秦飛,徐文飛,林曉玲,李崇山,蘇桂如

(泉州市兒童醫(yī)院消化內(nèi)科,福建泉州 362000)

消化性潰瘍(peptic ulcer,PU)是一種酸相關(guān)性疾病的消化道病變,多發(fā)生于胃或十二指腸近端等部位,胃黏膜脫落、缺損延伸至黏膜下層或固有肌層,對(duì)各個(gè)年齡段均有影響,具有較高的發(fā)病率和死亡率[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,HP)感染是PU的主要危險(xiǎn)因素,可誘發(fā)炎癥反應(yīng),進(jìn)一步加重胃黏膜損傷以及潰瘍[3-4]。因此,尋找與PU合并HP感染相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物有助于臨床盡早對(duì)患兒進(jìn)行治療,保障患兒的生命健康。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是炎癥和血管功能的關(guān)鍵介質(zhì)。LncRNA H19作為LncRNA的一種,可以進(jìn)行自噬調(diào)節(jié),激活炎癥途徑,與炎癥性疾病密切相關(guān)。有研究顯示,LncRNA H19高表達(dá)的HP感染患者患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)增大,其會(huì)通過增強(qiáng)炎癥反應(yīng),促進(jìn)HP感染的胃癌細(xì)胞增殖和遷移[5-6]。微小RNA-625-5p(miR-625-5p)是一種多功能miRNA,能夠抑制腫瘤發(fā)生,影響信號(hào)通路,改變炎癥反應(yīng),在哮喘等過敏性疾病中具有重要作用。亦有研究顯示,LncRNA H19與miR-625-5p存在靶向關(guān)系[7-8]。但在PU合并HP感染患兒中的相關(guān)研究較少,推測LncRNA H19和miR-625-5p可能參與了PU合并HP感染。本研究通過檢測PU合并HP感染患兒血清LncRNA H19和miR-625-5p的表達(dá)水平,分析對(duì)PU合并HP感染的診斷價(jià)值,以期為診斷PU合并HP感染提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 研究對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選取2021年2月至2023年2月在泉州市兒童醫(yī)院治療的160例PU患兒,年齡范圍為5～14歲。根據(jù)是否合并HP感染分為HP陽性組90例,陰性組70例。陽性組男性46例,女性44例,年齡(10.50±2.60)歲;陰性組男性37例,女性33例,年齡(11.20±2.70)歲;收集同期體檢健康兒童160例作為健康人對(duì)照組,其中男性80例,女性80例,年齡(10.80±2.65)歲,各組性別、年齡之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)患者符合PU相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[9];(2)經(jīng)14C-尿素呼氣試驗(yàn)檢測,判斷為HP感染[10];(3)未使用抑酸劑、抗生素和胃黏膜保護(hù)劑等藥物治療;(4)臨床資料完整,監(jiān)護(hù)人自愿簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)胃食管反流、嗜酸性粒細(xì)胞胃腸炎、消化道手術(shù)等其他胃腸道疾病;(2)有心、肝、腎等功能障礙或疾病者;(3)免疫系統(tǒng)和血液系統(tǒng)疾病者;(4)存在感染及其他炎性疾病。本研究經(jīng)患兒及健康兒童監(jiān)護(hù)人知情同意,且經(jīng)泉州市兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理文號(hào):2021012611)。

1.2方法

1.2.1樣本采集 所有患兒入院后24 h內(nèi)(健康人對(duì)照組為體檢當(dāng)日)采集空腹靜脈血3～4 mL,室溫靜置30 min,以800×g離心10 min進(jìn)行血清分離,并置于-20 ℃保存待測。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測血清LncRNA H19和miR-625-5p水平 按照Trizol試劑盒(貨號(hào):SH-2366,北京凱詩源生物科技有限公司)說明書對(duì)各組樣本總RNA進(jìn)行提取,并采用紫外分光光度法對(duì)總RNA濃度和純度進(jìn)行評(píng)估。按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào):PR2555,北京普非生物科技有限公司)說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系:總RNA 2 μL,RNase Free ddH2O 20 μL,PrimeScript RT Master Mix 4 μL。反轉(zhuǎn)錄條件:42 ℃反轉(zhuǎn)錄60 min,85 ℃滅活反轉(zhuǎn)錄酶5 min。LncRNA H19和miR-625-5p引物及U6、GAPDH內(nèi)參引物由廣州銳博生物公司設(shè)計(jì)并合成,引物序列見表1。以cDNA為模板,采用qRT-PCR試劑盒(貨號(hào):KT201,北京天根生化科技有限公司)檢測血清樣本中LncRNA H19和miR-625-5p的表達(dá)水平。PCR反應(yīng)體系:0.5 μL cDNA模板,5 μL ddH2O,正、反向引物各0.5 μL,6.5 μL 2×Taq PCR Master Mix。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性15 min;95 ℃變性15 s,65 ℃退火45 s,72 ℃延伸60 s,共40個(gè)循環(huán)。所有樣本重復(fù)3次。LncRNA H19以GAPDH為內(nèi)參照,miR-625-5p以U6為內(nèi)參照,使用2-ΔΔCt法計(jì)算二者的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3HP感染分型檢測 利用HP抗體分型檢測試劑盒(貨號(hào):YDLC-693,上海羽哚生物科技有限公司)檢測患者HP抗體類型,具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果判讀:(1)細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白(CagA)、空泡毒素相關(guān)蛋白(VacA)區(qū)帶中任意一種或兩種同時(shí)出現(xiàn),為Ⅰ型HP抗體陽性;(2)未見CagA和(或)VacA區(qū)帶,為Ⅱ型HP抗體陽性;其中HP感染Ⅰ型68例,HP感染Ⅱ型22例。

2 結(jié)果

2.1健康人對(duì)照組、HP陰性組、陽性組PU患兒血清LncRNA H19和miR-625-5p水平比較 與健康人對(duì)照組相比,HP陰性組、陽性組PU患兒血清LncRNA H19水平顯著升高(P<0.05),miR-625-5p水平顯著降低(P<0.05);陽性組較陰性組血清LncRNA H19水平升高更為明顯(P<0.05),而miR-625-5p水平降低更為顯著(P<0.05)。見表2。

表2 各組血清LncRNA H19和miR-625-5p水平比較

2.2不同分型HP感染PU患兒血清LncRNA H19和miR-625-5p水平比較 HP感染Ⅰ型、HP感染Ⅱ型患兒血清LncRNA H19水平分別為(1.84±0.24)和(1.63±0.20),miR-625-5p水平分別為(0.50±0.07)和(0.62±0.11)。與HP感染Ⅰ型相比,HP感染Ⅱ型PU患兒血清LncRNA H19水平顯著降低(t=3.705,P<0.05),miR-625-5p水平顯著升高(t=6.014,P<0.05)。

2.3PU合并HP感染患兒血清LncRNA H19和miR-625-5p水平的相關(guān)性 采用生物信息學(xué)在線網(wǎng)絡(luò)工具Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn/)分析預(yù)測LncRNA H19與miR-625-5p間存在結(jié)合位點(diǎn)(圖1)。Pearson相關(guān)性分析顯示,PU合并HP感染患兒血清LncRNA H19與miR-625-5p水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.536,P<0.05)。

圖1 LncRNA H19與miR-625-5p間的結(jié)合位點(diǎn)

2.4Logistic回歸分析LncRNA H19、miR-625-5p與PU患兒HP感染的關(guān)聯(lián) 以PU患兒HP感染情況為因變量,LncRNA H19、miR-625-5p為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),LncRNA H19是影響PU患兒HP感染的危險(xiǎn)因素(P<0.05),miR-625-5p是其保護(hù)因素(P<0.05)。見表3。

表3 Logistic回歸分析LncRNA H19、miR-625-5p與PU患兒HP感染的關(guān)聯(lián)

2.5LncRNA H19、miR-625-5p水平對(duì)PU患兒HP感染的診斷價(jià)值 ROC曲線顯示,LncRNA H19、miR-625-5p單獨(dú)及二者聯(lián)合診斷PU患兒HP感染的AUCROC分別為0.870、0.895和0.935,二者聯(lián)合均優(yōu)于其各自單獨(dú)診斷(Z二者聯(lián)合-LncRNA H19=1.991,P=0.023;Z二者聯(lián)合-miR-625-5p=1.707,P=0.044)。見表4和圖2。

圖2 LncRNA H19、miR-625-5p水平診斷PU患兒HP感染的ROC曲線

3 討論

PU具有慢性和復(fù)發(fā)性,臨床主要表現(xiàn)為上腹部疼痛、燒心、反酸,及時(shí)診斷和治療可最大限度地降低PU相關(guān)發(fā)病率和死亡率[11-12]。研究發(fā)現(xiàn),HP感染引發(fā)PU,介導(dǎo)免疫炎癥發(fā)生以及炎癥細(xì)胞因子的釋放,其可致強(qiáng)烈而復(fù)雜的宿主免疫反應(yīng),但不足以消除病原體,造成胃黏膜破環(huán),屏障功能損傷,嚴(yán)重者可能會(huì)發(fā)生出血、穿孔等并發(fā)癥,嚴(yán)重威脅患者的生命健康[13-15]。因此,尋找有助于診斷PU合并HP感染的因子,可以及時(shí)加以干預(yù),以便在臨床診療中對(duì)患兒進(jìn)行及時(shí)的治療。

LncRNA H19是一種參與發(fā)育調(diào)節(jié)的RNA,其通過影響HP感染相關(guān)信號(hào),傳導(dǎo)介質(zhì)促進(jìn)PU以及上皮屏障功能受損[16-17]。Mohamed等[18]研究發(fā)現(xiàn),HP感染相關(guān)的胃潰瘍患者LncRNA H19水平升高,對(duì)HP引起的PU的診斷具有較高的準(zhǔn)確性、特異性和敏感性。Zhang等[6]研究發(fā)現(xiàn),LncRNA H19在HP感染的胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),過表達(dá)LncRNA H19通過增強(qiáng)NF-κB誘導(dǎo)的炎癥,促進(jìn)HP感染誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。miR-625-5p作為miRNA的一種,能夠抑制NF-κB信號(hào)傳導(dǎo),表現(xiàn)出抗炎作用[19]。黃嵐等[20]研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)miR-625-5p水平可調(diào)控STAT3,減輕高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。Qian等[21]研究發(fā)現(xiàn),人類支氣管上皮細(xì)胞中miR-625-5p升高可減少IL-6和TNF-α的分泌,抑制哮喘氣道炎癥。本研究發(fā)現(xiàn),與健康人對(duì)照組相比,HP陰性組、陽性組PU患兒血清LncRNA H19水平依次顯著升高,miR-625-5p水平依次顯著降低。提示LncRNA H19、miR-625-5p與PU患兒HP感染具有一定的相關(guān)性。研究顯示,HP可分為Ⅰ型菌株[細(xì)胞毒素A(CagA)和(或)空泡毒素A(VacA)陽性]與Ⅱ型菌株(CagA和VacA陰性),前者具有較強(qiáng)致病性,為PU的主要致病菌株[22-24]。VacA菌株使胃黏膜細(xì)胞發(fā)生空泡樣變性,導(dǎo)致細(xì)胞間的緊密連接松弛,削弱胃黏膜的屏障功能,導(dǎo)致黏膜萎縮、糜爛、潰瘍。CagA菌株可刺激炎性因子產(chǎn)生,引起胃黏膜中性粒細(xì)胞浸潤,損傷胃黏膜,促進(jìn)PU的產(chǎn)生。本研究結(jié)果顯示,HP Ⅰ型菌株感染數(shù)高于Ⅱ型;與Ⅰ型菌株相比,Ⅱ型患兒血清LncRNA H19水平明顯降低,miR-625-5p水平明顯升高,說明LncRNA H19、miR-625-5p水平與PU患兒HP感染分型存在相關(guān)性,二者可用于分析PU患兒HP感染分型情況。

本研究還發(fā)現(xiàn),使用Starbase工具預(yù)測LncRNA H19與miR-625-5p間存在結(jié)合位點(diǎn),且PU合并HP感染患兒血清LncRNA H19與miR-625-5p水平呈負(fù)相關(guān)。提示LncRNA H19與miR-625-5p之間具有相互作用,可影響患兒HP感染情況,與既往研究相一致[8]。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn),LncRNA H19是影響PU患兒HP感染的危險(xiǎn)因素,miR-625-5p則是保護(hù)因素,提示二者可作為評(píng)估PU患兒HP感染的生物學(xué)標(biāo)志物,并可能作為臨床靶向治療PU患兒HP感染的靶點(diǎn)。筆者推測高水平的LncRNA H19通過負(fù)調(diào)控miR-625-5p,增強(qiáng)NF-κB誘導(dǎo)的炎癥,破壞上皮屏障功能,促進(jìn)HP感染。經(jīng)ROC曲線分析,LncRNA H19、miR-625-5p二者聯(lián)合診斷PU患兒HP感染的AUCROC為0.935,均優(yōu)于其各自單獨(dú)診斷,提示二者聯(lián)合對(duì)PU合并HP感染具有一定的診斷價(jià)值,臨床醫(yī)師可通過比較治療前后患兒LncRNA H19、miR-625-5p水平評(píng)估療效,對(duì)不接受胃鏡復(fù)查患兒有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述,PU合并HP感染患兒血清LncRNA H19水平升高,miR-625-5p水平降低,對(duì)PU合并HP感染具有一定的診斷價(jià)值。然而,仍需大量樣本對(duì)LncRNA H19和miR-625-5p在PU合并HP感染患兒中的臨床意義進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證,并需要通過細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及通過基因敲除或過表達(dá)方法進(jìn)一步探究二者在PU合并HP感染中的作用機(jī)制,為二者在臨床應(yīng)用中提供更充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。