王玉婷,白永鳳,陸軍,程穎,楊云飛,祝進(jìn)

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院三系,杭州 310058;2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬衢州醫(yī)院＆衢州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,浙江衢州 324000)

肛周感染是肛腸外科最常見的疾病之一,包括肛周膿腫和肛瘺。肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae, KP)是革蘭陰性桿菌,可在全身各部位引起一系列感染,是僅次于大腸埃希菌的肛周感染疾病條件致病菌。高毒力KP(hypervirulentKlebsiellapneumoniae, hvKP)是KP中的一類,易引起嚴(yán)重的侵襲性感染,且近年來更多的是與多重耐藥相結(jié)合,為臨床治療帶來了挑戰(zhàn)。Yu等[1]通過一項(xiàng)關(guān)于hvKP感染疾病的調(diào)查中發(fā)現(xiàn),hvKP可在肛周感染中檢出。Jeong等[2]報道了1例侵襲性KP肛周感染的臨床病例,預(yù)測其分離株可能為K1、K2血清型。近年來,關(guān)于KP分子特征的研究熱點(diǎn)集中在血流感染、肝膿腫等疾病中,對于肛周感染來源的KP相關(guān)研究較為少見。目前,全基因組測序(whole genome sequencing,WGS)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于病原菌的溯源和流行分析中[3]。本研究基于WGS技術(shù),通過對肛周感染患者標(biāo)本分離的KP進(jìn)行分子特征分析,以期探明其分子病原學(xué)和流行病學(xué)特征。

1 材料和方法

1.1菌株來源及流行病學(xué)資料 回顧性分析2018年1月至2022年6月衢州市人民醫(yī)院患者病歷,并從中篩選病灶KP分離株46株,嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第4版)[4]規(guī)定的方法分離培養(yǎng)和鑒定。納入標(biāo)準(zhǔn):所有患者經(jīng)體格檢查、磁共振或超聲檢查,均符合美國結(jié)直腸外科醫(yī)師協(xié)會2016版《肛周膿腫、肛瘺和直腸陰道瘺臨床診治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn):疑似污染菌株;合并肛周皮膚感染;發(fā)病前半年內(nèi)有抗生素、激素用藥史。納入的臨床病例資料顯示,患者年齡為(44.3±13.8)歲,以40～64歲男性為主(56.52%,26/46)。多數(shù)患者(19/46,41.30%)合并有糖尿病,部分患者(11/46,23.91%)出現(xiàn)發(fā)熱,80.43%(37/46)患者病程中出現(xiàn)CRP升高。另外,95.65%(44/46)患者進(jìn)行了手術(shù)治療,取得了較好的治療效果。

1.2試劑與儀器 DNA提取試劑盒QIAamp DNA Mini Kit(美囯Qiagen公司),K-B藥敏紙片(英國Oxoid公司),陰性菌藥敏板、MicroScan walkAway-96細(xì)菌鑒定藥敏分析儀(德國西門子公司),MALDI Biotyper質(zhì)譜鑒定儀(德國布魯克公司),NanoDrop100超微量分光光度計(美國賽默飛世爾公司)。

1.3菌株鑒定及藥敏試驗(yàn) 將所收集2018年1月至2022年6月衢州市人民醫(yī)院肛周感染患者KP菌株分離培養(yǎng)后,調(diào)整菌懸液至0.5麥?zhǔn)蠞岫?頭孢曲松、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星及頭孢他啶/阿維巴坦使用K-B藥敏紙片法進(jìn)行藥敏分析,使用MicroScan walkAway-96細(xì)菌鑒定藥敏分析儀對其他臨床常用抗菌藥物進(jìn)行藥敏分析。判斷標(biāo)準(zhǔn):替加環(huán)素結(jié)果參照美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)推薦標(biāo)準(zhǔn)[5],其他藥物參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(Clinical and laboratory standards institute,CLSI)2021年標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)控菌株:大腸埃希菌ATCC 25922,銅綠假單胞菌ATCC 27853。

1.4菌株DNA提取、測序和組裝 菌株基因組的DNA提取按照QIAamp DNA Mini Kit說明書操作,使用NanoDrop100超微量分光光度計測定基因組DNA的純度。全基因組測序委托杭州微數(shù)生物科技有限公司利用Illumin Hiseq2500平臺完成。在Linux系統(tǒng)中運(yùn)用shovill v0.9.0軟件進(jìn)行質(zhì)量控制和序列拼接,并得到拼接結(jié)果的contig文件,采用prokka v1.14.6軟件進(jìn)行基因組注釋,得到序列用于后期分析。

1.5全基因組分析 運(yùn)用MLST v2.23.0軟件將拼接后序列進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing,MLST),得到46株菌的ST型;利用Kleborate v0.2.0軟件進(jìn)行分子血清型、毒力基因篩選,并通過毒力、耐藥評分預(yù)測細(xì)菌毒力和耐藥水平,具體評分規(guī)則參考文獻(xiàn)[6];使用abricate v1.0.1軟件將基因組序列與NCBI數(shù)據(jù)庫對比,得到菌株的耐藥基因;將二代拼接序列導(dǎo)入Ridom SeqSphere+v6.0.0軟件,通過比對參照菌株K.pneumoniaesensulato基因組序列的2 358個核心基因,繪制最小生成樹(MST)來分析菌株親緣關(guān)系。

1.6數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計,計數(shù)資料均采用例數(shù)或百分比表示,分別使用在線網(wǎng)站iTol(http://itol2.embl.de/)繪制MST,Chiplot(https://www.chiplot.online/)制作熱圖,SPSSPRO(https://www.spsspro.com/)聚類分析。

2 結(jié)果

2.1藥物敏感性試驗(yàn) 在46株KP中,CRKP菌株占4.35%(2/46),ESBLs耐藥菌株占8.70%(4/46),全部KP對替加環(huán)素及多黏菌素敏感,其他臨床常用抗生素耐藥均小于25%。見表1。

表1 肛周感染疾病分離的46株KP的抗菌藥物耐藥率

2.2分子血清型的鑒定和MLST 基因組測序數(shù)據(jù)提示,46株KP分離株,基因組大小在5 200 454～5 953 516 bp之間,最大contig片段為1 482 322bp,contig數(shù)量最小為41。其中共檢出14種K血清型,另有6株KP血清型未檢出。其中K1血清型最多,占26.09%(12/46),其次為K2血清型(8/46,17.39%)。O抗原型和MLST分型分別檢測出6種和25種,其中分別以O(shè)1型(28/46,60.87%)、ST23型26.09%(12/46)為主。K1血清型菌株與ST23型菌株完全重合,并且均表達(dá)O1抗原血清型。見表2。

表2 46株肺炎克雷伯菌的分子血清型及MLST分型結(jié)果

2.3肺炎克雷伯菌cgMLST分型及MST Ridom SeqSphere+v6.0.0軟件將等位基因差異閾值為15的菌株定義為同一簇。在本研究中,46株KP經(jīng)cgMLST分析形成的MST圖顯示,任意兩菌株間等位基因最小差異為21個,均超出閾值(15個),菌株均沒有成簇,菌株之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。但相對于其他未成簇菌株,12株ST23型KP的等位基因差異相對較小,親緣相對關(guān)系較近。見圖1。

注:基于2 358個cgMLST靶基因的序列分析的等位基因圖譜。每個圓圈表示1個菌株,圓圈里的數(shù)字表示相應(yīng)菌株的編號,圓圈的顏色指示ST型。連接線上的數(shù)字表示具有不同等位基因的靶基因的數(shù)量。

2.4KP毒力基因及耐藥基因篩選 根據(jù)序列結(jié)果分析,在毒力基因中,有50%(23/46)KP菌株毒力評分≥4分,與鐵攝取相關(guān)的基因Aerobactin(iucA、iutA簇)、Salmochelin(iroB、iroN簇)、Yersiniabactin(ybtS簇)的檢出率分別為65.22%(30/46)、78.26%(36/46)及60.87%(28/46);基因毒素Colibactin共檢出16株(34.78%);黏性調(diào)節(jié)相關(guān)基因rmpADC(rmpA簇)檢出率為78.26%(36/46),rmpA2為56.52%(26/46)。大多數(shù)KP菌株耐藥評分為0分(39/46,84.78%),2株CRKP菌株均攜帶blaNDM-1,其中1株同時攜帶blaKPC-2;共檢出10株攜帶ESBLs 耐藥基因菌株,4株ESBLs耐藥菌株分別攜帶blaSHV-26、blaCTX-M-3、blaCTX-M-14及blaCTX-M-27基因,6株未出現(xiàn)耐藥表型。磷霉素耐藥基因fosA6檢測率最高,為73.91%(34/46),其他抗菌藥物耐藥基因檢出率均較低。在各菌株與毒力、耐藥基因的聚類分析中,可見46株KP可大體分為3簇,其中1簇為攜帶多毒力、少耐藥基因菌株,占大多數(shù)(80.43%,37/46)。具體見表3及圖2。

圖2 46株KP毒力基因及耐藥基因篩選結(jié)果熱譜圖

表3 46株KP毒力與耐藥基因結(jié)果分析

3 討論

肛周感染是指肛腺受到病原菌入侵而產(chǎn)生一系列癥狀的化膿性疾病,KP是其常見條件致病菌,可在機(jī)體免疫力下降時致病。本研究中,患者主要為男性,年齡(44.3±13.8)歲,與之前的研究報道基本相符[7]。此外,41.30%的KP感染患者伴有糖尿病,這與Liu等[8]報道一致,提示糖尿病可能是KP肛周感染的危險因素之一。

通過Kleborate及MLST軟件分析,本實(shí)驗(yàn)中KP優(yōu)勢菌株為O1K1-ST23 KP,46株菌以K1、K2血清型為主,主要流行克隆為ST23及ST65,與之前報道的肝膿腫等其他來源hvKP優(yōu)勢血清型及ST型相一致[9-10]。本研究基于cgMLST對46株KP親緣性關(guān)系進(jìn)行溯源,構(gòu)建的MST顯示主要KP分離株分為2大分支,其中1支全部為ST23型KP。在46株KP中,2株KP間等位基因差異均超出15個基因的閾值,提示菌株沒有成簇,親緣關(guān)系較遠(yuǎn),本地區(qū)KP菌株均為散發(fā),未出現(xiàn)特定菌株流行。

hvKP大多攜帶多種毒力基因,但尚無統(tǒng)一判斷標(biāo)準(zhǔn),基于基因序列的毒力水平預(yù)測是較為可靠的判斷方法。46株KP菌株中,半數(shù)被判定毒力評分≥4分。攝鐵因子相關(guān)基因Aerobactin、Salmochelin、Yersiniabactin及高黏液表型基因(rmpA、rmpA2)均有超過50%的檢測率。另有研究證實(shí),rmpA及Aerobactin是hvKP有價值的預(yù)測因子[11]。Colibactin在所有O1K1-ST23 KP、O1K2-ST65 KP中均有檢出,提示可能與ST型有一定的對應(yīng)性。此外,有14株KP分離株攜帶全部5種關(guān)鍵毒力基因,分別為11株ST23、2株ST65和1株ST268,毒力基因與高毒力ST型一致。毒力質(zhì)粒pLVKP是首次從hvKP CG43上分離得到的213 kb質(zhì)粒,可直接影響hvKP毒力,其組成包括rmpA2、rmpA、iucA、iutA及iroB等[12]。本實(shí)驗(yàn)毒力質(zhì)粒pLVKP 5種相關(guān)基因的組合類型中,rmpA+rmpA2+iucA+iutA+iroB基因組合檢出率最高(54.35%,25/46),提示大多KP菌株可能存在毒力質(zhì)粒pLVPK。目前,大量研究表明肝膿腫和血流感染是hvKP常見的感染類型。在衢州地區(qū)過去的研究中,對肝膿腫和血流感染的KP分離株均進(jìn)行了rmpA、iutA、iroN、ybtS基因檢測[13-14]。將本次結(jié)果與其比較可發(fā)現(xiàn),肛周感染KP分離株4種毒力基因檢出率與肝膿腫較為接近,比血流感染均相對更高。進(jìn)一步提示該KP菌株可能與肝膿腫及血流感染類似,有較大的傳播性和致病性。

目前臨床上抗菌藥物仍是該病治療的主要方法之一,本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果結(jié)合耐藥基因分析發(fā)現(xiàn),多數(shù)KP對臨床常用抗生素敏感。本實(shí)驗(yàn)中篩選出2株CRKP,其中1株同時攜帶blaNDM-1和blaKPC-2,但預(yù)測毒力水平較低。另1株不僅同時攜帶blaNDM-1和blaSHV-26,還檢出了rmpADC、rmpA2、Aerobactin及Salmochelin4種高毒力基因,提示高毒力伴高耐藥KP菌株在該院肛周感染患者中已經(jīng)開始出現(xiàn)。本次研究中還發(fā)現(xiàn)4株產(chǎn)ESBLs菌株各攜帶1個相關(guān)耐藥基因,但預(yù)測毒力水平較低。此外,本研究中磷霉素耐藥基因fosA6攜帶率最高,但有學(xué)者表明,fosA6是KP染色體主要的fosA亞型[15],而KP染色體固有fosA亞型不會導(dǎo)致對磷霉素耐藥。其他耐藥基因攜帶率與其耐藥表型較為一致。

綜上所述,本院KP相關(guān)肛周感染患者大多為中年男性,合并糖尿病者易感。其KP分離株大多攜帶大量毒力基因,預(yù)測具有高毒力水平,雖大多對常用抗生素敏感,但已開始出現(xiàn)攜帶高毒力CRKP菌株,若一旦播散,將對臨床是個極大的考驗(yàn)。因此,相關(guān)臨床科室應(yīng)提高重視程度,及早診斷和治療,進(jìn)一步加強(qiáng)監(jiān)測,防止hvKP在本地區(qū)流行,預(yù)防高毒力耐藥菌株的產(chǎn)生和播散。