陳天笑，白小剛，何 茜，胡 冰，曾炳山，陸釗華

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510642）

在全球惡劣的氣候變化下，非生物脅迫成為限制林木可持續(xù)生產(chǎn)的主要脅迫[1]。我國華南地區(qū)其土壤類型主要是紅壤，土壤養(yǎng)分貧瘠，保肥能力差[2]，再加上華南地區(qū)暴雨頻發(fā)[3]，土壤礦質(zhì)營養(yǎng)淋失嚴(yán)重，使得林地土壤肥力退化，因此營養(yǎng)脅迫成為華南地區(qū)制約植物生長發(fā)育和林木生產(chǎn)力的主要因素之一。當(dāng)今應(yīng)對土壤養(yǎng)分匱乏的策略主要是化肥的使用和作物選育[4]。但由于林地生產(chǎn)者缺少科學(xué)的施肥技術(shù)和方法，常常出現(xiàn)化肥施用過量的情況，這不僅增加了生產(chǎn)成本，而且會對植物產(chǎn)生毒害作用，并且會對環(huán)境造成污染[5]，所以通過營養(yǎng)學(xué)和遺傳學(xué)的手段進(jìn)行優(yōu)良品種選育是一種行之有效的方法。

黑木相思Acaciamelanoxylon是含羞草科金合歡屬的常綠大喬木，原產(chǎn)于澳大利亞東部和東南部。因其具有生長迅速、木材材性優(yōu)良、適應(yīng)能力強(qiáng)、改土性能好、能夠調(diào)整樹種結(jié)構(gòu)、改善生態(tài)功能等特點，近年來隨著其優(yōu)良無性系的成功選育及在華南地區(qū)栽培面積逐年增加，是兼顧生態(tài)效益、社會效益和經(jīng)濟(jì)效益的多功能樹種。但因其速生性，在生長發(fā)育過程中對礦質(zhì)營養(yǎng)的需求量大，在實際推廣過程中發(fā)現(xiàn)黑木相思表現(xiàn)出明顯缺氮的癥狀，進(jìn)而制約黑木相思人工林的生產(chǎn)力。由于不同黑木相思基因型的遺傳特性存在差異，在應(yīng)對氮缺乏生長形態(tài)表現(xiàn)不一，因此了解不同基因型應(yīng)對缺氮脅迫的適應(yīng)能力的差異，能夠為黑木相思早期選育優(yōu)良基因型提供理論基礎(chǔ)。

氮素是植物生長發(fā)育過程中必需的大量元素之一，也是蛋白質(zhì)、氨基酸、葉綠素和激素等物質(zhì)的必需成分[6-8]。氮素在核酸和蛋白質(zhì)合成、光合作用、呼吸作用以及氮代謝等生理生化過程中發(fā)揮重要的作用[7,9]。在氮素缺乏時，植株矮小、生長受到抑制，植株總生物量降低，植株會將更多資源分配給根系使得根系具有更強(qiáng)的養(yǎng)分吸收能力，根系生長受到促進(jìn)，根冠比增加[10]。缺氮會降低光合作用、降低了電子傳遞速率、光合相關(guān)酶的活性和含量，降低羧化作用，增加光能向熱能轉(zhuǎn)化[11]。有研究表明，缺氮降低了咖啡幼苗的光合速率（Pn）、電子傳遞速率（ETR）、PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率（Fm/Fv）和PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率（Fm′/Fv′），且不同咖啡品種對脅迫下敏感度不同[12]。在植物適應(yīng)生長條件時，細(xì)胞器內(nèi)的活性氧（ROS）水平較低，但在缺氮脅迫下，ROS水平升高，植物細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生和消除間的平衡受到破壞，為了保護(hù)膜脂不被氧化破壞，植物體會產(chǎn)生一些抗氧化酶抵御其傷害，抗氧化酶主要有超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD），因此抗氧化酶活性能夠反映出植物的抗逆性程度[13-14]。丙二醛（MDA）是膜脂被氧化的最終產(chǎn)物，能夠反映脂質(zhì)膜脂破壞程度[15]。缺氮脅迫與抗氧化系統(tǒng)在很多植物都有研究，如米槁[16]、光皮樺[17]、楊樹[18]、連翹[19]等。NUE表示氮素利用效率，表示植物吸收到體內(nèi)單位質(zhì)量的氮素能夠形成干物質(zhì)量的多少，Asif等[20]的研究表明不同氮素利用效率的棉花品種在不同硝酸鹽濃度下的響應(yīng)在地上部干質(zhì)量、根系形態(tài)和氮代謝的酶活性等方面存在較大差異。國內(nèi)開展過黑木相思缺氮脅迫研究[21]，但未涉及抗逆性酶、熒光參數(shù)以及氮素利用效率和基于各項指標(biāo)的綜合評價。本研究以4個黑木相思優(yōu)良無性系基因型幼苗（F1、SR3、SR14和SR17）為對象，利用砂培盆栽法人工模擬缺氮脅迫條件，研究缺氮對不同基因型生長和生理生化特性的影響，比較不同基因型之間響應(yīng)策略的差異，并通過主成分分析結(jié)合隸屬函數(shù)進(jìn)行耐低氮綜合評價，為林木氮素營養(yǎng)研究提供更多的數(shù)據(jù)支撐，也為林木抗逆性早期選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于中國廣東省中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所實驗苗圃（23°11′34″N，113°22′40″E），屬南亞熱帶季風(fēng)氣候。根據(jù)廣州市氣象臺發(fā)布的數(shù)據(jù)，廣州市2022年的年均氣溫23.2 ℃，7月平均氣溫為30.5 ℃，年平均降水量為1 891.9 mm，年均日照時數(shù)為1 780.9 h。

1.2 試驗材料

供試材料為4種黑木相思基因型（F1、SR3、SR14和SR17）組培苗，由中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所林木生物技術(shù)實驗室提供。選用1～2 mm的純凈石英砂酸洗晾干后作為基質(zhì) ，試驗采用規(guī)格15.7 cm×12.4 cm×16.5 cm（上口徑×底部直徑×高）的塑料花盆，每盆裝2.6 kg石英砂，每盆種植1株，盆底下放置濾紙防止石英砂流失。營養(yǎng)液采用改良后的Hoagland營養(yǎng)液，設(shè)置CK (16 mmol·L-1N素)和-N (0 mmol·L-1N素)兩個處理，pH調(diào)至5.8，所有藥品均為分析純，采用超純水配置。

1.3 試驗設(shè)計

2022年2月中旬將供試基因型從培養(yǎng)瓶中各取出300株種植在土壤中進(jìn)行煉苗，2個月后選取長勢基本一致（苗高為15±0.5 cm）、生長健康的試驗材料進(jìn)行缺氮脅迫試驗，試驗處理為4個基因型與2種氮素處理的組合，共8個處理，每處理組合30株，每株為1個重復(fù)。于2022年5月移栽到裝有石英砂的塑料花盆中，緩苗2周，期間加蓋80%遮陽網(wǎng)，并用1/4的全素營養(yǎng)液培養(yǎng)，待苗生長平穩(wěn)并長出新葉后用超純水培養(yǎng)，饑餓處理1周。2022年6月試驗正式開始，前兩周用1/2濃度的營養(yǎng)液，第3周后全劑量營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。每隔3 d澆100 mL營養(yǎng)液，每天固定時間進(jìn)行澆水，澆水量可視天氣和苗木生長狀況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。每隔2周配施2‰的多菌靈或甲基托布津與超純水一起灌入基質(zhì)中預(yù)防霉菌并隨機(jī)調(diào)整擺放位置以減少邊緣效應(yīng)。待12周幼苗出現(xiàn)明顯的生長表型差異后，測定表型數(shù)據(jù)后采集樣本進(jìn)一步測定。

1.4 試驗方法

1.4.1 苗高、地徑

2022年9月對各處理全部植株進(jìn)行苗高和地徑測量，苗高采用直尺測量，地徑采用游標(biāo)卡尺測量。

1.4.2 生物量及根冠比

將植株分為根、莖和葉三部分，再將各處理植物組織樣品放入烘箱中105 ℃下殺青30 min，在70 ℃下烘干至恒質(zhì)量，然后用天平分別稱根、莖、葉的質(zhì)量，即為各器官干質(zhì)量。全株總干質(zhì)量為根、莖和葉干質(zhì)量之和，根冠比采用根干質(zhì)量與地上部分干質(zhì)量（葉干質(zhì)量+莖干質(zhì)量）的比值表示。

1.4.3 氮素積累量及利用效率

取測定完生物量的烘干植株，測定各處理下植株根、莖和葉的N含量。N元素含量測定采用凱氏定氮法（詳見NY/T 2017—2011）；各器官（根、莖、葉）元素N素積累量采用各器官（根、莖、葉）N素含量與各器官（根、莖、葉）生物量的乘積表示；全株N素積累量為根、莖和葉N素積累量之和；全株N素利用效率以全株生物量與全株N素積累量的比值表示。

1.4.4 氣體交換參數(shù)測定

凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）和胞間CO2濃度（Ci）使用Li-6800便攜式光合測定儀（Li-Cor Inc.USA）測定。在2022年9月選擇晴天上午9:00—12:00，每個處理選擇長勢一致的3株，每株選取靠近頂芽倒數(shù)第5至第7片成熟功能葉進(jìn)行測定，并做好標(biāo)記，共測定9片葉。樣品室CO2濃度設(shè)置為400 μmol·m-2·s-1，相對濕度設(shè)置為50%，流速設(shè)定為500 μmol·s-1，風(fēng)扇轉(zhuǎn)速10 000 rpm，采用LED紅藍(lán)光源（90%紅光），光強(qiáng)設(shè)置為1 000 μmol·m-2·s-1，測定時待Pn趨于穩(wěn)定后進(jìn)行記錄，每片葉子記錄10次，取平均值[22]。

1.4.5 熒光參數(shù)測定

選擇上述已標(biāo)記的葉片，使用Li-6800便攜式光合測定儀進(jìn)行測定，測定時間、葉室參數(shù)設(shè)定與測定氣體交換參數(shù)的設(shè)定相同，飽和脈沖光設(shè)為8 000 μmol·m-2·s-1（100 Hz，1 000 ms）。測定前用錫箔紙包裹葉片進(jìn)行暗適應(yīng)至少20 min，測定初始熒光（F0）和最大熒光（Fm），隨后打開活化光（1 000 μmol·m-2·s-1），光適應(yīng)30 min以上，測定出光適應(yīng)下初始熒光（F0′）和最大熒光（Fm′）。計算PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）、PSⅡ有效光化學(xué)量子產(chǎn)量（Fv′/Fm′）[22]。

1.4.6 葉綠素含量測定

選取上述已標(biāo)記的葉片帶回實驗室，將新鮮葉片剪碎混勻，稱取0.1 g植物葉片組織和10 mL 80%的丙酮加入15 mL離心管，在低溫、黑暗條件下浸泡24 h，期間搖晃2次，待植物組織完全變白后取上層清液測定波長在440、645和663 nm下的吸光度，按照公式計算出葉綠素a、葉綠素b及葉綠素a+b總量的含量[23]。

葉綠素a+b含量（Chla+b）=Chla+Chlb。式中：A440、A663和A645分別為表示在波長440、663和645 nm下測定的吸光度，V為各樣品色素提取液的總體積，L；m為各樣品的質(zhì)量，g。

1.4.7 抗氧化酶及MDA測定

SOD活性、POD活性、CAT活性和MDA含量測定參考植物超氧化物歧化酶（SOD）酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書、植物過氧化物酶（POD）酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書、植物過氧化氫酶（CAT）酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書和植物丙二醛（MDA）酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書。

1.5 耐低氮能力綜合評價

參考張雷[24]的方法，首先計算各個測定指標(biāo)的耐低氮系數(shù)；然后對各指標(biāo)的耐低氮系數(shù)進(jìn)行主成分分析，得各綜合指標(biāo)系數(shù)及貢獻(xiàn)率，求得綜合指標(biāo)值。

式（5）中：CI(m)為綜合指標(biāo)值，Bi為各測定指標(biāo)進(jìn)行規(guī)范化的值，Prin(m)i為綜合指標(biāo)的系數(shù)，之后對各無性系的綜合指標(biāo)進(jìn)行隸屬函數(shù)分析；

式（6）中：Xi表示第i個綜合指標(biāo)，Xmin表示第i個指標(biāo)的最小值，Xmax表示第i個綜合指標(biāo)的最大值。根據(jù)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)度進(jìn)行各綜合指標(biāo)權(quán)重計算；

式（7）：Wi表示第i個綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中的重要程度，Pi表示第i個綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率，最后結(jié)合隸屬函數(shù)值和權(quán)重計算各無性系的綜合耐低氮能力；

式（8）：D為各無性系在缺氮脅迫下的耐受性綜合評價值，D值越大，代表耐低氮能力越強(qiáng)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

本試驗所有數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件進(jìn)行平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差計算，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，使用單因素方差分析（One-way ANOVA）和Ducan’s多重比較法檢測樣本間的顯著性差異，N積累量分配率比較采用獨立樣本T檢驗，采用Origin 2023軟件進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 缺氮對不同黑木相思基因型幼苗苗高和地徑的影響

由圖1可知，苗高和地徑受基因型差異和缺氮處理影響極顯著（P＜0.01），地徑受基因型差異和缺氮處理交互作用影響顯著（P＜0.05）。F1、SR3、SR14和SR17的苗高在缺氮條件下較對照（CK）均顯著降低，降幅分別為20.7%、25.5%、19.1%和13.6%。SR3、SR14和SR17的地徑在缺氮下較CK顯著降低（P＜0.05），降幅分別為17.7%、12.6%和19.2%，而F1變化不顯著。

圖1 缺氮對不同黑木相思基因型的苗高和地徑的影響Fig.1 Effects of nitrogen deficiency on seedling height and ground diameter in different genotypes of A.melanoxylon

2.2 缺氮對不同黑木相思基因型幼苗生物量和根冠比的影響

由圖2可知，全株干質(zhì)量和根冠比受基因型差異和缺氮處理影響顯著（P＜0.05），根冠比受基因型差異、缺氮處理和兩者交互作用影響顯著（P＜0.05）。與CK相比，4個黑木相思基因型的地上部干質(zhì)量和全株干質(zhì)量在缺氮均呈下降趨勢。在缺氮下，F(xiàn)1、SR3、SR14和SR17的地上部干質(zhì)量分別較CK降低了30.9%、43.6%、44.9%和52.7%，全株干質(zhì)量分別較CK降低了27.3%、40.3%、42.7%和48.4%，缺氮下4個黑木相思基因型的根冠比均顯著升高（P＜0.05），而根干質(zhì)量均無顯著變化。

圖2 缺氮對不同黑木相思基因型的生物量和根冠比的影響Fig.2 Effects of nitrogen deficiency on the biomass and root-to-shoot ratio in different genotypes of A.melanoxylon

2.3 缺氮對不同黑木相思基因型幼苗光合色素含量的影響

由圖3可知，葉綠素a（Chla）含量、葉綠素b（Chlb）含量、類胡蘿卜素（Car）含量和葉綠素a+b（Chla+b）含量受基因型差異、缺氮處理以及兩者交互作用影響極顯著（P＜0.01），表明缺氮對不同黑木相思基因型的光合色素含量表現(xiàn)不一。在缺氮下，4個黑木相思基因型幼苗的Chla含量、Chlb含量、Car含量和Chla+b含量均較CK均顯著降低（P＜0.05），其中這4個指標(biāo)降幅最大的基因型是SR17，而F1的Chla含量和Car含量降幅最小，SR3的Chlb和Chla+b含量降幅最小。

圖3 缺氮對不同黑木相思基因型的光合色素含量的影響Fig.3 Effects of nitrogen deficiency on the content of photosynthetic pigments in different genotypes of A.melanoxylon

2.4 缺氮對不同黑木相思基因型幼苗氣體交換參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

由表1可知，凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）、氣孔限制值（LS）和Fv′/Fm′受缺氮處理影響極顯著（P＜0.01），F(xiàn)v/Fm、凈光合速率（Pn）、胞間CO2（Ci）和氣孔限制值（LS）受基因型差異影響顯著（P＜0.05）。Fv/Fm和F0′/Fm′受基因型和缺氮處理兩者交互作用影響顯著（P＜0.01）。在缺氮下，4個黑木相思基因型幼苗的Pn均顯著降低（P＜0.05），其中SR17降幅最大，降低了76.8%，其中F1降幅最小，降低了39.1%；缺氮下4個黑木相思基因型幼苗的Gs均呈下降趨勢，其中SR17降幅最大，下降了33.3%，F(xiàn)1降幅最小，僅降低了2.8%；在缺氮條件下，4個黑木相思基因型幼苗的Ci較CK均顯著升高（P＜0.05），而LS均顯著下降。在缺氮下，SR17的Fv/Fm顯著降低（P＜0.05），而對其他基因型無顯著影響；F1、SR3和SR17的Fv′/Fm′較CK均顯著降低，而對SR14號無顯著影響。

表1 缺氮對不同黑木相思基因型的氣體交換參數(shù)和熒光參數(shù)的影響?Table 1 Effects of nitrogen deficiency on gas exchange parameters and fluorescence parameters in different genotypes of A.melanoxylon

2.5 缺氮對不同黑木相思基因型幼苗氮素積累量和利用效率的影響

由圖4可知，全株氮素積累量和全株氮素利用效率受缺氮處理影響極顯著（P＜0.01），全株氮素積累量受基因型差異影響顯著（P＜0.05）。在缺氮下，4個黑木相思基因型幼苗的全株氮素積累量較CK均顯著降低，其中SR17降幅最大，降低了58.2%，F(xiàn)1降幅最小，降低了39.0%；缺氮下4個黑木相思基因型幼苗的全株氮素利用效率均呈上升趨勢，其中SR17增幅最大，增加了23.2%，而SR3增幅最小，僅增加了4.4%。由圖5可知，缺氮下，4個基因型黑木相思幼苗的根系氮素積累量占比均呈上升趨勢，其中F1、SR3和SR17分別顯著增加了53.8%、40%和87.9%。

圖4 缺氮對不同黑木相思基因型的氮素積累量和利用效率的影響Fig.4 Effects of nitrogen deficiency on nitrogen accumulation and utilization efficiency in different genotypes of A.melanoxylon

圖5 缺氮對不同黑木相思基因型的氮素積累量分配占比的影響Fig.5 Effects of nitrogen deficiency on the distribution of nitrogen accumulation in different genotypes of A.melanoxylon

2.6 缺氮對不同黑木相思基因型幼苗葉片抗氧化酶和MDA的影響

由圖6可知，SOD活性、POD活性和CAT活性受基因型差異影響極顯著（P＜0.01），SOD活性、POD活性、CAT活性和MDA含量受缺氮處理影響極顯著（P＜0.01），SOD活性、CAT活性和MDA含量受基因型差異進(jìn)和缺氮處理兩者交互作用影響極顯著（P＜0.01）。在缺氮下，4個黑木相思基因型幼苗葉片的SOD活性、POD活性、CAT活性和MDA含量均顯著升高（P＜0.05）。

圖6 缺氮對不同黑木相思基因型的抗氧化酶和MDA的影響Fig.6 Effects of nitrogen deficiency on antioxidant enzymes and MDA in different genotypes of A.melanoxylon

2.7 缺氮下不同基因型黑木相思幼苗的綜合評價

由表2可知，在缺氮條件下選出20個生長和生理生化指標(biāo)（苗高、地徑、地上部干質(zhì)量、地下干質(zhì)量、全株干質(zhì)量、葉綠素a含量、葉綠素b含量、類胡蘿卜素含量、葉綠素a+b含量、凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、Fv/Fm、Fv′/Fm′、MDA含量、SOD活性、POD活性、CAT活性、全株氮素積累量和全株氮素利用效率）作為耐低氮能力評價指標(biāo)，并對不同基因型耐低氮能力進(jìn)行分析，計算出各評價指標(biāo)的耐低氮系數(shù)，依據(jù)貢獻(xiàn)度≥75%的標(biāo)準(zhǔn)選取了2個主成分（綜合指標(biāo)）進(jìn)行分析。由表3可知，前2個綜合指標(biāo)解釋了55.18%和23.78%的貢獻(xiàn)度，總貢獻(xiàn)度達(dá)78.96%，第一個主成分解釋了地上干質(zhì)量、全株干質(zhì)量、葉綠素a含量、葉綠素a+b含量、類胡蘿卜素含量、凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、全株氮素積累量。第二個主成分解釋了胞間CO2濃度和全株NUE。由表4可知，通過結(jié)合隸屬函數(shù)算出各基因型的綜合評價值并進(jìn)行排名，評價值越大說明耐低氮能力越強(qiáng)，結(jié)果表明耐低氮能力從大到小依次是F1＞SR3＞SR14＞SR17，本研究發(fā)現(xiàn)F1耐低氮能力最強(qiáng)。

表2 缺氮下不同黑木相思基因型各指標(biāo)耐低氮系數(shù)?Table 2 Low-nitrogen tolerance coefficients of different A.melanoxylon genotypes under nitrogen deficiency

表3 缺氮下各綜合指標(biāo)的系數(shù)及貢獻(xiàn)度Table 3 Coefficient and contribution of each comprehensive index under nitrogen deficiency

表4 缺氮下各基因型耐低氮能力綜合評價Table 4 Comprehensive evaluation of low nitrogen tolerance of genotypes under nitrogen deficiency

3 討 論

氮素是植物不可或缺的營養(yǎng)元素，缺氮會對植物生長發(fā)育及生產(chǎn)力產(chǎn)生不利影響[25]，植物的生長指標(biāo)能夠直觀反映植物的生長狀況。本研究發(fā)現(xiàn)，缺氮條件對4個黑木相思基因型幼苗的苗高、地徑、地上部干質(zhì)量和全株干質(zhì)量產(chǎn)生了顯著的抑制作用，這是由于植物無法吸收足夠的氮素以滿足自身生長需求[18]。這與黃瓜[26]、檳榔[27]、構(gòu)樹[28]的缺氮處理試驗結(jié)論相一致。缺氮條件下，F(xiàn)1的根系干質(zhì)量呈上升趨勢，而其他基因型呈下降趨勢，同時F1基因型全株積累量在缺氮條件下降幅最小，這是由于F1基因型幼苗應(yīng)對缺氮脅迫會促進(jìn)根系生長以吸收更多的礦質(zhì)營養(yǎng)。研究表明，缺氮脅迫下植物會吸收的氮素更多分配到根系從而使得根冠比增加[29]，本試驗中缺氮條件下4個基因型幼苗的根冠比均顯著增加，根系中氮素積累量占全株比均較CK升高，這是植物應(yīng)對氮缺乏脅迫的一個適應(yīng)性策略，這與光皮樺[17]的研究結(jié)果相似。缺氮條件下，4個基因型的全株NUE均升高，說明低氮處理能夠提高植物的全株NUE，這在前人研究中也得到了證實[30]。

葉綠素是植物光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，其含量能夠反映植物光合能力的強(qiáng)弱[31]，葉綠素含量是判定植物光合作用器官是否在逆境脅迫下受到傷害的重要指標(biāo)[32]。Chla和Chlb在光能的吸收和傳遞發(fā)揮重要作用，Car除具備天線色素功能之外，還可以直接猝滅單線態(tài)氧，減少活性氧的產(chǎn)生，以減輕脅迫下植物所受的膜脂過氧化損傷[22]。研究發(fā)現(xiàn)在缺氮條件下，4個基因型的Chla、Chlb、Car和Chla+b的含量均顯著降低，一方面是由于缺氮條件下葉片氮含量下降，從而抑制了Chla、Chlb和Chla+b的合成；另一方面缺氮下葉片通過蛋白水解酶使得葉綠素分解為氨基酸、酰胺和NH4+以滿足其他生理活動[6]。光合參數(shù)能夠反映一個植物的生長潛力，Pn、Gs、Ci和LS能夠反映植物光合生理應(yīng)對脅迫的情況，是評價光合能力的重要指標(biāo)[33]。判斷Pn下降的主要原因是氣孔因素還是非氣孔因素要看Ci和LS，如果Ci降低而LS增大，才認(rèn)為是氣孔導(dǎo)度引起，即為氣孔因素，如果Ci增加而LS降低，則認(rèn)為是葉肉細(xì)胞羧化能力降低引起，即為非氣孔因素[34]。本試驗發(fā)現(xiàn)缺氮4個基因型幼苗的Pn和Gs均下降，Ci增加，LS降低，說明缺氮下Pn的下降是非氣孔因素，由羧化能力降低所致，其原因可能是由于葉綠素含量降低、光合相關(guān)酶活降低等[35]。葉綠素?zé)晒鈪?shù)是反映PSⅡ光化學(xué)效率的重要指標(biāo)[36]，對分析植物光能利用具有重要作用，植物正常生長情況下，F(xiàn)v/Fm的值一般在0.80～0.83范圍內(nèi)[37]，僅有SR17基因型幼苗在缺氮條件下Fv/Fm顯著降低，并低于0.8，而其他都在0.8以上，說明在缺氮條件下，SR17的黑木相思幼苗PSII中心受損程度較大，這可能是導(dǎo)致SR17的Pn降幅最大的主要原因，而其他基因型不受影響。Fv′/Fm′表明開放時PSⅡ中心原初光能捕獲效率，本研究中F1、SR3和SR17均顯著降低，說明其PSⅡ反應(yīng)中心開放程度下降，但SR14無顯著差異，這可能是由于SR14本身植物特性及試驗環(huán)境有關(guān)。

植物在受到脅迫時，細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生增加，過量的活性氧會使植物的膜脂發(fā)生過氧化[38]，植物會提高POD、CAT和SOD等抗氧化酶以保護(hù)細(xì)胞膜脂免受活性氧的傷害。本試驗發(fā)現(xiàn)在缺氮條件下4個基因型的POD、CAT和SOD活性均顯著提高，這是植物應(yīng)對氮缺乏的一種策略，這與前人在小麥[39]、玉米[40]和青楊[18]的研究結(jié)果相似。MDA是植物細(xì)胞膜過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物之一，其含量能夠反映細(xì)胞內(nèi)膜脂受損程度[41]。本試驗中在缺氮條件下4個基因型幼苗的MDA含量均顯著升高，盡管抗氧化酶活性維持在一個較高的水平，但在缺氮脅迫下細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧仍對植物膜脂造成損害。

植物在非生物脅迫下的適應(yīng)程度受多因素控制，不同評價指標(biāo)在不同基因型存在差異[42]。本研究采用主成分分析和結(jié)合隸屬函數(shù)分析各個指標(biāo)并采用耐受系數(shù)，第一可以消除無性系之間的固有差異，第二可以消除單一指標(biāo)異常變化對評價造成的影響，該方法在耐旱性[42]、耐熱性[44]、耐鹽性[45]等研究中被廣泛使用。本試驗參考前人研究[17,46-47]并結(jié)合指標(biāo)測定結(jié)果，選取了20個具有代表性的耐低氮指標(biāo)，苗高、地徑、地上部干質(zhì)量、地下干質(zhì)量、全株干質(zhì)量、Chla、Chlb、Car、Chla+b、凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、Fv/Fm、Fv′/Fm′、MDA含量、SOD活性、POD活性、CAT活性、全株氮素積累量和全株氮素利用效率。結(jié)果表明，4個無性系的耐低氮能力從大到小依次是F1＞SR3＞SR14＞SR17，F(xiàn)1的耐低氮能力最強(qiáng)，說明缺氮對F1的影響較小，耐脅迫能力強(qiáng)。

本研究沒有針對氮濃度做梯度試驗，只反映了在缺氮和全氮條件下不同黑木相思基因型的表現(xiàn)差異，且試驗是在人工模擬缺素環(huán)境下進(jìn)行的，是否在大田中有相同的結(jié)論等待進(jìn)一步驗證。后續(xù)將開展不同氮梯度下的試驗，并結(jié)合代謝組和基因組等手段挖掘耐低氮基因，為黑木相思高效培育提供理論參考。

4 結(jié) 論

缺氮脅迫下，4個黑木相思基因型幼苗的生長發(fā)育受到抑制，全株氮素積累量顯著降低，光合色素含量降低、光合作用受到抑制；缺氮會提高抗氧化相關(guān)酶，但過量的活性氧仍給膜脂帶來損害；不同基因型黑木相思對缺氮脅迫的響應(yīng)存在顯著差異，通過主成分分析并結(jié)合隸屬函數(shù)綜合評價可知，4個基因型的耐低氮能力由大到小依次為F1＞SR3＞SR14＞SR17。F1耐低氮能力最強(qiáng)，表現(xiàn)在脅迫對其影響較小，而SR17耐低氮能力最弱。