徐引弟, 蔡旭旺, 徐曉娟, 王治方, 張家慶, 朱文豪, 雷亞楠, 張立憲, 李海利, 焦文強(qiáng), 王克領(lǐng)

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,河南 鄭州 450002;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430070)

引起豬格拉瑟病(Glasser s disease)的副豬嗜血桿菌(HPS)是臨床上危害豬群健康最嚴(yán)重的細(xì)菌性病原之一。格拉瑟病以豬嚴(yán)重上呼吸道感染、多發(fā)性纖維素性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎為特征,給全球及中國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-4]。副豬嗜血桿菌血清型有15種,其中血清1型、血清5型、血清10型、血清12型、血清13型、血清14型被認(rèn)為是高毒力的血清型,血清2型、血清4型、血清15型為中等毒性,血清3型、血清6型、血清7型、血清8型、血清9型、血清11型被認(rèn)為是無(wú)毒的[5-7]。但血清7型是近年來(lái)臨床典型發(fā)病病例中分離比例越來(lái)越高的血清型,也是危害越來(lái)越嚴(yán)重的血清型[8-10]。

crp基因編碼cAMP受體蛋白(cAMP receptor protein,CRP),全長(zhǎng)675 bp核苷酸,編碼225個(gè)氨基酸,是大腸桿菌中7個(gè)系統(tǒng)調(diào)控因子之一[11-14]。CRP調(diào)控490多個(gè)基因的表達(dá),在細(xì)菌感染過(guò)程中,系統(tǒng)調(diào)控因子在細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境變化方面起著至關(guān)重要的作用。CRP可以提高大腸桿菌在各種壓力條件下的適應(yīng)性能,CRP蛋白調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá),與多種毒力因子的表達(dá)有關(guān)。由于crp基因與毒力密切相關(guān),常被選為研制減毒疫苗的靶點(diǎn)[14-16]。

crp基因在副豬嗜血桿菌中的功能報(bào)道較少,Jiang等[17-18]的研究結(jié)果顯示,crp基因參與血清5型HPS的生長(zhǎng)、生物膜形成、應(yīng)激耐受、抗血清活性提高和鐵利用。進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),crp基因缺失后HPS毒力顯著降低。由于血清7型在臨床上分離比例越來(lái)越高,而目前還沒(méi)有針對(duì)血清7型的疫苗。因此本研究構(gòu)建副豬嗜血桿菌血清7型crp缺失株,對(duì)缺失株的生長(zhǎng)、抗性及毒力進(jìn)行初步研究,為進(jìn)一步研究crp基因在HPS中的功能以及篩選更加安全有效的HPS疫苗候選株提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

副豬嗜血桿菌血清7型臨床分離株HPS7由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存[8-10]。自殺性質(zhì)粒pK18mobsacB、副豬嗜血桿菌-大腸桿菌穿梭載體pSHK3-Kan由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)徐曉娟、蔡旭旺副教授饋贈(zèng)。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank報(bào)道的副豬嗜血桿菌血清7型vHPS7株全基因組(CP049089)序列,設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)及USS序列 (DNA攝取信號(hào)序列)的引物crpuF/crpuR、crpdF/crpdR,用于擴(kuò)增crp上下游同源臂,crpF/crpR用于擴(kuò)增crp基因,去掉酶切位點(diǎn)和USS序列的crpuuF/crpddR用于鑒定crp親本株與缺失株,參考質(zhì)粒pSHK3-Kan序列設(shè)計(jì)KanF/KanR用于擴(kuò)增卡那霉素基因(Kan)。構(gòu)建及鑒定副豬嗜血桿菌crp基因缺失株的引物見(jiàn)表1,引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 用于構(gòu)建和鑒定crp缺失株的引物

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

雌性豚鼠購(gòu)自華興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng),6～8周齡,體質(zhì)量200～250 g。

1.4 crp基因序列同源性分析

使用MEGA 6軟件,分析副豬嗜血桿菌crp基因序列與同一種屬中其他菌株crp基因序列之間的同源性。在TSA[胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基,含5%的胎牛血清,0.01%的NAD(輔酶Ⅰ)]上復(fù)蘇本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存的副豬嗜血桿菌臨床株和標(biāo)準(zhǔn)株,提取基因組,用引物crpF/crpR擴(kuò)增crp基因,測(cè)序。

1.5 crp缺失株的構(gòu)建與鑒定

將副豬嗜血桿菌血清7型菌株HPS7復(fù)蘇,挑取單菌落于5 ml TSB(胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基,含5%的胎牛血清,0.01%的NAD)中,37 ℃培養(yǎng)12 h,離心去上清液重懸菌體,提取基因組,分別用引物crpuF/crpuR和crpdF/crpdR擴(kuò)增crp基因上、下游片段,用引物KanF/KanR從pSHK3質(zhì)粒中擴(kuò)增909 bp卡那霉素基因。利用PCR擴(kuò)增原理,用引物crpuF/crpdR將這3個(gè)片段通過(guò)PCR重疊延伸連接在一起,形成重疊片段UKD。使用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切UKD片段,連接到自殺性質(zhì)粒pK18mobsacB,陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pKUKD。參考文獻(xiàn)[17]報(bào)道的自然轉(zhuǎn)化法,大量提取重組質(zhì)粒pKUKD,測(cè)定A260值。挑取HPS7單菌落于5 ml TSB中,37 ℃培養(yǎng)至OD600值為0.8,取20 μl菌液加入20 μl 8 mmol/L cAMP (環(huán)腺苷酸),混勻,反應(yīng)10 min,加入2 μg重組質(zhì)粒pKUKD,混勻,反應(yīng)10 min后加入到TSA固體培養(yǎng)基上,涂布均勻,37 ℃孵育5 h。用TSB洗滌菌體,轉(zhuǎn)移到含Kan的TSA上,37 ℃培養(yǎng)24～48 h。挑取轉(zhuǎn)化子,提取基因組,用引物crpuuF/crpddR、crpF/crpR、KanF/KanR擴(kuò)增UKD序列、crp基因和Kan,電泳檢測(cè)目的片段的大小及有無(wú)來(lái)鑒定是否成功構(gòu)建crp缺失株,并測(cè)序驗(yàn)證。

1.6 crp缺失株的生長(zhǎng)曲線

HPS7及其crp缺失株△crp在TSB中37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜,用TSB將HPS7、△crp的OD600值調(diào)整為0.8。按1∶1 000的接種比例將HPS7、△crp接種至新的錐形瓶中,在氣浴恒溫振蕩器中37 ℃、180 r/min培養(yǎng)。每隔2 h取樣100 μl,加入到900 μl稀釋液中10倍稀釋,取樣至48 h,根據(jù)菌液OD600值和預(yù)試驗(yàn)取3個(gè)適宜稀釋度,取100 μl在平板上涂勻,各3個(gè)重復(fù),置于37 ℃培養(yǎng)36 h,統(tǒng)計(jì)菌落數(shù),取平均值,繪制出crp缺失株△crp的生長(zhǎng)曲線。

1.7 crp缺失株的自凝特性試驗(yàn)

HPS7及其crp缺失株△crp在2 ml TSB中培養(yǎng)過(guò)夜,測(cè)定OD600,用TSB調(diào)節(jié)OD600值為0.8,37 ℃靜置培養(yǎng),分別在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、36 h、48 h和60 h時(shí),從培養(yǎng)液頂部取200 μl,測(cè)定OD600。

1.8 生物膜的形成能力試驗(yàn)

將HPS7及其crp缺失株△crp培養(yǎng)過(guò)夜,OD600值調(diào)整為0.8。96孔微孔板中每孔中加入90 μl培養(yǎng)液,加入10 μl 菌液,37 ℃孵育60 h,吸去菌液,用200 μl無(wú)菌PBS(磷酸緩沖液)洗3次,100 μl甲醇固定15 min,風(fēng)干后,加入100 μl 1%結(jié)晶紫染色10 min,清洗、干燥,待完全干燥后,加入100 μl的33%乙酸溶液溶解,用酶標(biāo)儀測(cè)量OD630值。3個(gè)重復(fù),取平均值。用未接種菌液的作為空白對(duì)照。

1.9 抗生素抗性試驗(yàn)

采用Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法(K-B法)進(jìn)行抗生素抗性試驗(yàn),將過(guò)夜培養(yǎng)的HPS7及其crp缺失株△crp,用滅菌PBS調(diào)整為適宜濃度,將菌液均勻涂抹于TSA上,選取24種臨床上常用的藥敏片(包括頭孢噻呋、頭孢他啶、氨芐西林、替米考星、阿莫西林、青霉素G、阿米卡星、氟苯尼考、慶大霉素、頭孢噻肟、痢特靈、鏈霉素、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、土霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、左氟沙星、復(fù)方新諾明、阿奇霉素、紅霉素、羅紅霉素),將藥敏片均勻貼于涂有菌液的平板上,37 ℃培養(yǎng)36 h,測(cè)量藥敏片抑菌圈直徑。

1.10 豚鼠感染試驗(yàn)

選取體質(zhì)量為250 g左右的清潔級(jí)豚鼠45只,隨機(jī)分成9組(HPS7、△crp菌株各4組,空白對(duì)照1組),每組5只。將HPS7和△crp接種到TSA固體培養(yǎng)基上,過(guò)夜培養(yǎng),用無(wú)菌生理鹽水洗滌,反復(fù)吹打,OD600值調(diào)整為2.0,10倍稀釋成4個(gè)滴度梯度,每個(gè)滴度腹腔注射5只豚鼠,每只豚鼠注射1 ml,對(duì)照組注射生理鹽水,同時(shí)原液10倍稀釋,進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。觀察豚鼠發(fā)病和死亡情況,連續(xù)觀察14 d,死亡豚鼠取臟器組織抹片觀察,接種到TSA培養(yǎng)基。肝臟、肺臟用多聚甲醛固定后送武漢賽維爾生物科技有限公司進(jìn)行病理切片。

2 結(jié)果與分析

2.1 crp基因序列同源性比對(duì)

PCR擴(kuò)增副豬嗜血桿菌各血清型臨床分離株和15個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株的crp基因,結(jié)果crp基因在副豬嗜血桿菌的臨床分離株和標(biāo)準(zhǔn)株中均能擴(kuò)增出(圖1),測(cè)序比對(duì),在不同副豬嗜血桿菌血清型和標(biāo)準(zhǔn)株之間crp基因高度同源,同源性均在95%以上。表明crp基因在副豬嗜血桿菌中是保守的基因。

M:DL2000 marker;1～15:HPS血清1～15型標(biāo)準(zhǔn)株;16～22:HPS臨床分離株血清2型、4型、5型、6型、7型、9型、13型;23:陰性對(duì)照;24:空白對(duì)照。

2.2 crp缺失株的構(gòu)建與驗(yàn)證

如圖2 所示,使用引物crpuuF/crpddR鑒定UKD,缺失株片段長(zhǎng)2 337 bp,親本株片段長(zhǎng)2 103 bp。使用引物crpF/crpR鑒定crp基因,缺失株不能擴(kuò)增到675 bp的crp基因片段,親本株能擴(kuò)增到。使用引物KanF/KanR鑒定Kan基因,缺失株擴(kuò)增到909 bp的Kan基因,親本株不能擴(kuò)增到。陽(yáng)性擴(kuò)增片段測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示100%同源。表明HPS7的crp基因缺失株構(gòu)建成功。

M:DL2000 marker;A:UKD(crp上游片段+kan基因+crp下游片段);B:crp基因;C.Kan基因。A圖中,1:空白對(duì)照;2、4:HPS7;3:PKUKD;5～14:缺失株; B圖中,1:空白對(duì)照;2、4:HPS7;3:PKUKD;5～14:缺失株;C圖中,1:PKUKD;2～12:缺失株;13:HPS7;14:空白對(duì)照。

2.3 crp缺失株的生長(zhǎng)特性

在37 ℃下對(duì)HPS7和△crp菌株的生長(zhǎng)特性進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果2種菌株的生長(zhǎng)特性有顯著差異。與親本株HPS7相比,△crp的菌落明顯細(xì)小,生長(zhǎng)速度明顯緩慢(圖3、圖4)。表明crp基因?qū)Ω必i嗜血桿菌血清7型的生長(zhǎng)有明顯的影響。

圖3 副豬嗜血桿菌血清7型菌株(HPS7)和crp缺失株(△crp)的菌落形態(tài)

圖4 副豬嗜血桿菌血清7型菌株(HPS7)和crp缺失株(△crp)的生長(zhǎng)曲線

2.4 crp缺失株的自身凝集能力

與HPS7相比,△crp表現(xiàn)出自身凝集能力降低,HPS7凝集較快,△crp凝集較慢,60 h后,HPS7的OD600值明顯低于△crp(圖5),表明,crp基因的缺失對(duì)HPS7的自身凝集有影響。

圖5 副豬嗜血桿菌血清7型菌株(HPS7)和crp缺失株(△crp)的自凝集能力

2.5 crp缺失株的生物膜形成能力

比較HPS7和△crp在聚苯乙烯微滴板中形成生物膜的能力,進(jìn)行定量分析。肉眼可見(jiàn)△crp生物膜形成明顯比HPS7弱(圖6),溶解后,測(cè)定的OD630值比HPS7低(圖7)。結(jié)果表明crp基因在HPS7中的缺失降低了細(xì)菌形成生物膜的能力,crp基因與生物膜形成有關(guān)。

A:聚苯乙烯微滴板中形成的生物膜;B:OD630值。

圖7 豚鼠接種副豬嗜血桿菌血清7型菌株(HPS7)后發(fā)病死亡情況

2.6 crp缺失株對(duì)抗生素的抗性

HPS7及其crp缺失株△crp對(duì)不同藥物的敏感性差異見(jiàn)表2,crp基因缺失后,對(duì)不同藥物的敏感性差異較為明顯,對(duì)大部分藥物如頭孢噻呋、頭孢他啶、氨芐西林、替米考星、阿莫西林、青霉素G、慶大霉素、頭孢噻肟、痢特靈、鏈霉素、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、土霉素、氧氟沙星、恩諾沙星、左氟沙星、阿奇霉素、羅紅霉素抗性降低,敏感性增加(P<0.05);對(duì)少部分藥物如阿米卡星、氟苯尼考、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、紅霉素抗性增加,敏感性降低(P<0.05),表明crp基因?qū)λ幬锏拿舾行杂绊戄^大。

表2 副豬嗜血桿菌血清7型菌株(HPS7)、crp缺失株(△crp)藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.7 crp缺失株對(duì)豚鼠的感染

利用HPS7和△crp菌株對(duì)豚鼠致病力試驗(yàn)比較HPS7和△crp菌株的毒力差異,豚鼠感染試驗(yàn)發(fā)病死亡情況見(jiàn)表3。結(jié)果顯示,HPS7的1 ml 1.0×1011劑量組未發(fā)病,1 ml 1.0×1012劑量組有2只發(fā)病,感染2 h后出現(xiàn)了明顯的發(fā)病癥狀,如精神沉郁、被毛粗亂、震顫、卷縮、擠堆等癥狀,1 ml 1.0×1013劑量組5只均發(fā)病,感染9 h后出現(xiàn)了死亡,共死亡1只,1 ml 1.0×1014劑量組5只均發(fā)病,感染6 h后出現(xiàn)了死亡,共死亡3只。△crp的1 ml 1.0×1011、1.0×1012劑量組均未發(fā)病,1 ml 1.0×1013劑量組2只發(fā)病,未發(fā)生死亡,1 ml 1.0×1014劑量組5只均發(fā)病,死亡1只,△crp組發(fā)病癥狀明顯輕于HPS7組,對(duì)照組未出現(xiàn)任何癥狀(圖7)。剖檢發(fā)病死亡豚鼠發(fā)現(xiàn)其肝臟、肺臟出血,部分腹壁出血,腹腔內(nèi)有腹水、纖維素性滲出,程度不一(圖8)。肝、肺、心、脾、腎組織抹片觀察到短桿狀細(xì)菌,腦部未見(jiàn)細(xì)菌。各個(gè)臟器接種crp缺失株后培養(yǎng),肝、肺、心、脾、腎分離到與接種菌株一致的細(xì)菌,腦部沒(méi)有分離出與接種菌株一致的細(xì)菌。發(fā)病豚鼠病理切片顯示,肝臟出現(xiàn)不同程度的肝細(xì)胞水樣變性,肝細(xì)胞腫脹,淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),肺臟不同程度的出血,肺泡壁增厚,淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖9)。以上結(jié)果表明低劑量HPS7對(duì)豚鼠不致病,劑量越高致病力越強(qiáng),根據(jù)Reed-Munch法計(jì)算出HPS7的LD50為3.162×1013CFU,△crp的LD50大于1.0×1014CFU,△crp的毒力顯著低于HPS7。

圖8 接種副豬嗜血桿菌血清7型菌株(HPS7)后發(fā)病死亡豚鼠解剖情況

圖9 接種副豬嗜血桿菌血清7型菌株(HPS7)發(fā)病死亡豚鼠病理切片

表3 副豬嗜血桿菌血清7型菌株(HPS7)、crp缺失株(△crp)豚鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

副豬嗜血桿菌引起的豬格拉瑟病是危害最為嚴(yán)重也是防控難度最大的疫病之一,由于副豬嗜血桿菌血清型眾多,相互之間缺乏交叉保護(hù)力,且同一血清型不同毒株的毒力差異很大,其中血清7型被認(rèn)為是無(wú)毒力毒株,但是近年來(lái)我們不斷地從臨床典型發(fā)病甚至死亡病例中分離到血清7型HPS,分離出的比例越來(lái)越高,也是危害越來(lái)越嚴(yán)重的血清型,因此有必要重視血清7型。在前期研究中HPS7低劑量感染豚鼠,毒力較低,而在加大劑量感染時(shí),也能引起豚鼠發(fā)病死亡,血清7型也應(yīng)該是有毒力的,因此迫切需要研制出更加安全有效的血清7型弱毒株。

crp基因是系統(tǒng)調(diào)控因子之一,對(duì)環(huán)境適應(yīng)和毒力調(diào)節(jié)起著重要作用。副豬嗜血桿菌血清7型crp基因缺失后,生長(zhǎng)速度明顯慢于親本菌,生物膜形成能力明顯減弱,自凝速度減慢,表明crp基因在HPS的生長(zhǎng)特性中起重要作用,這與Jiang等[17]關(guān)于crp缺失對(duì)血清5型副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的生長(zhǎng)特性、生物膜、血清抗性均產(chǎn)生影響的報(bào)道一致。副豬嗜血桿菌crp基因缺失對(duì)不同抗生素的抗性影響不一致,crp基因缺失對(duì)大部分抗生素的抗性降低,敏感性增加。為進(jìn)一步了解crp基因與HPS致病性的關(guān)系,試驗(yàn)用豚鼠測(cè)定了親本株和缺失株的毒力,低劑量血清7型均是無(wú)毒力的,但在高劑量和超高劑量感染時(shí)血清7型親本株表現(xiàn)出毒力,缺失株毒力明顯減弱。高劑量組引起豚鼠急性死亡,發(fā)病死亡豚鼠表現(xiàn)出與仔豬副豬嗜血桿菌引起的豬格拉瑟病相似的臨床癥狀和病理變化,表明crp基因參與了HPS7的毒力調(diào)節(jié),毒力試驗(yàn)結(jié)果與Jiang等[18]2021年的報(bào)道相似,但也有差異,Jiang等用血清5型HPS標(biāo)準(zhǔn)株及其crp缺失株各接種10只Balb/C小鼠,親本株血清5型標(biāo)準(zhǔn)株接種小鼠2 d內(nèi)全部死亡,而crp缺失株接種小鼠觀察期內(nèi)全部存活,毒力完全消失,而本研究中HPS7的crp缺失株毒力有所降低,但還有一定的毒力。副豬嗜血桿菌的毒力因子極多,致病機(jī)理十分復(fù)雜,crp調(diào)節(jié)的機(jī)制也十分復(fù)雜,豚鼠和小鼠的敏感性也有差異,不同血清型,不同毒株crp基因缺失后,結(jié)果可能會(huì)有所不同,為了探究crp基因?qū)Σ煌逍秃筒煌局甓玖Φ挠绊?需要對(duì)更多的血清型和毒株進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了副豬嗜血桿菌血清7型臨床分離株HPS7的crp缺失株,crp基因缺失后,菌株生長(zhǎng)速度減慢,生物膜形成能力減弱,自身凝集能力降低,對(duì)大部分抗生素的抗性降低,對(duì)豚鼠的毒力降低,說(shuō)明crp基因?qū)Ω必i嗜血桿菌血清7型的生長(zhǎng)、抗藥性和毒力有明顯的影響。本結(jié)果為進(jìn)一步研究crp基因在副豬嗜血桿菌血清7型中的功能及篩選更加安全有效的副豬嗜血桿菌血清7型弱毒株提供參考。