房楠楠，杜 青，宋瑤瑤，張 雪，李 瑩，秦 義，宋育陽，劉延琳

（西北農林科技大學葡萄酒學院 陜西楊凌 712100）

葡萄酒釀造過程中，發(fā)酵溫度對葡萄酒品質有重要的影響[1-2]。低溫發(fā)酵常用于白葡萄酒和桃紅葡萄酒的釀造，近幾年研究者們引入低溫發(fā)酵技術以增強紅葡萄酒的芳香特征[3]。研究表明，較低的發(fā)酵溫度（10～15 ℃）能更好地保留葡萄酒的香氣，增加酯和脂肪酸的含量，提高葡萄酒的花果香；降低葡萄酒中高級醇和揮發(fā)酸的含量，減少敗壞性氣味物質的生成；同時也降低發(fā)酵過程中細菌污染的風險[4-6]。然而，釀酒酵母最適生長溫度范圍為25～32 ℃[7]。當發(fā)酵在低溫下進行時，酵母的生長速率減緩，多種細胞的代謝過程發(fā)生變化[8]，造成葡萄酒發(fā)酵緩慢，甚至發(fā)酵停止[9-12]，因此釀酒酵母的低溫耐受能力決定著低溫發(fā)酵能否順利進行[13-14]。近年來，研究者通過多種方式提高酵母的低溫耐受能力，如Garcia等[15]和Ortiz等[16]通過酵母屬種間雜交提高釀酒酵母的低溫耐受能力。Chiva等[17]通過適應性進化、誘變篩選低溫耐受的酵母菌，然而得到的菌株低溫耐受能力并不理想。釀酒酵母的低溫耐受性是由多基因控制的數(shù)量性狀，其分子機制至今不清楚[18]。Gautschi等[19]研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，ARD1 基因缺失的菌株在20℃和38 ℃中的生長受到抑制，說明ARD1 基因可能參與酵母的溫度脅迫適應性。本研究室人員前期報道了1 株低溫耐受的本土酵母菌株（ZX11）[20]。基于此菌株，找到并證明ARD1 基因是與ZX11菌株低溫耐受相關的基因。

ARD1 基因首次在釀酒酵母中被報道[21]，它作為Nα-末端乙?；D移酶NatA 的催化亞基，是NatA 酶行使乙?；δ鼙夭豢缮俚幕騕22]。Ard1p可與核糖體穩(wěn)定結合，介導NatA 復合物對蛋白質進行N-末端乙?；揎?。由于NatA 具有較多的細胞底物[23]，ARD1 還具有廣泛的兼職功能，比如ARD1 具有KAT 活性，介導催化ε-氨基的乙?；?，并刺激細胞增殖[24-25]；介導HSP70 乙酰化來調節(jié)平衡蛋白質的復性、降解反應[26]；與PIX（一種鳥嘌呤核苷酸交換因子GEF）相互作用，發(fā)揮其抗轉移功能，抑制細胞的遷移能力[23]。酵母中ARD1 基因的研究較少。Whiteway等[27]提出ARD1 介導酵母孢子的形成，進而影響細胞的有絲分裂周期。

本研究通過基因敲除、基因回補等方法證明ARD1 基因與釀酒酵母ZX11 的低溫耐受的相關性。利用GST-Pull down 聯(lián)合質譜檢測，酵母雙雜交驗證由CBK1 編碼的Cbk1p 蛋白和ARD1 編碼的Ard1p 蛋白互作，為闡明ZX11 響應低溫脅迫的分子機制奠定基礎，為選育優(yōu)良的低溫耐受釀酒酵母提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

本試驗所用菌株：野生型酵母菌株ZX11 為本實驗室保存。大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21（DE3）、酵母菌Y2HGold 購自普因特生物技術有限公司。

本試驗所用質粒：pUG6SH（帶有潮霉素抗性基因）、pGEX-4T-1、PGADT7、PGBKT7、PGADT7-T、PGBKT7 -p53、PGBKT7 -Lam、pCDF -MCS1 -AtUBA1 質粒由本實驗室保存；GST-ARD1、GSTCBK1、His-ARD1 為本研究構建。

試劑及試劑盒：葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂、胰蛋白胨、YNB、-Ura DO Supplement、Amp、潮霉素等試劑購自寶生物生物科技有限公司；限制性內切酶（EcoR I、BamH I、Spe I）、蛋白Marker、Primestar Max Premix（2×）、1×SDS loading buffer、X-ɑ-Gal、還原型谷胱甘肽等分子生物學試劑、缺陷培養(yǎng)基購自寶生物生物科技有限公司；大腸質粒提取試劑盒，購自OMGA 公司；MangneGSTTMparticles 和MagneGSTTMBinding/Wash Buffer，購自Promega 公司；酵母總蛋白提取試劑盒，購自貝博生物試劑有限公司；Anti-His 多克隆抗體、Anti-FLAG 多克隆抗體、Anti-GFP 多克隆抗體、二抗Anti -IgG，購 自 Affinity Biosciences；Proleinlso GST Resin、GST 平衡緩沖液、Ni-NTA預裝重力柱，購自Sangon 公司。

1.2 方法

1.2.1 基因敲除及基因回補載體構建 通過NCBI 查閱目的基因ARD1 的參考序列（Gene ID：856404），釀酒酵母的參考菌株為Saccharomyces cerevisiae S288c（strain：S288c），利用軟件CE Design V1.04 設計含有45 bp 左右的同源臂的引物KO-Hph-ARD1-F（ACCTAAATACATACGATC AAGCTCCAAAATAAAACTTCGTCAACCCATATG GACATATTGTCGTTAGA）和KO-Hph-ARD1-R（AGAAGCCTGGATGAAAATATACTACGTTTATAT AGGTTGATTTAAAATACGACTCACTATAGGGAG AC），以pUG6SH 為模板PCR 擴增敲除框（潮霉素抗性基因），參考馮莉[20]的方法轉化至ZX11 菌株中。取100 μL 菌液涂布在含有潮霉素的YPD 平板上，30 ℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆接種于50 mL的YPD 培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min 培養(yǎng)12～16 h，參考馮莉[20]的方法提ZX11 基因組，以ard1-F（CAGCAACGAGTAATTGCCAAGTG）和ard1-R（CTGCAGTGTTTAGAACCGTGCTC）為驗證引物，通過PCR 擴增敲除框片段，并送到擎科生物有限公司進行測序。

利用限制性內切酶Spe I 和EcoR I 對pY26載體線性化處理，插入片段獲得以SpeI-ARD1-pY26T-F（TCGACGGATTCTAGAACTAGTCGAAGTATGCCTATTAATATTCGCAGAGC）和 ARD1 -EcoRI-pY26T-R（CGACGGTATCGATAAGCTTGA TATCGAATTCTTATACAATGATATCATTTACGCC）為引物，以ZX11 基因組為模板PCR 擴增。利用一步克隆試劑盒將片段和載體連接，構建pY26 -ARD1 重組質粒轉化至大腸桿菌DH5α，提取陽性菌株質粒以 pY26C -F（GGACAGGTATCCGGTAAGCG）和pY26C-R（CGTACACGCGTCTGTACAGA）為驗證引物，通過PCR 擴增后，送到擎科生物有限公司進行測序。

1.2.2 菌株的低溫脅迫處理 取待測菌株50 μL接種于50 mL 的YPD 液體培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min 過夜培養(yǎng)，取適量菌液轉接于新的50 mL 的YPD 培養(yǎng)基中，使其初始OD600nm值為0.1，于4 ℃，150 r/min 培養(yǎng)，每48 h 測1 次OD600nm值，以在30 ℃生長的菌株做對照，觀測其生長曲線。

將pY26-ARD1 質粒轉化至ZX11△ard1 菌中，回補ARD1 基因，構建ARD1-ZX11△ard1 菌株，在SD-Ura 培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～2 d 后，用無菌水將菌液稀釋到OD600nm值為1，再進行梯度稀釋10-1～10-4，從每個梯度稀釋液中取2 μL 點樣于YPD 固體培養(yǎng)基上，4 ℃下培養(yǎng)16 d，以30 ℃生長的菌株做對照，進一步驗證ARD1 與低溫脅迫的相關性。

1.2.3 GST-Pull down 聯(lián)合質譜分析篩選互作蛋白 GST-Pull down 試驗方法按照Promega 公司的MagneGSTTMPull Down System 進行。

1）表達載體構建及融合蛋白的表達純化 參照1.2.1 節(jié)的方法構建重組質粒GST-ARD1，將質粒轉化至大腸桿菌BL21（DE3）中，以GST 質粒為對照。取50 μL 菌液加入30 mL 的LB（+Amp）培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)活化；將培養(yǎng)物按1∶100 比例接入200 mL LB（+Amp）液體培養(yǎng)基中，200 r/min，37 ℃培養(yǎng)至OD600=0.4～0.6；以預試驗確定的最佳IPTG 濃度、時間和溫度誘導表達融合蛋白。4 ℃，5 000 r/min 離心5 min 后棄培養(yǎng)液，用30 mL GST 緩沖液重懸菌體；用低溫超高壓連續(xù)流細胞破碎儀破碎2～3 次，4 ℃，12 000 r/min 離心30 min 留上清，過0.22 μm 的濾膜。取80 μL MagneGSTTM磁珠于2 mL 的PE管中，用MagneGSTTM Binding 平衡柱子。取400 μL 上一步誘導表達的融合蛋白上清液于磁珠中，4 ℃旋轉孵育，用500 μL Wash Buffer 洗脫雜蛋白。取出GST-ARD1 誘餌蛋白和GST-磁珠的混合物，GST標簽蛋白與GST-磁珠的混合物。

2）酵母總蛋白的提取 參考貝博公司的酵母總蛋白提取試劑盒說明書提供的步驟，提取ZX11 酵母總蛋白。

3）ARD1 互作蛋白的篩選 將ZX11 酵母總蛋白過0.22 μm 濾膜，取400 μL 分別與上一步得到兩組蛋白-磁珠混合物混合，4 ℃旋轉孵育，用500 μL 的Wash Buffer 洗脫雜蛋白。洗滌完成后加 入40 μL 1×SDS loading buffer，95 ℃煮 沸5 min，將蛋白混合樣品分離。所得溶液是通過GSTPull down 初步篩選到的互作蛋白混合液，取20 μL 混合液進行SDS-PAGE 檢測。

1.2.4 LC-MS/MS 篩選互作蛋白 將上一步得到的蛋白膠用手術刀片切下整個泳道，并將目的條帶切成1 mm2大小的膠塊置于5 mL 的EP 管中，加入無菌水在室溫下進行脫色處理，至膠塊無色透明，送到陜西致研生物科技有限公司進行質譜檢測。

1.2.5 酵母雙雜交（Yeast Two-Hybrid Assays）檢驗互作蛋白 參照1.2.1 節(jié)的方法構建重組質粒pGBKT7-ARD1 和pGADT7-Prey 質粒，轉化至酵母菌株Y2H Gold，30 ℃，150 r/min 培養(yǎng)1～2 d，用無菌水將菌液稀釋到OD600nm值為1，取2 μL 菌液點樣于相應的SD 固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，觀察酵母菌生長狀況和菌落顏色變化。

1）自激活驗證 按照上述步驟，將2～5 μg pGBKT7-ARD1 轉化至酵母Y2HGold 中，再將pGADT7 轉化至酵母pGBKT7-ARD1（Y2HGold）中，涂布在DDO（-Leu/-Trp/SD）培養(yǎng)基上，生長3～5 d，挑取單菌落接種于DDO 液體培養(yǎng)基，在30 ℃下培養(yǎng)2～3 d，吸取2 μL 酵母菌液點樣于TDO（-Leu/-Trp/-His/SD/X-ɑ-Gal）固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，觀察酵母菌生長狀況和菌落顏色變化。

2）蛋白互作驗證 將pGBKT7-ARD1 和pGADT7-Prey 共同轉化至酵母Y2HGold 中，同時將陽性對照（pGBKT7-53 和pGADT7-T）和陰性對照（pGBKT7-Lam 和pGADT7-T）共同轉化至Y2HGold 中，分別涂布在DDO 培養(yǎng)基上，生長3～5 d，挑取單菌落接種于DDO 液體培養(yǎng)基，在30℃下培養(yǎng)2～3 d，吸取2 μL 酵母菌液點樣于QDO（-Leu/-Trp/-His/-Ade/SD/X-ɑ-Gal）固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，觀察酵母菌生長狀況和菌落顏色變化。

1.2.6 GST-Pull down 驗證互作蛋白 參照1.2.1節(jié)的方法構建重組質粒His-ARD1 和GST-Prey質粒。本試驗設置2 組對照組和1 組試驗組。對照組1 為His 質粒與GST-Prey 質粒共同轉化至BL21（DE3）中，對照組2 為His-ARD1 質粒與GST 質粒共轉至BL21（DE3）中，試驗組為His-ARD1 和GST-Prey 質粒共同轉化至大腸桿菌BL21（DE3）中。

試驗組和對照組1 用Proleinlso GST Resin對融合蛋白進行分離純化。取1 mL 50%的谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂勻漿，用5～10 倍柱體積的GST 平衡緩沖液平衡層析柱，至流出液電導和pH 值不變（與平衡液一致）；取35 mL 的融合蛋白與Proleinlso GST Resin 混合，在4 ℃下孵育5～10 h；用10 倍柱體積的平衡緩沖液洗滌層析柱，收集流出液；用洗脫緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，10 mmol/L 還原型谷胱甘肽）洗脫并收集蛋白混合樣品；取80 μL 蛋白混合樣品加 入20 μL 5×loading buffer，95 ℃煮沸5 min，所得溶液即獵物蛋白和誘餌蛋白的混合液。

對照組2 用Ni-NTA 對融合蛋白進行分離純化。取1 mL 50% 的Ni-NTA 勻漿，用5～10 倍柱體積的平衡緩沖液（20 mmol/L Tris-HCL pH 7.5、0.5 mol/L NaCl、10%甘油、5 mmol/L 的咪唑）平衡層析柱；取35 mL 的融合蛋白與Ni-NTA 混合，在4 ℃下孵育5～10 h；用10 倍柱體積的平衡緩沖液（20 mmol/L Tris-HCL pH 7.5、0.5 mol/L NaCl、10%甘油、20 mmol/L 的咪唑）洗滌層析柱，收集流出液；用洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris-HCL pH 7.5、0.5 mol/L NaCl、10%甘油、150 mmol/L咪唑）洗脫并收集蛋白混合樣品；取80 μL 蛋白混合樣品加入20 μL 5×loading buffer，95 ℃煮沸5 min。分別取20 μL 上述樣品進行SDS-PAGE 電泳檢測，并進行Western Blot 檢測。

2 結果

2.1 基因敲除與基因回補載體構建

用驗證引物PCR 擴增同源重組在ZX11 基因組上的潮霉素抗性基因，核酸電泳檢測片段長度應為1 999 bp（如圖1a）與預期相符，經測序進一步確認ARD1 基因敲除成功；用驗證引物PCR 擴增重組質粒GST-ARD1，核酸電泳檢測插入片段長度應為1 168 bp（如圖1b），經測序表明目的片段插入無誤，重組表達載體構建成功。

圖1 ARD1 基因敲除與基因回補載體構建Fig.1 Construction of ARD1 gene knockout and gene complementation vector

2.2 菌株的低溫脅迫響應

為了驗證ARD1 與野生型釀酒酵母ZX11 耐受低溫的關系，本研究測試了30 ℃和4 ℃下ZX11 與ZX11△ard1 突變菌株在YPD 液體培養(yǎng)基中的生長狀況。繪制的兩組菌株生長曲線，如圖2 所示，在30 ℃下，兩組菌株的生長趨勢差異不大。生長8 h 后兩組菌幾乎同時進入穩(wěn)定生長期。在4 ℃下，ZX11 在整個生長周期中有明顯的生長優(yōu)勢，其在對數(shù)生長期生長較快，僅用200 h 進入穩(wěn)定生長期，OD600值穩(wěn)定在5.2 左右。與在30 ℃下生長的趨勢相似。ZX11△ard1 沒有明顯的生長拐點，生長緩慢，生長400 h 后OD600nm值趨于穩(wěn)定，OD600值穩(wěn)定在3 左右，與該條件下ZX11 菌株差異較大，也與在30 ℃下的生長有顯著差異。該結果說明ARD1 基因敲除影響ZX11 菌株在低溫條件下的生長。

圖2 不同溫度條件下ZX11 和突變菌株（ZX11△ard1）的生長曲線Fig.2 Growth curves of ZX11 and mutant strain（ZX11△ard1）at different temperatures

將ARD1 基因回補到ARD1 敲除菌株ZX11△ard1 中，在30 ℃和4 ℃環(huán)境下的生長情況如圖3 所示。在30 ℃中，3 組菌斑在每個濃度梯度下差異較小。4 ℃環(huán)境中，ZX11△ard1 菌斑在OD600nm為1 的時候就有差異，從10-1到10-4濃度下幾乎沒有生長，說明敲除ARD1 基因后，菌株在低溫環(huán)境下生長受到抑制。ZX11△ard1 回補ARD1 基因后，菌斑大小又恢復到原來的狀態(tài)，說明ARD1 基因對ZX11 菌株在低溫環(huán)境下的生長起著關鍵的作用。

圖3 不同溫度環(huán)境下ZX11、突變菌株（ZX11△ard1）和突變菌株回補ARD1 基因的生長狀況Fig.3 Growth status of ZX11，mutant strain（ZX11△ard1）and mutant strain complementing ARD1 gene at different temperatures

2.3 表達載體構建及融合蛋白的表達純化

GST-ARD1 和GST 表達載體轉化大腸桿菌DH5α 菌株，培養(yǎng)并提取質粒后轉化BL21（DE3）表達菌株，IPTG 誘導表達 GST-ARD1 誘餌蛋白和GST 標簽蛋白，預試驗中最佳誘導表達條件是添加0.2 mmol/L IPTG，于16 ℃下誘導培養(yǎng)18 h，該條件下，上清液中的蛋白表達比較均一且表達量穩(wěn)定，融合蛋白GST-ARD1 分子質量55.3 ku，標簽蛋白GST 分子質量27.9 ku。通過GST-磁珠純化，結果如圖4 所示，大部分雜蛋白消失，得到純度較高的帶有GST 標簽的融合蛋白。

圖4 融合蛋白GST-ARD1 和標簽蛋白GST 的表達純化Fig.4 Expression and purification of GST-ARD1 fusion protein and GST-tagged protein

2.4 GST-Pull down 聯(lián)合質譜分析篩選互作蛋白

2.4.1 GST-Pull down 篩選互作蛋白 成功提取ZX11 的總蛋白，然后將總蛋白分別與結合在GST-磁珠上的GST-ARD1 誘餌蛋白和GST 標簽蛋白進行孵育，煮脫的混合蛋白樣品經SDSPAGE 進行檢測，結果如圖5 所示，純化后的誘餌蛋白可以與GST 磁珠親和，融合蛋白GST-ARD1分子質量55.3 ku，標簽蛋白GST 分子質量27.9 ku。除去對照組條帶，試驗組仍有差異條帶，說明目的蛋白在ZX11 總蛋白中釣取了部分互作蛋白。

圖5 混合蛋白樣品的SDS-PAGE 檢測Fig.5 SDS-PAGE detection of mixed protein samples

2.4.2 質譜分析互作蛋白 通過質譜鑒定，首先選擇只在GST-ARD1 試驗組中被鑒定到的蛋白，并剔除存在于GST 對照組中的蛋白。根據(jù)蛋白亞細胞定位信息以及已經報道的蛋白質功能，篩選到12 種可能與ARD1 相互作用的蛋白質，如表1所示。

表1 LC-MS/MS 鑒定的ARD1 相互作用蛋白Table 1 ARD1 interacting proteins identified by LC-MS/MS

2.5 酵母雙雜交（Yeast Two-Hybrid Assays）檢測互作蛋白

2.5.1 pGBKT7-ARD1 自激活檢測 用一步克隆試劑盒構建pGBKT7-ARD1 和pGADT7-CBK1重組載體，經電泳檢測和測序，鑒定重組載體構建成功。分別將pGBKT7-53 和pGADT7-T（陽性對照）、pGBKT7 -Lam 和pGADT7-T（陰性對照）以及pGBKT7-ARD1 和pGADT7（試驗組）共同轉化至Y2HGold 酵母中。

取3 組菌液點樣在相應的平板上，菌株生長情況如圖6a 所示。均在TDO 的平板生長，說明質粒轉化成功，陽性對照在QDO/X-ɑ-Gal 的固體培養(yǎng)基上生長，陰性對照和試驗組沒有在QDO/Xɑ-Gal 的固體培養(yǎng)基上生長，說明ARD1 基因沒有自激活作用。

圖6 酵母雙雜自激活檢測及互作驗證Fig.6 Yeast two-hybrid self-activation detection and interaction verification

2.5.2 蛋白互作關系驗證 取3 組菌液點樣在相應的平板上，均在TDO 固體培養(yǎng)基上生長，說明質粒轉化成功，陰性對照沒有在DDO/X-ɑ-Gal 的固體培養(yǎng)基上生長，陽性對照和pGADT7-CBK1在DDO/X-ɑ-Gal 固體培養(yǎng)基上生長并變色（如圖6b），說明ARD1 基與CBK1 在酵母中存在互作。

2.6 GST-Pull down 驗證互作蛋白

將對照組和試驗組的混合蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳結果如圖7a 所示。對照組1 中有融合蛋白GST-CBK1，分子質量為114.6 ku。對照組2 中有His-ARD1 融合蛋白，分子質量為31 ku，試驗組中分別檢測到GST-CBK1 和His-ARD1 蛋白。結合免疫共沉淀結果，如圖7b 所示，試驗組中檢測到Cbk1p 和Ard1p 蛋白，即CBK1與ARD1 結合，說明CBK1 與ARD1 在體外存在直接相互作用。

圖7 GST-Pull down 點對點驗證ARD1 與CBK1 的相互作用Fig.7 GST-Pull down peer-to-peer verification of the interaction between ARD1 and CBK1

3 討論與結論

本研究通過基因敲除和基因回補，構建了ZX11△ard1 和ARD1-ZX11△ard1 突變體菌株，研究它們在30 ℃和4 ℃下的生長表型，確定了ARD1 基因是與釀酒酵母ZX11 低溫耐受相關的基因；通過GST-Pull down 聯(lián)合質譜分析獲得了與Ard1p 互作的蛋白Cbk1p，用酵母雙雜交技術和GST pull-down 驗證了兩個在體外和酵母體內均存在互作。CBK1 是AGC 激酶家族的成員之一，與NDR 蛋白激酶關系密切[28]。在釀酒酵母中，Cbk1p 通過多位點磷酸化，負責幾丁質酶轉錄的轉錄因子Ace2p 的激活，調控細胞周期[29]，這種調控對ACE2 細胞的定位和酵母生長過程中的細胞分離十分重要[4]。Wakade等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在酵母生長階段，CBK1 可以磷酸化調節(jié)多個基因來影響酵母的生長分裂，例如，CBK1 通過磷酸化SSD1，影響酵母細胞壁的合成，進而影響細胞的有絲分裂。

因此CBK1 基因和酵母的生長繁殖與細胞壁功能有著密切的聯(lián)系，而細胞壁對于酵母響應低溫脅迫有關鍵作用[31]，ARD1 在低溫條件下可能通過與CBK1 相互作用來參與酵母細胞的分裂過程，影響細胞壁完整性，從而調控酵母低溫耐受能力。本研究結果對深入研究ARD1 基因調控釀酒酵母低溫耐受的分子機制具有重要意義。