劉凱龍，黃 天，劉曉曄，玉 霞，姚國強

（內蒙古農業(yè)大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室 農業(yè)農村部奶制品加工重點實驗室內蒙古自治區(qū)乳品生物技術與工程重點實驗室 呼和浩特 010018）

益生菌即活的、被足量攝入后對宿主有益的微生物[1]，具有降膽固醇、增強免疫、改善胃腸道功能以及抗病毒等作用[2-5]。益生菌一般分為雙歧桿菌屬、乳植桿菌屬、乳酪桿菌屬等[6]，其中雙歧桿菌屬是最早定殖于人體腸道，作為嬰幼兒腸道內的核心菌群，對于理想腸道菌群的建立至關重要[7-8]。目前，動物雙歧桿菌乳亞種作為益生菌已被深層次研究并廣泛應用到食品加工領域及醫(yī)療領域等，然而在菌株生產、使用過程中，通常會出現(xiàn)形態(tài)突變、碳水化合物利用能力下降、生長周期延長等衰退現(xiàn)象[9]，因此對于菌株的遺傳穩(wěn)定性評估尤為重要。目前對益生菌遺傳穩(wěn)定性的研究包括對其連續(xù)傳代過程中的表型特性、細胞學、分子生物學等方面[10]。隨著高通量技術的發(fā)展，可在基因層面實現(xiàn)對菌株的遺傳穩(wěn)定性評估，并根據(jù)測序結果，推測基因數(shù)目、功能及表達機制，揭示菌株的直系同源序列，從而分析其遺傳特性和驗證表型演化[11-12]。

前期研究表明動物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalis subsp.lactis，B.animalis subsp.lactis）V9 對胃腸的消化液具有良好的耐受性，體外試驗表明，該菌株經胃腸道消化后存活率為92.44%，可耐受的膽鹽質量濃度為0.3 g/100 mL[13]，并對腸道致病菌具有拮抗作用，可顯著提高腹瀉康復率，調節(jié)免疫等益生功能[14-15]。本研究擬評價動物雙歧桿菌乳亞種V9 連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中的遺傳穩(wěn)定性，從菌體形態(tài)變化、碳水化合物利用能力等表型穩(wěn)定性方面著手，并結合比較基因組學分析其進化的基本規(guī)律，評價其遺傳穩(wěn)定性，為動物雙歧桿菌乳亞種V9 的進一步開發(fā)及產業(yè)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株與試劑 動物雙歧桿菌乳亞種V9（V9），由內蒙古農業(yè)大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室提供。

TPY 液體培養(yǎng)基（配方：葡萄糖5.00 g/L，水解酪蛋白10.00 g/L，大豆胨5.00 g/L，酵母粉2.00 g/L，K2HPO42.00 g/L，氯化鎂0.50 g/L，硫酸鋅0.25 g/L，氯化鈣0.15 g/L，氯化鐵0.002×10-3g/L，Twain-80 1.00 g/L，MgSO47H2O 0.10 g/L，L-半胱氨酸0.50 g/L），卡邁舒生物科技有限公司；瓊脂糖、核酸染料、2 000 DNA Marker 等，大連寶生物技術有限公司。

1.1.2 設備與儀器 離心機，貝克曼庫爾特商貿（中國）有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，恒科技儀器股份有限公司；pH 計，梅特勒（上海）公司；紫外分光光度計，NanoDrop 公司；BX50 光學顯微鏡，OLYMPUS 公司（日本）；Applied biosystems PCR 儀，伯樂公司等。

1.2 試驗方法

1.2.1 V9 活化及傳代培養(yǎng)

1.2.1.1 生長曲線的測定 將-80 ℃冷凍保藏的供試菌株接種于TPY（表1）液體培養(yǎng)基中，接種量為1%（體積分數(shù)），37 ℃嚴格厭氧培養(yǎng)（24±0.5）h，每隔2 h 取樣（N=3），于波長600 nm 處測定其吸光值、pH 值，繪制生長曲線。

表1 TPY 液體培養(yǎng)基Table 1 TPY liquid medium

1.2.1.2 連續(xù)傳代培養(yǎng) 將-80 ℃冷凍保藏的V9原始菌種活化2 代后劃線于固體TPY 培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)（72±0.5）h，挑取單菌落，接種于新鮮液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再以體積分數(shù)1%的接種量接種于新鮮液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)，將0，25，50，75，100 代分別標記為A0，A25，A50，A75 和A100。

1.2.1.3 菌株代數(shù)的計算 通過1.2.1.1 節(jié)確定的穩(wěn)定期時間作為傳代培養(yǎng)時間，公式為：

式中：N0——以1%接種量接入新鮮液體培養(yǎng)基的初始活菌數(shù)，CFU/mL；Nf——穩(wěn)定期活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.2 V9 連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中表型檢測

1.2.2.1 菌體形態(tài)觀察 連續(xù)培養(yǎng)100 代過程中，對不同代時的V9 進行革蘭氏染色、鏡檢、觀察菌體形態(tài)，并初步確認菌株純度。

1.2.2.2 碳水化合物代謝能力 按照API 50CHL試劑盒說明書制備。將A0、A25、A50、A75 和A100菌懸液吸至API 50CHL 碳水化合物鑒定試劑條中，用無菌石蠟封口，37 ℃嚴格厭氧培養(yǎng)（48±0.5）h，查看顯色結果。培養(yǎng)液中所含溴甲粉紫指示劑變?yōu)辄S色（25 號管變?yōu)楹谏殛栃苑磻?，表明該菌株可利用對應的碳水化合物；反之為陰性反應，表明該菌株不可利用對應碳水化合物?9 種碳水化合物見表2。

表2 API 50 CHL 乳桿菌鑒定系統(tǒng)各種碳水化合物一覽表Table 2 API 50 CHL Lactobacillus identification system list of various carbohydrates

1.2.3 V9 基因組分析

1.2.3.1 基因組DNA 提取及純度檢測 對V9 的A0、A25、A50、A75 和A100 提取DNA，將提取的DNA通過Nanodrop 進行純 度測定（A260nm/A280nm，A260nm/A230nm），使用瓊脂糖凝膠電泳對條帶完整度及純度進行檢測。使用STE 傳統(tǒng)方法對菌株全基因組進行提取，純度檢測同上，濃度檢測使用Qubit，滿足要求后通過Nanopore 平臺進行全基因組測序。

1.2.3.2 組裝及環(huán)化 通過NextDenovo 軟件組裝，然后使用Circlator 軟件將二代數(shù)據(jù)進行環(huán)化[17]。通過Pilon 軟件使用二代數(shù)據(jù)對三代數(shù)據(jù)進行Polish[18-19]。最終獲得不同代時的V9 全基因組序列。

1.2.3.3 平均核苷酸一致性計算 參考Goris等[20]的方法，對V9 不同代時菌株基因組與其原始基因組進行平均核苷酸一致性計算，用自制Perl 腳本比較菌株間的平均核苷酸一致性值。

1.2.3.4 SNP 位點分析 以V9 原始序列作為參考基因組，使用Mummer 軟件對菌株不同代時的SNP 位點進行識別分析，利用Soapsnp 軟件進行SNP 位點檢測驗證[21]。

1.2.3.5 系統(tǒng)發(fā)育樹構建 將1.2.2.4 節(jié)識別的SNP 位點整理成序列，利用軟件ITOL 構建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行可視化。

1.2.3.6 碳水化合物活性酶分析 將V9 不同代時菌株的全基因組與碳水化合物活性酶（CAZymes）數(shù)據(jù)庫進行功能注釋，根據(jù)注釋結果統(tǒng)計菌株中潛在的CAZymes 家族，通過TBtools軟件進行可視化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 V9 生長曲線

微生物的不同生長周期，菌種的生理狀態(tài)有所差異[22]。菌種的傳代通常選擇對數(shù)生長期末期或者穩(wěn)定期初期為宜。吸入射光（OD600nm）會因細胞的散射作用而呈現(xiàn)對應的變化趨勢，當吸光值為600 nm 時，在一定程度上可以反映培養(yǎng)液中V9的生長變化趨勢[23]，如圖1 所示。

圖1 動物雙歧桿菌乳亞種V9 原始菌株生長曲線Fig.1 The growth curve of the original B.animalis subsp.lactis V9

V9 在37 ℃、厭氧培養(yǎng)24 h 過程中pH 值、OD600nm的變化趨勢：0～8 h V9 處于延滯期，OD600nm上升緩慢，8 h 后進入對數(shù)生長期，OD600nm迅速上升，pH值大幅度下降，20 h 時OD600nm達到最 大值，之后趨于平緩，進入穩(wěn)定期。

2.2 V9 菌株代數(shù)計算結果

根據(jù)上述繪制的V9 生長曲線，對其在生長初始及穩(wěn)定初期進行活菌計數(shù)，計算菌株的代數(shù)。具體結果見表3。V9 初始活菌數(shù)為（2.70±0.52）×106CFU/mL，對數(shù)末期活菌數(shù)為（2.79±0.24）×108CFU/mL，參照1.2.1.3 節(jié)菌株生長代時計算方法，到達穩(wěn)定期V9 的生長代數(shù)約為6.69 代，且在20 h 進入穩(wěn)定期，故以24 h 為傳代周期，平均每天傳1 次，約6.69 代，連續(xù)傳100 代，約15 d 完成。

表3 動物雙歧桿菌乳亞種V9 原始菌株代數(shù)結果（n=3，）Table 3 Algebraic results of the starting strain of B.animalis subsp.lactis V9（n=3，）

表3 動物雙歧桿菌乳亞種V9 原始菌株代數(shù)結果（n=3，）Table 3 Algebraic results of the starting strain of B.animalis subsp.lactis V9（n=3，）

表4 不同代時動物雙歧桿菌乳亞種V9 碳水化合物（API 50CHL）利用情況（n=3，）Table 4 Utilization of carbohydrates（API 50CHL）of B.animalis subsp.lactis V9 in different generations（n=3，）

表4 不同代時動物雙歧桿菌乳亞種V9 碳水化合物（API 50CHL）利用情況（n=3，）Table 4 Utilization of carbohydrates（API 50CHL）of B.animalis subsp.lactis V9 in different generations（n=3，）

（續(xù)表4）

注：“+”表示可利用；“-”表示不可利用。

2.3 V9 連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中表型研究

2.3.1 菌株連續(xù)傳代過程中的菌體形態(tài)觀察 對V9 在A0、A25、A50、A75 和A100 菌懸液進行 革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。對比結果見圖2。V9 連續(xù)傳100 代菌體形態(tài)均屬于動物雙歧桿菌典型形態(tài)，且不同代時的菌體形態(tài)無明顯差異。

2.3.2 碳水化合物代謝能力 梅里埃碳水化合物鑒定（API 50CHL）試劑盒可對不同碳水化合物的代謝能力進行分析，并用于菌株鑒定或分型。V9可利用12 種碳水化合物，包括L-阿拉伯糖、D-核糖、D-葡萄糖、苦杏仁苷、七葉靈檸檬酸鐵、D-麥芽糖、D-乳糖、D-密二糖、D-蔗糖、D-棉子糖和D-龍膽二糖，且V9 在A0、A25、A50、A75 及A100時碳水化合物代謝能力無顯著差異（P＞0.05）。

2.4 V9 連續(xù)傳代中基因組研究結果

2.4.1 GTDB 基因組數(shù)據(jù)庫比對 利用NextDenovo 軟件對3 代測序得到的原始Reads 進行組裝，組裝完成后將5 個代時的V9（N=3）分別與GTDB數(shù)據(jù)庫比對，結果見表5。GTDB 比對結果顯示該菌株屬于動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）。

表5 GTDB 比對結果Table 5 GTDB comparison results

2.4.2 基因組信息 利用Circlator 軟件將組裝后的三代數(shù)據(jù)進行環(huán)化，并使用Pilon 軟件對Nanopore 測序數(shù)據(jù)進行驗證[17]。最終得到不同代時V9 的基因組序列。分析其基因組信息，結果顯示A0、A25、A50、A75 和A100 的V9 平均基因組大小為1.96 Mb，平均GC 含量為60.48%，且無質粒，結果見表6。參考基因組的大小為1.94 Mb，GC含量為60.50%，傳代過程中的不同代時V9 與原始參考菌株基因信息無顯著差異（P＞0.05）。

表6 動物雙歧桿菌乳亞種V9 基因組信息Table 6 B.animalis subsp.lactis V9 genome information

2.4.3 ANI 計算 平均核苷一致性（ANI）是反映近緣菌株間平均堿基相似度最重要的指標。通常，當ANI 值大于95%時為同一種或亞種[24]。為了在基因組水平上評估V9 連續(xù)傳代過程中菌株間的遺傳關系，計算V9 5 個代時的ANI 值，并用TBtools 軟件對ANI 值可視化。如圖3 所示，不同代時的V9 間表現(xiàn)出高度相似性，ANI 值均大于99.99%，表明傳代過程中菌株均屬同一亞種，即動物雙歧桿菌乳亞種。

2.4.4 SNP 分析 單核苷酸多態(tài)性（SNP）是指在基因組層面上，因單個核苷酸的變異而導致的DNA 序列的多態(tài)性[25]。本研究以V9 原始序列作為參考基因組，對不同代時的株菌SNP 位點進行識別分析，結果發(fā)現(xiàn)在不同代時株菌中共鑒定到42個SNP 位點，其中包括4 個同義突變，9 個非同義突變，其余29 個位于基因間區(qū)。將SNPs 位點結合gff 進行功能注釋，得到與SNPs 突變相關的基因及功能，如表7 所示。非同義突變分別位于ISL3樣元素IS2001 家族轉運酶、ABC 轉運蛋白ATP結合蛋白/滲透酶、C69 家族二肽酶、糖苷-戊苷-己酮陽離子同向轉運的基因上，同時這些突變均未發(fā)生在影響碳水化合物酶功能的基因上。

在連續(xù)傳代的過程中高頻突變數(shù)量較少，檢測到5 個SNP 發(fā)生在第0 代基因組與參考基因組之間，一旦建立將穩(wěn)定存在。菌株低頻突變被檢測到的數(shù)量均小于21，其鑒定為同一菌株。分析發(fā)現(xiàn)0 代的菌株與25 代菌株相比，沒有穩(wěn)定遺傳的SNP 位點，A25-3 與A50-3 菌株在同一基因位點僅發(fā)現(xiàn)一個SNP；第50 代與75 代不存在相同位點SNP；A75-1 與A100-1 菌株在同一基因位點僅發(fā)現(xiàn)一個SNP，并沒有穩(wěn)定遺傳。陳霞[25]以動物雙歧桿菌乳亞種AD011 全基因組序列作為參考，研究發(fā)現(xiàn)動物雙歧桿菌乳亞種V9、Bi04 和DSM10140 共存在276 個SNP 位點，其中包括38個同義突變、178 個非同義突變、60 個位于基因間區(qū)，平均每株菌擁有92 個SNP，判定為少數(shù)突變。相比較V9 不同代時的SNP 多態(tài)性極少，遺傳異質性較低，因此，V9 在連續(xù)傳代過程中有較好的遺傳穩(wěn)定性。

2.4.5 系統(tǒng)發(fā)育樹 系統(tǒng)發(fā)育樹可直觀反映同一群體內不同個體間的遺傳距離，通過其判斷菌株在連續(xù)培養(yǎng)過程中的穩(wěn)定性[27]。聚集在同一分支，表明菌株之間的多樣性較低，遺傳距離較近。進一步了解V9 不同代時15 株的遺傳距離，以V9 原始基因組序列為參考基因組，基于15 株菌的SNPs 序列，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4 所示。不同代時的V9 與參考基因組聚在同一分支，親緣性較近，具有高度相似的遺傳特性。

2.4.6 碳水化合物活性酶注釋 碳水化合物是生物體維持生命活動所需能量的主要來源。碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫（CAZy）是物質對碳水化合物及其衍生物的合成及分解的酶類數(shù)據(jù)庫[26]，其將碳水化合物活性酶分成為六大基因家族，包括糖苷水解酶（GHs）家族、糖基轉移酶家族（GTs）家族、多糖裂解酶（PLs）、碳水化合物酯酶（CEs）、輔助氧化還原酶（AAs）和碳水化合物鏈接模塊（CBMs）[27]。其中GH s 家族主要作用是糖苷鍵的水解和重排，GTs 家族主要作用是糖苷鍵的形成，PLs 家族主要作用是糖苷鍵的非水解裂解，CEs 家族主要作用是水解碳水化合物的酯類，AAs 家族主要作用是與CAZymes 協(xié)同作用的氧化還原酶，CBMs 家族主要作用是與碳水化合物結合。為在全基因組水平上了解V9 不同代時菌株對碳水化合物的代謝能力，通過碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫在DBCAN2 網(wǎng)站上對V9 的碳水化合物活性酶功能基因進行分析，結果如圖5 所示。

共注釋到四大類碳水化合物活性酶的62 個小類基因家族，包括15 個糖苷水解酶家族（GH）、7 個糖基轉移酶家族（GT）、6 個碳水化合物結合結構域家族（CBM）和3 個碳水化合物酯酶家族（CE）。不同代時菌株注釋到的碳水化合物活性酶類不存在顯著差異（P>0.05），碳水化合物代謝相關基因基本一致。由此表明V9 不同代時菌株碳水化合物代謝功能基因高度保守，遺傳穩(wěn)定性良好。

3 結論

對動物雙歧桿菌乳亞種V9 連續(xù)傳100 代過程中的表型特征及基因組穩(wěn)定性進行評價，結果表明：V9 在連續(xù)傳100 代過程中具有穩(wěn)定的表型特征、分子遺傳特征，表明其具有良好的遺傳穩(wěn)定性，有利于產業(yè)化應用。