劉 能，何朝玖，陳 杰，高 杰，羅惠波，3，黃 丹，3，李子健*

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川自貢 643000；2.宜賓南溪酒業(yè)有限公司，四川宜賓 644000；3.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用重點實驗室，四川自貢 643000）

濃香型大曲為白酒釀造提供豐富的酶系、菌系和物系。大曲中曲霉、根霉、芽孢桿菌、乳酸桿菌、Wickerhamomyces和Saccharomycoposis等[1-2]微生物產(chǎn)生的糖化酶、液化酶和蛋白酶可以將淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)降解，并進一步將其轉(zhuǎn)化為醇類、酯類、酸類、吡嗪類等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，從而賦予白酒豐富的香氣[3]。制曲過程中微生物與微生物、微生物與環(huán)境相互作用，最終形成大曲微生物菌群，并參與白酒的后續(xù)釀造[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)大曲中細菌和真菌在酒醅中的比例分別為81.5 %和79.2 %[5]。大曲微生物的多樣性與含量對濃香型白酒的品質(zhì)形成至關(guān)重要[6]。

制曲過程中微生物的演替與環(huán)境因子包括溫度、酸度、濕度等密切相關(guān)[7]。Wu 等[8]發(fā)現(xiàn)大曲微生物群落中優(yōu)勢微生物beta 多樣性的變化與溫度顯著相關(guān)。在發(fā)酵過程中，環(huán)境過濾(即環(huán)境對某些微生物群落的定殖或存活具有適應(yīng)性)是一個重要的選擇過程[9]。乳酸菌和酵母菌可以在大曲發(fā)酵初期低溫條件下保持優(yōu)勢地位，可能是由于其生存對酸、醇和抗生素生產(chǎn)的優(yōu)勢以及對資源和生態(tài)位的競爭[10]。隨著發(fā)酵溫度的升高芽孢桿菌在發(fā)酵過程中比山球菌更具競爭力,分泌出淀粉酶和蛋白酶將淀粉和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖和氨基酸，促進風(fēng)味化合物前體的形成[11]。這是基于物種熱耐受特性的溫度驅(qū)動選擇，在形成微生物結(jié)構(gòu)和代謝方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[12]。環(huán)境因素對發(fā)酵微生物群的生長代謝和演替有著強烈的影響，目前許多研究表明微生物群落的生長代謝和演替發(fā)生的驅(qū)動因素為酸度、水分和溫度等[13]。

培菌期作為大曲主發(fā)酵期，是影響大曲質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，此時大曲微生物變化最為顯著。Zheng等[14]分析制曲過程中微生物多樣性演變與溫度、pH值、酸度、水分等環(huán)境因子的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)溫度、pH值與發(fā)酵中間階段微生物群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)正相關(guān)，水分與發(fā)酵結(jié)束階段微生物群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)正相關(guān)。有研究表明溫度因素通過調(diào)控大曲發(fā)酵前期微生物群落的演替規(guī)律而影響成品曲中微生物群落的組成[15-17]。制曲過程中溫度、濕度、水分等導(dǎo)致大曲微生物多樣性發(fā)生變化，代謝產(chǎn)生不同的物質(zhì)，可視為因環(huán)境因子脅迫而引起的微生物生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生變化、產(chǎn)生相應(yīng)的反應(yīng)和功能[18]。目前用高通量測序技術(shù)研究制曲過程中微生物演替取得了很多成果，Yang 等[19]通過擴增子測序發(fā)現(xiàn)濃香型大曲升溫發(fā)酵階段微生物數(shù)量最為豐富，主要由畢赤酵母屬、曲霉菌、根霉屬、片球菌屬和乳酸桿菌組成。高通量測序技術(shù)的廣泛使用克服了可培養(yǎng)研究微生物的局限性，但由于大多數(shù)只能提供微生物屬水平的信息，針對已報道的大曲優(yōu)勢微生物可利用可培養(yǎng)的方法對其增殖進行具體表征，有助于明確不同發(fā)酵環(huán)境條件下大曲發(fā)酵過程中微生物的生長代謝規(guī)律，為控制大曲制備工藝以及提高品質(zhì)提供重要理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

大曲樣品的采集：分別對濃香型大曲培菌期曲房4 個不同位置培菌期（第0 天、1 天、2 天、3 天、4天、5 天、6 天、7 天、8 天、9 天，不同位置大曲的采集時間略有差異）大曲進行采集，共計26 個樣品。樣品采集后，將大曲粉碎均勻，每份稱取約100 g 密封于無菌袋中-4 ℃保藏,用于菌落的計數(shù)；稱取20.00 g 存入密封無菌袋-80 ℃保藏，用于揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定。

試劑及耗材：PDA 瓊脂、YPD 瓊脂、氯霉素、PD瓊脂、無水乙醇、碳酸鈣、MRS 瓊脂、牛肉膏蛋白胨瓊脂、氯化鈉。

儀器設(shè)備：BXM-75VD 立式蒸汽壓力滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZHJHC1118C 超凈工作臺，上海智城分析儀器制造有限公司；BGZ-140 電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；JXBS-J001-TH-RS 高精度環(huán)境傳感器，威海精訊暢通電子科技有限公司；5975B-7890A 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技（中國）有限公司；50 μm/30 μmVB/CAR on PDMS萃取頭，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大曲水分含量及環(huán)境溫濕度測定

采用直接干燥法測定大曲樣品的水分含量[20]。利用在線環(huán)境檢測系統(tǒng)傳感器實時監(jiān)測大曲各采樣點的溫度、濕度。

1.2.2 大曲中主要微生物菌落總數(shù)的測定

采用稀釋平板計數(shù)法，酵母菌采用YPD 瓊脂培養(yǎng)基計數(shù)[21]；醋酸菌采用醋酸選擇培養(yǎng)基計數(shù)[22]；乳酸菌采用MRS 培養(yǎng)基計數(shù)[23]；霉菌采用PDA 培養(yǎng)基計數(shù)[24]；芽孢桿菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基計數(shù)[25]。

1.2.3 大曲揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

取3.00 g 大曲樣品于20 mL 的頂空瓶中，加入2.00 g氯化鈉，20 μL乙酸戊酯作為內(nèi)標物，50 ℃平衡5 min，插入50 μm/30 μmVB/CAR on PDMS 萃取頭，萃取50 min，解吸4 min[26]。

氣相色譜條件：毛細管色譜柱DB-WAX，規(guī)格為（30 m×320 μm×0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃，未分流模式；程序升溫：40 ℃保持3 min，5 ℃/min 到180 ℃，最后以2.5 ℃/min 的速度升到230 ℃，保持10 min，共計50 min；載氣：高純度氦氣，流速為1 mL/min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊電離(EI)離子源，電子能量70 eV，發(fā)射電流200 A，電壓350 V，離子源溫度200%，接口溫度250 ℃，掃描質(zhì)量范圍33～450 u，掃描范圍20～500 u。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel 2016對實驗數(shù)據(jù)進行整理和運算，同時采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析[27]。利用R 語言計算揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)間的Spearman 相關(guān)性系數(shù)，使用Cytoscape3.7.1 進行相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)可視化分析。采用皮爾遜相關(guān)分析(Pearson correlation)檢驗4 種不同發(fā)酵條件下大曲中酵母菌、醋酸菌、乳酸菌、霉菌和芽孢桿菌的數(shù)量變化與揮發(fā)性風(fēng)味成分合成之間的相關(guān)性。本實驗設(shè)定統(tǒng)計顯著性水平為P=0.05，極其顯著性水平設(shè)定為P=0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 培菌期環(huán)境溫濕度及大曲水分變化

曲房不同位置大曲培菌期發(fā)酵過程中環(huán)境溫濕度變化如圖1a 所示，發(fā)酵過程中溫度整體呈現(xiàn)先快速上升后緩慢上升的態(tài)勢，不同位置的大曲升溫速率具有一定的差異，第8 天或第9 天時分別到達了不同的頂溫，依次為60 ℃、60 ℃、55 ℃、55 ℃左右。生產(chǎn)過程中主要通過開關(guān)門窗調(diào)節(jié)溫濕度，隨著發(fā)酵的進行，培菌期結(jié)束時濕度下降至40 %左右。圖1b 為不同位置發(fā)酵過程中大曲水分含量的變化，大曲的含水量是逐漸下降的，由于發(fā)酵溫度的升高和微生物活性的增加會促進水分的蒸發(fā)[28]。但是曲房中不同位置大曲所處的發(fā)酵環(huán)境不同會影響大曲微生物的生長代謝對水分的利用和蒸發(fā)，同時不同的溫度對水分的蒸發(fā)也有具有一定的影響，所以不同位置大曲的水分含量具有一定的差異。培菌期結(jié)束時升溫速率較快、頂溫達到60 ℃左右的大曲中含水量最高，穩(wěn)定在28%左右；升溫速率較慢、頂溫為55 ℃左右大曲的水分含量比較低，穩(wěn)定在24 %左右。大曲水分的揮發(fā)主要靠霉菌菌絲的內(nèi)插而引出[29]，毛霉菌門和放線菌門是大曲中產(chǎn)生菌絲的主要微生物，熱放線菌的最佳生長溫度為50～55 ℃，緩慢的升溫速率和適宜的頂溫可能促進了熱放線菌的生長。熱放線菌的菌絲使大曲的結(jié)構(gòu)松弛，促進了大曲水分的蒸發(fā)[13]。

圖1 大曲發(fā)酵過程中環(huán)境溫濕度變化（a）和水分含量變化（b）

2.2 不同條件下培菌期大曲主要微生物的變化

培菌期不同發(fā)酵條件下大曲中酵母菌數(shù)量變化如圖2a 所示，酵母菌數(shù)量變化均為先上升后下降，最終穩(wěn)定在一個較低的水平，其峰值都出現(xiàn)在第1 天；醋酸菌數(shù)量變化如圖2b 所示，大曲中的醋酸菌數(shù)量均為先上升后下降，處于升溫速率較慢、降濕速率較快發(fā)酵條件下的大曲中醋酸菌的繁殖速度和達到的峰值高于處于升溫速率較快、降濕速率較慢發(fā)酵條件下的大曲中的醋酸菌；乳酸菌在不同發(fā)酵條件下的數(shù)量變化如圖2c 所示，乳酸菌數(shù)量變化趨勢跟醋酸菌十分相似，均為上升后下降，最終趨于消失；霉菌數(shù)量的變化如圖2d 所示：不同發(fā)酵條件下霉菌的數(shù)量整體上呈現(xiàn)上升的趨勢，期間出現(xiàn)不斷的波動，峰值是非常接近的；芽孢桿菌數(shù)量變化如圖2e 所示，不同發(fā)酵條件下芽孢桿菌的數(shù)量整體呈現(xiàn)先上升后下降，其中處于升溫速率較慢、降濕速率較快發(fā)酵條件下大曲中的芽孢桿菌數(shù)量處于不斷的波動當(dāng)中。

圖2 不同條件下培菌期大曲主要微生物的變化

2.3 理化因子對大曲主要微生物的影響

采用基于Spearman 系數(shù)的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖分析大曲中主要微生物與理化因子的相關(guān)性。結(jié)果如圖3 所示，酵母菌與濕度、水分呈正相關(guān)（p＜0.05）；醋酸菌與溫度呈負相關(guān)（p＜0.05），與濕度呈正相關(guān)（p＜0.05）；乳酸菌與溫度呈負相關(guān)（p＜0.05），與濕度和水分呈正相關(guān)（p＜0.05）；霉菌與溫度呈正相關(guān)（p＜0.05），與濕度呈負相關(guān)（p＜0.05）；芽孢桿菌與溫度、濕度和水分沒有呈現(xiàn)出顯著的相關(guān)性（P＞0.05）。

圖3 大曲中主要微生物與理化因子的網(wǎng)絡(luò)分析（r＞0.6，p＜0.05）

2.4 培菌期大曲揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的合成規(guī)律

風(fēng)味Heatmap 圖可以直觀的反應(yīng)培菌期不同發(fā)酵條件下大曲發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化和差異，如圖4 所示，對處于不同發(fā)酵條件下的大曲揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行了聚類分析，大曲微生物合成的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要有醇類、酸類、醛類以及酯類物質(zhì)，主要包括乙醇、乙酸、苯甲醛以及乙酸乙酯、棕櫚酸乙酯，有的還產(chǎn)生少量的呋喃類、吡嗪類物質(zhì)等。不同發(fā)酵條件下大曲中醇類物質(zhì)的變化較為相似，隨著發(fā)酵時間的延長醇類物質(zhì)含量多為先增加后減少，達到峰值的時間略有差異；大曲升溫速率、降濕速率以及水分含量差異會導(dǎo)致酸類物質(zhì)不同的變化規(guī)律；醛類物質(zhì)含量較低，變化較為一致；酯類物質(zhì)作為白酒中主要的呈香呈味物質(zhì)，種類相較于醇類和酸類物質(zhì)更為豐富，隨著發(fā)酵時間的延長，酯類物質(zhì)的種類逐漸增多，不同發(fā)酵條件下大曲中所含酯類物質(zhì)變化是不同的。

圖4 大曲揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)熱圖

2.5 培菌期大曲發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為了研究揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之間的伴隨關(guān)系，構(gòu)建了大曲揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果如圖5所示，該網(wǎng)絡(luò)共存在26 個節(jié)點，79 條邊，模塊化為0.686，其中正相關(guān)占100%，負相關(guān)占0%，說明風(fēng)味物質(zhì)之間幾乎是以協(xié)同的方式相互作用。網(wǎng)絡(luò)中的模塊是指內(nèi)部緊密連接，但與外部連接較少的節(jié)點集合，所以它們之間的相關(guān)性更強。基于模塊劃分和模塊計算，整個網(wǎng)絡(luò)被分為5 個模塊，模塊0、模塊1 和模塊2 是三個最大的模塊，分別占比24.14 %、31.03 %和27.59 %。模塊0 中包括7 個節(jié)點，有1 種醇類、3 種醛類、2 種酯類、1 種呋喃類；模塊1 中包括9 個節(jié)點，有8 種酯類、1 種醇類；模塊2中包括8 個節(jié)點，有3 種醇類、5 種酯類。酯類和醇類幾乎全部占據(jù)了模塊中的節(jié)點，模塊中的大部分高級醇能為白酒提供特殊風(fēng)味，酯類物質(zhì)能賦予了白酒重要的主體風(fēng)味，它們之間呈顯著的正相關(guān)，在模塊內(nèi)緊密相連，說明這些物質(zhì)在合成上可能具有重要的伴隨關(guān)系。為進一步研究共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的作用及貢獻，計算了網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的拓撲性質(zhì)。介數(shù)中心性最高的節(jié)點為關(guān)鍵節(jié)點[30]。異丁醇、棕櫚酸乙酯、乙酸乙酯、油酸乙酯、十四烷酸乙酯和乙酸丁酯被定義為關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。它們對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相互作用的傳遞及網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性起重要作用[31]，對揮發(fā)性風(fēng)味網(wǎng)絡(luò)中的信息流影響程度最大。

圖5 大曲揮發(fā)性風(fēng)味共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)（r＞0.6，p＜0.05）

2.6 大曲主要微生物變化與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)合成的相關(guān)性

利用Pearson 相關(guān)系數(shù)對濃香型大曲控制發(fā)酵過程中培菌期主要微生物變化及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)合成進行相關(guān)性分析，Pearson 相關(guān)性分析表明（表1），處于升溫速率較慢、濕度下降速率較快、水分含量較低發(fā)酵條件下的大曲霉菌與醇類物質(zhì)的合成具有極其顯著的正相關(guān)性；處于升溫速率較快，降濕速率較慢且含水量較高發(fā)酵條件下的大曲霉菌與酸類物質(zhì)的合成具有顯著的相關(guān)性；在升溫速率較快、降濕速率快且含水量較低發(fā)酵條件下的大曲霉菌與酸類物質(zhì)的合成具有極其顯著的相關(guān)性；在升溫速率較快、降濕速率較慢水分含量較高和升溫速率較快、降濕速率較快水分含量較低發(fā)酵條件下的大曲霉菌與醛類物質(zhì)的合成具有顯著的負相關(guān)性；大曲中的酵母菌、醋酸菌和乳酸菌在升溫速率較快、濕度下降速率較慢水分含量較高的發(fā)酵環(huán)境條件下與酯類物質(zhì)的合成具有顯著的正相關(guān)性；處于升溫速率較快、降濕速率較快水分含量較低發(fā)酵條件下的大曲霉菌與酯類物質(zhì)的合成具有顯著的正相關(guān)性；其余微生物數(shù)量變化與大曲中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的合成均無顯著的相關(guān)性。

表1 濃香型大曲主要微生物與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)合成的Pearson相關(guān)性分析

3 結(jié)論

本研究以濃香型大曲為原料，利用可培養(yǎng)的方法對濃香型大曲培菌期發(fā)酵過程中的主要微生物菌落進行計數(shù)，研究結(jié)果表明：酵母菌、醋酸菌、乳酸菌的數(shù)量隨著發(fā)酵時間的延長均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在培菌期后期只有少量存活；霉菌以及芽孢桿菌數(shù)量隨著發(fā)酵時間的延長出現(xiàn)較大幅度的波動，但在培菌期后期仍有大量菌體存活?；赟pearman 相關(guān)性系數(shù)分析了濃香型大曲培菌期大曲主要微生物與理化因子的相關(guān)性，研究結(jié)果表明：酵母菌與濕度、水分呈正相關(guān)（p＜0.05）；醋酸菌與溫度呈負相關(guān)（p＜0.05），與濕度呈正相關(guān)（p＜0.05）；乳酸菌與溫度呈負相關(guān)（p＜0.05），與濕度和水分呈正相關(guān)（p＜0.05）；霉菌與溫度呈正相關(guān)（p＜0.05），與濕度呈負相關(guān)（p＜0.05）；芽孢桿菌與溫度、濕度和水分沒有呈現(xiàn)出顯著的相關(guān)性（P＞0.05）。培菌期大曲揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要以醇類、酸類、酯類物質(zhì)為主，同時還產(chǎn)生呋喃類、吡嗪類、酮類以及醛類物質(zhì)，不同的升溫速率、降濕速率以及水分含量會影響各類物質(zhì)的變化規(guī)律；揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之間幾乎是以協(xié)同的方式相互作用，具有一定的伴隨關(guān)系。霉菌與酸類物質(zhì)以及酯類物質(zhì)的合成具有顯著的正相關(guān)性，與醛類物質(zhì)的合成具有顯著的負相關(guān)性；酵母菌、醋酸菌和乳酸菌與酯類物質(zhì)的合成具有顯著的正相關(guān)性。