLC-光密度掃描。綜上，HPTLC-ImageJ 可以代替HPTLC-光密度掃描，其準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、高效。

3 結(jié)論

本章建立了HPTLC-ImageJ 和HPTLC-光密度兩種快速檢測(cè)茶飲料中活性物質(zhì)EGCG 含量的方法。HPTLC-ImageJ 方法中“藍(lán)色”通道下像素分析得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)性系數(shù)高于“紅色”通道，因此，本試驗(yàn)分析在“綠色”通道下進(jìn)行。對(duì)比兩種方法，它們的線(xiàn)性、準(zhǔn)確度和精密度非常接近，使用ImageJ 圖像數(shù)字化處理軟件代替光密度掃描儀節(jié)省了成本，具有實(shí)際應(yīng)用意義。