侯立婷, 于曉明, 杜露平, 張元鵬, 程海衛(wèi), 陳 瑾, 鄭其升, 侯繼波

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫工程研究所,江蘇 南京 210014;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京 210014;3.獸用生物制品<泰州>國泰技術(shù)創(chuàng)新中心,江蘇 泰州 225300;4.省部共建國家重點實驗室培育基地——江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室,江蘇 南京 210014)

有研究結(jié)果表明,免疫增強劑CVC1302能夠顯著提高O型口蹄疫滅活疫苗的免疫效力[1]。一些病原相關(guān)分子模式受體激動劑及細(xì)胞因子可作為免疫增強劑的首選來調(diào)節(jié)機體反應(yīng),對先天免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)具有重要的影響[2-3]。有研究結(jié)果證實,CVC1302能夠引起機體產(chǎn)生長效體液免疫反應(yīng),并且在注射部位通過誘導(dǎo)高水平的趨化因子來招募抗原遞呈細(xì)胞[4]。

樹突狀細(xì)胞(Dentritic cells,DC)不僅能攝取、加工處理和遞呈抗原,還能釋放多種細(xì)胞因子,有效激活T淋巴細(xì)胞,具有啟動免疫反應(yīng)和誘導(dǎo)免疫耐受的雙向免疫調(diào)節(jié)作用[5-6]。DC具有未成熟DC和成熟DC 2種形式,未成熟的DC對抗原的內(nèi)吞、加工處理能力較強;成熟的DC具有較強的抗原遞呈能力[7]。近年來,國內(nèi)外研究者利用GM-CSF、IL-4、Flt3等細(xì)胞因子成功誘導(dǎo)分化小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞[8-9]。骨髓源DC的體外誘導(dǎo)技術(shù)相對成熟,在免疫增強劑的篩選、抗原遞呈及免疫激活相關(guān)領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用。

CVC1302誘導(dǎo)機體產(chǎn)生長效體液免疫反應(yīng)與抗原遞呈細(xì)胞的招募有關(guān),但在體外該增強劑是否同樣具有活化T淋巴細(xì)胞的能力呢?本研究擬利用重組鼠源粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Recombinant mouse granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,rm GM-CSF)誘導(dǎo)分化出骨髓源DC,以骨髓源DC為模型,在體外評價免疫增強劑CVC1302對DC激活、抗原的遞呈及T淋巴細(xì)胞活化的作用,進(jìn)一步分析機體產(chǎn)生長效體液免疫反應(yīng)與DC有效激活的相關(guān)性,以期為免疫增強劑的篩選提供有效方法,為免疫增強劑的免疫效力評價奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

8周齡的健康雌性C57BL/6小鼠購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心;RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司;紅細(xì)胞裂解液購自白鯊生物科技有限公司;rm GM-CSF購自Peprotech公司;流式抗體Anti-mouse CD11b PerCP-Cyanine5.5、Anti-mouse CD11c FITC、Anti-mouse MHCⅠAPC、Anti-mouse CD80 APC、Anti-mouse CD40 APC、Anti-mouse MHCⅡAPC、Anti-mouse CD86 APC、Anti-mouse CD3 FITC 購自BD Biosciences公司;雞卵清白蛋白(OVA)、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的雞卵清白蛋白(FITC-OVA)購自北京索萊寶科技有限公司;小鼠干擾素γ(IFN-γ)檢測試劑盒購自南京奧青生物技術(shù)有限公司;免疫增強劑CVC1302由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫工程研究所動物疫苗免疫技術(shù)創(chuàng)新團隊提供。

1.2 C57BL/6小鼠骨髓源DC的分離誘導(dǎo)及鑒定

取C57BL/6小鼠斷頸處死,置于75%乙醇內(nèi)浸泡5 min,摘取小鼠的股骨、脛骨,剪去骨頭兩端,用5 ml注射器吸取5 ml磷酸鹽緩沖液(PBS),接著將5 ml注射器插入骨髓腔進(jìn)行反復(fù)沖洗直至骨變白。將骨髓反復(fù)吹吸直至細(xì)胞完全分散,將其過無菌200目濾網(wǎng)后移至15 ml離心管中,1 500 r/min、5 min,取細(xì)胞,加到紅細(xì)胞裂解液中,輕輕混勻,室溫下作用5 min,離心,棄上清液,加入5 ml RPMI-1640培養(yǎng)基清洗1次沉淀,離心收集細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。細(xì)胞密度調(diào)整為1 ml 3×105個,置于6孔板中,1個孔4 ml,加入質(zhì)量濃度為10 ng/ml的rm GM-CSF進(jìn)行培養(yǎng),第3 d置換培養(yǎng)基,每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),培養(yǎng)至第7 d時,收獲半懸浮及疏松貼壁細(xì)胞,用抗鼠CD11c-FITC、CD11b-PE-cy5.5染色后經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定DC的純度。

1.3 DC表面分子MHC I、MHC II、CD40、CD80、CD86的表達(dá)

用RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整未成熟骨髓源DC的細(xì)胞密度為1 ml 1×106個,接種于6孔板中,加入CVC1302進(jìn)行刺激。同時設(shè)置PBS對照組,于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后,收集細(xì)胞,分別加入CD11c-FITC、APC-MHCⅠ、APC-MHCⅡ、APC-CD40、APC-CD80、APC-CD86抗體,置于4 ℃條件下,避光溫育30 min后,上機檢測并分析結(jié)果。

1.4 DC對雞卵清白蛋白抗原遞呈能力的檢測

用RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整未成熟骨髓源DC的細(xì)胞密度為1 ml 5×105個,接種于6孔板中(裝有細(xì)胞爬片),培養(yǎng)至第7 d,挑取爬片置于24孔板,用預(yù)冷的PBS清洗2遍,加入RPMI-1640培養(yǎng)基,每孔加入1 ml含CVC1302+OVA-FITC或OVA-FITC的預(yù)熱RPMI-1640培養(yǎng)基。孵育60 min后,用預(yù)冷的PBS清洗2遍,加入80%丙酮固定10 min,用預(yù)冷的PBS清洗2遍,封片,觀察。

1.5 CVC1302對T淋巴細(xì)胞的活化

無菌條件下采集小鼠脾臟,分離T淋巴細(xì)胞,用RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞密度約為1 ml 4×106個。取分離誘導(dǎo)第7 d的DC,調(diào)整細(xì)胞密度為1 ml 1×106個,接種于6孔板中,每孔加入1 ml含CVC1302+OVA或OVA的預(yù)熱RPMI-1640培養(yǎng)基,孵育16 h后收集細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1 ml 1×106個。分別取100 μl脾臟淋巴細(xì)胞和DC置于96孔板共培養(yǎng)3 d后半數(shù)換液,同時在培養(yǎng)基中添加佛波醇酯類多克隆刺激劑(PMA)和離子霉素,終質(zhì)量濃度分別為50.0 ng/ml和0.5 μg/ml,培養(yǎng)18 h后分別收集細(xì)胞和上清液,細(xì)胞中加入CD3-FITC抗體,置于4 ℃條件下,避光孵育30 min,細(xì)胞清洗3遍后,用流式細(xì)胞儀檢測并分析結(jié)果。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒檢測上清液中IFN-γ的分泌水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 C57BL/6小鼠骨髓源DC形態(tài)及鑒定

每只C57BL/6小鼠中分離到的骨髓細(xì)胞有1 ml 2×107～5×107個,添加rm GM-CSF進(jìn)行誘導(dǎo)分化。在誘導(dǎo)的當(dāng)天與誘導(dǎo)第3 d、第7 d利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),結(jié)果(圖1)表明,誘導(dǎo)當(dāng)天,細(xì)胞呈現(xiàn)規(guī)則形態(tài),體積較小,圓形,懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)基中(圖1A);誘導(dǎo)第3 d時,細(xì)胞呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài),可觀察到明顯的細(xì)胞聚集,集落較小,聚集成團生長的細(xì)胞數(shù)量明顯增多(圖1B);誘導(dǎo)第7 d時,細(xì)胞團體積增大,形態(tài)不規(guī)則,有毛刺狀突起,形成明顯的集落細(xì)胞團(圖1C)。收集誘導(dǎo)第7 d的DC,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測分析,分離誘導(dǎo)的細(xì)胞為樹突狀細(xì)胞,并且cDC1(CD11c+CD11b-)的比例為21.3%,cDC2(CD11c+CD11b+)的比例為48.4%(圖1D),二者占淋巴細(xì)胞的比例具有極顯著差異(P<0.001)(圖1E)。

A:重組鼠源粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rm GM-CSF)誘導(dǎo)當(dāng)天的細(xì)胞形態(tài)(×200);B:rm GM-CSF誘導(dǎo)第3 d時的細(xì)胞形態(tài)(×200);C:rm GM-CSF誘導(dǎo)第7 d時的細(xì)胞形態(tài)(×200);D:樹突狀細(xì)胞的流式分析結(jié)果;E:不同亞型DC的對比分析圖。DC:樹突狀細(xì)胞。**:不同亞型樹突狀細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例差異極顯著(P<0.01)。Q1～Q4表示象限。

2.2 DC表面分子鑒定

成熟的DC表面高表達(dá)MHCⅠ、MHCⅡ及共刺激分子CD40、CD80、CD86,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測CVC1302對DC表面分子MHCⅠ、MHCⅡ、CD40、CD80、CD86的表達(dá)情況。本研究設(shè)置添加CVC1302的試驗組和PBS對照組。圖2顯示,在CVC1302試驗組中,CD11c+MHCⅠ+的占比為66.50%,CD11c+MHCⅡ+的占比為65.10%,CD11c+CD40+的占比為20.20%,CD11c+CD80+的占比為55.90%,CD11c+CD86+的占比為41.00%,其表面分子的表達(dá)水平都顯著或極顯著高于PBS對照組。試驗結(jié)果表明CVC1302能夠上調(diào)小鼠骨髓源DC表面分子的表達(dá),刺激DC的成熟。

2.3 DC對OVA抗原遞呈能力的檢測

DC是專職的抗原遞呈細(xì)胞,能夠激發(fā)免疫應(yīng)答。利用超高分辨率顯微鏡檢測CVC1302對DC遞呈OVA抗原的影響,對熒光的數(shù)量和強度進(jìn)行分析,結(jié)果(圖3)表明,CVC1302-OVA組的熒光強度高于OVA對照組,說明CVC1302能夠促進(jìn)DC對OVA抗原的遞呈,調(diào)節(jié)機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

A:OVA對照組;B:CVC1302-OVA組。

2.4 T淋巴細(xì)胞活化檢測

T淋巴細(xì)胞增殖分化為效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞,進(jìn)而促進(jìn)機體免疫反應(yīng),IFN-γ的分泌是T淋巴細(xì)胞活化的標(biāo)志之一。分別利用流式細(xì)胞術(shù)和ELISA方法,檢測T淋巴細(xì)胞的活化數(shù)量及IFN-γ分泌水平。圖4顯示,將刺激成熟的DC與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后,CVC1302-OVA組的T淋巴細(xì)胞的活化數(shù)量為1 ml (3.84±0.24)×105個,IFN-γ分泌含量為(181.400±8.165) pg/ml,OVA組的T淋巴細(xì)胞的活化數(shù)量為1 ml (1.91±0.19)×105個,IFN-γ分泌含量為(46.780±1.136) pg/ml,CVC1302-OVA組的T淋巴細(xì)胞活化數(shù)量及IFN-γ分泌含量均極顯著高于OVA組(P<0.01),表明CVC1302能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化。

A:T淋巴細(xì)胞的活化數(shù)量;B:IFN-γ的分泌水平。**:不同處理間差異極顯著(P<0.01)。OVA:雞卵清白蛋白。

3 討論

DC作為機體免疫應(yīng)答的啟動者,對機體的免疫防御具有重要作用[10]。近年來,隨著眾多學(xué)者對DC研究的深入,發(fā)現(xiàn)其在抗腫瘤、過敏性免疫反應(yīng)、疫苗佐劑及免疫增強劑研究等方面都具有重要的作用[11-12]。經(jīng)典的DC分為cDC1和cDC2 2個亞群,cDC1和cDC2對于T淋巴細(xì)胞的激活至關(guān)重要[13-15]。有研究結(jié)果表明,利用Flt3、GM-CSF和IL-4能夠誘導(dǎo)分化小鼠骨髓源DC,并且無論是成熟還是未成熟的DC,CD11c的表達(dá)均為陽性[16]。本研究經(jīng)過摸索,通過體外分離小鼠骨髓源細(xì)胞,利用rm GM-CSF刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞具有典型的DC形態(tài)特征,與韋莉等[17]研究結(jié)果一致。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明,培養(yǎng)的細(xì)胞為DC,并且cDC1和cDC2亞群都占有一定的比例,這為后續(xù)研究體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)機理提供了體外模型。

免疫增強劑的研發(fā)是快速提高疫苗免疫效力的有效手段之一。近幾年,筆者所在實驗室系統(tǒng)闡明了免疫增強劑CVC1302介導(dǎo)長效體液免疫應(yīng)答的機理,證明CVC1302是一種安全、有效的免疫增強劑[18-19]。經(jīng)CVC1302刺激后,成熟的DC高表達(dá)MHCⅠ、MHCⅡ及共刺激分子CD40、CD80、CD86。DC表面分子表達(dá)水平的顯著提升能更加有效地觸發(fā)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的激活,在共刺激信號的作用下增殖、分化,分泌更多抗病原體細(xì)胞因子(IFN-γ和TNF-α),從而更加有效地提升機體抵抗病原體的能力,并且T淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ有利于進(jìn)一步介導(dǎo)抗原的遞呈過程[20-21]。本研究結(jié)果證實了免疫增強劑CVC1302對DC表面分子表達(dá)水平有明顯提升作用,添加CVC1302后,DC對OVA抗原的遞呈也增多,并且CVC1302激活后的DC能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化。本研究結(jié)果表明,免疫增強劑CVC1302在體外同樣具有促進(jìn)T淋巴細(xì)胞活化的功能,這與前期體內(nèi)的研究結(jié)果[18]相一致。

綜上所述,本研究成功建立了C57BL/6小鼠骨髓源DC的穩(wěn)定培養(yǎng)方法,并對其表型進(jìn)行有效的鑒定;體外試驗結(jié)果證實了免疫增強劑CVC1302能夠促進(jìn)DC的活化,進(jìn)一步有效活化T淋巴細(xì)胞。本研究結(jié)果為后續(xù)新型免疫增強劑的篩選及評價提供了參考。